Separação de células

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 Técnicas imunológicas utilizadas em investigação e diagnóstico 
Técnicas de Imunidade celular que permitem o estudo dos linfócitos e outras células 
I. Isolamento dos linfócitos e outras células = Fracionamente de PBMC (peripheral blood 
mononuclear cells) 
II. Caracterização da especificidade, frequência e função dos linfócitos 
 
 
 
 
 
I. Isolamento dos linfócitos e outras células = Fracionamento de PBMC 
 
 Etapas do Fracionamento: 
I. Centrifugação 
II. Separação Magnética 
III. Cromatografia de afinidade 
IV. Citometria de fluxo 
 FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorter 
 
I. CENTRIFUGAÇÃO: 
 
 Operação unitária para separação de duas fases (camadas separadas) duma mistura por ação da 
força centrifuga a que fica sujeita quando em movimento de rotação. 
I. Separação de diferentes fases: 
 Partículas insolúveis numa amostra sedimentam no fundo do tubo da centrífuga, 
restando o chamado sobrenadante (fase líquida) por cima do sedimento. 
 O sobrenadante é então aspirado ou decantado e o sedimento restirado do tubo. 
 Utilizada para a separação dos elementos figurados do sangue do plasma sanguíneo. 
As células são então depositadas no fundo do tubo e o plasma passa a poder ser 
separado e analisado. 
II. Centrifugação Diferencial: 
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 Técnica introduzida por Albert Claude em 1940 
 As partículas são separadas de acordo com a forma, densidade e tamanho e 
segundo passos com aumentos gradativos no tempo e na velocidade de 
centrifugação. 
 Utilizada na separação das células sanguíneas do plasma ( o plasma fica no cimo do 
tubo e as células sanguíneas, devido à sua maior densidade, depositam-se no fundo 
do tubo). 
 
III. Centrifugação em gradiente: 
 Técnica introduzida por N.G.Anderson e M.K.Braje em meados de 1950 
 Separação de partículas com base na sua massa e forma numa solução de 
densidade (de sacarose) e/ou concentração (de sais) crescente. 
 A amostra é colocada no cimo do tubo e durante a centrifugação migra de acordo 
com a sua velocidade e sediementação. 
Ex: gradiente de Ficoll-Hypaque 
 Os linfócitos humanos podem ser separados do sangue, através de 
uma centrifugação em gradiente de densidade sobre um tubo de 
centrífuga com uma mistura de Ficoll. 
 Ficoll: Polimeto de HC e metrizamida 
 Gradiente de Ficoll-Hypaque: mistura de soluções de concentrações 
progressivamente crecentes que se distribuem ao longo do tubo de 
centrifuga, ficando as soluções de maior densidade no fundo. 
 
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 Contagem das células: 
o Hemacitometro – Câmara de Neubauer: 
 Ex: 
 Nº de células contadas: 48 
 Volume de suspensão celular: 10ml 
 A suspensão inicial foi diluída 1:1 (0,1 ml suspensão + 0,1 ml de meio) 
antes da contagem. 
 Determinação do nº de células/ml 
o Utilizando o nº de células obtido (48 +/- 2), multiplicamos por 
1x104 (fator do hemacitometro) e por 2 (fator de diluição) 
 
 Determinação do nº de células total: 
o Multiplicamos o nº de células obtido pelo volume total (10ml): 
 
 
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Células coradas de azul não se contam: células mortas 
Só se contam as células posicionadas em cima de 2 traços para minimizar o erro 
 
II. SEPARAÇÃO MAGNÉTICA: 
 
 Método de isolamento de populações celulares pela utilização de AC monoclonais contra moléculas 
da superfície das células conjugadas com beads magnéticas (microesferas magnéticas associadas 
aos AC) 
 Procedimento: 
 Ac associados a beads magnéticas 
 As células com recetores para os AC magnetizados fcam retidas no campo magnético. 
 Retira-se o campo magnético e reservam-se as células (imunocomplexo) 
 As reações reversíveis do imunocomplexo podem ser quebradas através de uma variação do 
pH 
 
 
I. Separação Magnética direta: 
 O AC especifico está diretamente conjugado com a partícula magnética. 
 Permite uma separação mais rápida uma vez que requer um único passo de 
marcação. 
 Mais rápida mas mais cara 
 
II. Separação magnética indireta: 
 Usada quando não existem microbeads diretas. 
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 As células são marcadas com um AC primário (puro, biotinilado ou conjugado 
com fluorocromo). 
 Existe ainda a adição de um AC secundário (anti-Ig, anti-biotina, antifluorocromo 
ou conjugado com a estreptavidina) 
 É um método adequado para separar células com expressão reduzida do 
marcador em causa, uma vez que permite amplificar a marcação. 
 
III. Separação magnética positiva: 
 As células-alvo desejadas são magneticamente marcadas e retidas na coluna. 
Em seguida a coluna é retirada do magneto e as células alvo são eluídas com um 
tampão apropriado. 
 Vantagens: 
i. Rapidez 
ii. Excelente pureza 
iii. Enriquecimento de células raras 
iv. Viabilidade e função das células não são afetadas. 
 Resumo: o que quero isolar é o que está ligado ao AC e que fica retido no campo 
 
IV. Separação magnética por depleção magnetica: 
 O isolamento das células é feito por depleção de células não desejadas. 
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 As células não desejadas são marcadas magneticamente e eliminadas da mistura 
celular. 
 As células alvo estão contidas na fração não marcada. 
 Resumo: tudo o que não interessa está marcado e fica retido na coluna 
O que sai primeiro é o que eu quero. 
 Utilização: 
o Remoção de células indesejadas 
o Se não é desejável a ligação do AC às células alvo 
o Subsequente isolamento de uma subpopulação celular através de 
seleção positiva 
 
 
III. CROMATOGRAFIA: 
 
 Técnica mais utilizada para separação de proteínas 
 Consiste na passagem da proteína através de uma coluna (fase estacionaria) que é desenhada 
para reter ou diminuir a velocidade de passagem da fase móvel onde estão as macromoléculas 
(proteínas) 
 Baseia-se numa propriedade particular, como o tamanho, carga ou afinidade química. 
 
I. Cromatografia de Afinidade: 
 Esta técnica é utlizada para analisar um AC especifico a partir de um antissoro, 
através da união especifica dos AC ao AG imobilizado numa matriz sólida. 
 Na coluna existem AC com afinidade para o que eu quero isolar que se ligam 
após a colocação da solução na coluna. 
 Para retirar o que eu quero (ex.isoleucina 1) provoco uma variação de pH que 
provoca a desnaturação do imunocomplexo (reações reversíveis). 
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IV. CITOMETRIA DE FLUXO: 
 Metodologia topo de gama, permite caraterizar as células em vários parâmetros 
 Citometria: analise quantitativa de parâmetros celulares (células, núcleos, cromossomas, 
mitocôndrias, etc.) 
 Citometria de fluxo: analise multiparametrica de células (uma a uma) em suspensão através de 
ferramentas ópticas.. 
 Principio: 
o Passagem das partículas (células) em suspensa, de uma forma alinhada num fluxo contínuo, 
através de um feixe de luz (ex:laser) 
o Deteção de sinais gerados pela interação das partículas com o feixe de luz. Os sinais podem 
ser gerados por: 
 Light scatter: dispersão do feixe de luz 
 Intensidade de fluorescência: luz emitida por fluorocromos (ligados Às células) após 
excitação pelo feixe de luz. 
o Conversão dos sinais óticos em sinais eletrónicos pelos detetores 
o O computador analisa os sinais eletrónicos emitidos pelos detetores, transformando-os em 
gráficos, permitindo uma análise multivariada. 
o Resumo: 
Uma suspensão celular a caraterizar passa num tubo muito fina em fila indiana 
 Sobre cada célula incidem feixes de luz que nos vão dar determinadas informações 
 Feixes pelas extremidades das células (forward scatter- FSC) que nos dão 
informação acerca da dimensão da célula. 
 Feixes pelos organelos da célula (side scatter-SSC) que nos dão informação 
sobre a complexidade da célula ou granulosidade. 
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o Citometro de fluxo – componentes: 
 Fluídos: 
 Suspensão de partículas 
 Fluxo laminar 
 Injeção da amostra no líquido de envolvimento (“sheath fluid”), passando por 
um orifico central do fluxo (50-300Rm) 
 As partículas fluem no centro não se misturando com o restante líquido de 
envolvimento. 
 A amostra é injetada em fluxo laminar. 
 
 Ótica – foca o laser, capta e filtra s dispersão de luz e a emissão de fluorescência 
 Fonte de iluminação: produzem a uz que irradia as células 
o Lasers 
o Árgon ion, krypton ion, HeNe, HeCd, YAG, diodes 
o Lâmpadas de mercúrio 
 Camara de fluxo 
 Filtração da dispersão de luz e fluorescência 
 Captação da dispersão de luz e fluorescência 
 Sistemas de deteção: medem a luz que vem dos componentes das células 
o Detetores da dispersão da luz (light scatter) 
 Foto-sensor de dispersão frontal (FSC): 
 Capta a intensidade da luz dispersa frontalmente 
 A intensidade da dispersão frontal é proporcional ao 
tamanho das partículas. 
 
 
 
 
 
 
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 Foto-sensor de dispersão lateral (SSC) 
 Capta a intensidade da luz dispersa a 90º 
 A intensidade da dispersão é proporcional à 
granulosidade e forma das partículas. 
 
o Detetores da dispersão de fluorescencia (PMT) 
 A fluorescência emitida é detetada por foto-sensores que 
recebem o comprimento de onda selecionado 
 A especificidade da deteção de cada sensor é controlada 
pela seleção do comprimento de onda, através de uma 
conjugação de filtros e de espelhos. 
 
 Fluorescência: 
 O fluorocromo é uma molécula que emite fluorescência 
quando excitada com o comprimento de onda 
adequado. 
 O fluorocromo absorve a energia da luz incidente e 
liberta a energia absorvida por: 
o Vibração e dissipação de calor 
o Emissão de um fotão com um comprimento de 
onda maior (menos energético) 
 A intensidade da fluorescência emitida está 
diretamente relacionada com o numero de locais de 
ligação da molécula de reconhecimento. 
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o Tubos fotomultiplicadores (PMT) – medem a fluorescência emitida 
pelos componentes fluorescentes da célula, dando informação da 
ligação dos ACs marcados à célula e, desse modo, da expressão de 
proteínas a superfície da célula 
 
 Eletrónica: conversão do sinal ótico em eletrónico que envia para o computador para 
ser analisado. 
 Conversão das sinas em valores analógicos-digitais traduzidos num histograma 
ou dot plot. 
 
 Aquisição, processamento, análise e armazenamento no computador 
 Análise segundo a direção de dispersão da luz: 
 
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 Análise segundo a dispersão de fluorescência: 
o Um fluorocromo encontra-se ligado a um AC que vai reconhecer o 
recetor celular, para o qual é especifico, após incubação das células 
com esse AC. 
o A intensidade de fluorescência representa a quantidade desse 
componente (recetor de superfície, moléculas intra-celulares, DNA e 
RNA). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
- Intensidade de fluorescência 
(quantidade desse 
componente) 
- Percentagem de células que 
expressam um marcador 
- Percentagem de células que 
expressam um ou dois 
marcadores. 
-Correlação com 2 marcadores 
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 Informações obtidas por Citometria de Fluxo: 
o Tamanho (FSC) 
o Complexidade (SSC) 
o Fluorescencia relativa (FL1, FL2, FL3) 
o Analise multiparametrica complexa 
 
o Quantificação de células em suspensão 
o Separação de células vivas e células mortas 
 
o Quantificação de 105 a 107 partículas em aproximadamente 1 min. 
 
o Mede a dispersão de luz da partícula, a fluorescência inata bem como a fluorescência 
adquirida por ligação a um AC marcado com fluorocromo. 
 
o Separação das subpopulações de células para análise subsequente. 
 
 Áreas de aplicação da Citometria de fluxo: 
o Hematologia 
o Anatomia Patologica 
o Biologia Celular 
o Oncologia 
o Imunologia: 
 Separação de células sanguíneas 
 
 Diferenciação de sub-populações de linfócitos T 
 Diferenciação de linfócitos B 
 Diferenciação de células NK 
 Variações linfoproliferativas (idade, imunodeficiências, neoplasias, transplantes, 
doenças autoimunes, inflamações) 
 Fagocitose 
 Análise de monócitos 
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V. Fluorescence-activated cell sorter (FACS): 
 Instrumento que permite separar células com base na citometria de fluxo. 
 Separa as células com base nas propriedades medidas em fluxo, ao contrário da Citometria de fluxo 
que apenas mede essas propriedades. 
 Permite separar subpopulações de linfócitos com base nas diferentes proteínas expressas à superfície 
(ex: células B, células T CD4+, células T CD8+) 
 Cada tipo celular é marcado com um AC especifico que se encontra acoplado a um fluorocromo 
 O citometro de fluxo deteta e conta individualmente as células que passam através do laser 
 Os sinais gerados pelos detetores criam uma carga elétrica (+ ou -) no fluxo de células que, 
entretanto, é quebrado, gerando gotas constituídas por uma única célula. 
 As gotas, por terem carga elétrica, vão ser desviadas ao passarem por placas carregadas: 
o As gotas carregadas positivamente, são atraídas pela placa negativa e vice-versa, sendo 
assim separadas e conduzidas para os tubos de colheita respetivos. 
 As gotas carregadas (que não contêm células ou aquelas cujas células não cuprem os critérios pré-
selecionados de fluorescência e tamanho) são transferidas para um outro tubo de colheita. 
 
 
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II. Caraterização da especificade, frequência e função dos linfócitos: 
 
I. Componentes da Resposta Imunologica adaptativa (especifica de AGs): 
 
II. Avaliação de respostas de linfócitos específicos de AGs 
 Interesse: 
o Medir a eficiência com que um individuo responde a um determina AG 
o Medir o grau com que se estabeleceu uma memória imunológica especifica 
 Métodos: 
o Deteção da ativação de células de modo a exercerem uma função em particular (secreção 
de citoquinas, citotoxicidade). 
o Deteção direta das células através do seu recetor 
 
III. Determinação da frequência dos linfócitos específicos de AG 
 Métodos que detetam ativação das células: 
o Proliferação celular 
o Cultura de diluição limitante 
o ELISPOT 
o Deteção intracelular de citoquinas por citometria de fluxo 
o Captura de citoquinas por citometria de fluxo 
o Captura de citoquinas secretadas na superfície de células T vivas 
o Ensaios de citotoxicidade (para células T citotóxicas) 
 Métodos de deteção direta das células através do seu recetor: 
o Tetrâmeros de complexos MHC: péptido biotinilados conjugados com estreptavidina-
fluorocromo 
 Proliferação de Linfocitos: 
o Em resposta a AGs 
 Antigénios: induzem a mitose somente em linfócitos específicos para esse AG 
 Para que se produzam células efetoras (com determinada especificidade) em nº 
suficiente,os linfócitos específicos de AG têm de proliferar. 
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 As células T de ratinhos ou humanos imunizados com Ag A proliferam quando expostas 
ao Ag A juntamente com células apresentadoras de antigénio, mas tal não acontece 
quando expostas a Ag contra os quais não huve imunização (ex: Ag B) 
 Este ensaio, apesar de medir respostas de células T após imunização, revela pouco 
acerca das capacidades funcionais das células que respondem 
 
 É difícil detetar a proliferação de linfócitos em resposta a um Ag específico, uma vez 
que somente uma pequena porção de células são estimuladas a dividir-se 
 
o Em resposta a Mitogénios 
 Mitogénios policlonais: Substâncias que induzem a mitose em linfócitos de diferentes 
especificidades e origens clonais. São estímulos não específicos. 
 
 
o Métodos para avaliar a proliferação linfocitária: 
 Incorporação de timidina tritíada ([3H-timidina]: 
 Avaliada por contagens de cintilações por minuto num contador de radiação 
β 
 Ensaio baseado na capacidade das células em proliferação incorporarem 
timidina tritíada no seu ADN. 
 Procedimento: 
o As células são incubadas na presença de um estímulo apropriado 
o O processo de divisão celular, associado à duplicação do DNA, 
começa cerca de 48h depois. 
o A adição de timidina tritíada nessa altura vai permitir a incorporação 
de trítio radioativo no DNA das células em divisão 
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o Após 16-24h a cultura é terminada, as células são colhidas num 
aparelho automatic (“harvester”), ficando presas num filtro, enquanto 
a timidina não incorporada é removida por lavagens. 
o A radioatividade do filtro, correspondente à extensão de replicação 
de ADN e proliferação, é medida num contador de radiação 𝛽. 
 
 Incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU): 
 Avaliada por citometria de fluxo ou imunofluorescência. 
 Ensaio baseado na capacidade das células em proliferação incorporarem 
BrdU (análogo da timidina) no seu DNA. 
 Procedimento: 
o As células são incubadas com o estímulo apropriado (AG ou 
mitogénio) na presença de BrdU (nas ultimas horas de cultura) 
o No fim da cultura, as células são fixadas e marcadas com Ac anti-BrdU 
conjugado com um fluorocromo 
Para que o anti-BrdU tenha acesso ao DNA é necessário desnatura-lo 
por exemplo com uma DNAse 
o As células marcadas com anti-BdrU correspondem às células em 
proliferação 
o Os resultados podem ser avaliados por citometria de fluxo ou 
imunofluorescência. 
 Através de marcadores com Ac (conjugados com outros fluorocromos) 
dirigidos para marcadores da célula, é possível perceber quais as células que 
proliferaram. 
 
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 Marcação com CFSE (5,6 Carboxyfluoroscein Diacetate Succinimidyl Ester): 
 Avaliada por citometria de fluxo. 
 CFSE: corante fluorescente que não é prejudicial às células, após entrar nas 
células sofre clivagem do seu éster e difunde-se pelo citoplasma. 
- Á medida que as células se dividem, a molécula CFSE é repartida 
igualmente entre as células-filhas, resultando na sua diminuição de deteção 
do sinal CFSE. 
 
- Possui aplicações: 
 in vitro 
 in vivo: 
o colher células de um animal e marcá-las com 
CFSE. 
o Inocular células marcados no animal. 
o Colher células mais tarde e analisar quantas 
divisões celulares ocorreram num determinado 
espaço de tempo. 
 O sinal CFSE é avaliado por citometria de fluxo 
 A população inicial é a população com maior intensidade de fluorescência 
de CFSE. 
 Cada divisão celular (1-5) resulta numa redução de sinal. 
 Esta técnica dá informação da cinética da proliferação 
 É possível determinar o nº de divisões celulares e a frequência de células em 
cada divisão. 
 
 
 
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 ELISPOT ( medição da freq. De células T especificas): 
 Variante do ELISA em que ACs imobilizados em placas são usados para 
capturar citocinas secretadas por células T individuais. 
 Procedimento: 
o Estimulação das células T com o Ag de interesse. 
o Adição das células T estimuladas a poços de microplacas revestidos 
com AC para a citocina a ser medida. 
 As células T ativadas secretam citocinas que serão capturadas pelos 
AC imobilizados na placa. 
o Remoção das células após um período de tempo 
o Adição de um 2º AC anti-citocina marcado com uma enzima e, 
posteriormente do substrato para revelar o círculo de citocinas em 
volta da posição de cada célula T ativada (correspondente à 
formação de um “spot” colorido). 
o O cálculo da frequência de células T que secretam uma determinada 
citocina é feito contando cada spot e considerando o nº de células T 
inicialmente adicionado à placa. 
 
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 Desvantagens das técnicas de cultura de diluição limitante e ELISPOT: 
o Não avaliam o fenótipo das células 
o É difícil determinar se as células individuais são capazes de segregar diferentes citocinas 
simultaneamente. 
o Solução: 
 Técnicas com base na citometria de fluxo que permite detetar citocinas marcadas 
com fluorescência dentro das células T ativadas. 
 
 Métodos para avaliar o perfil de produção de citocinas a nível da célula individual: 
o Marcação intracelular de citocinas: 
 Para evitar a perda da associação entre as citocinas e a célula produtora, é usado 
um inibidor do transporte das citocinas para o exterior da célula, permitindo a 
acumulação das citocinas no reticulo endoplasmático. 
 As células são fixadas para manter as proteínas no interior das células e nas 
membranas celulares aquando da subsequente permeabilização. 
 As células são permeabilizadas para que os AC anti-citocinas marcados com 
fluorocromos possam entrar para o interior da célula. 
 As células podem também ser incubadas com os AC (marcados com outros 
fluorocromos) que se ligam a proteínas de superfície, o que permite avaliar que 
subpopulações de células T produzem uma ou mais citocinas. 
 As células são adquiridas num citómetro de fluxo. 
 
 Avaliação por citometria de fluxo: 
 Permite: 
o Definir a % de células produtoras de citocinas numa população 
o Caraterizar fenotipicamente a célula produtora da citocina 
o Estudar a produção simultânea de várias citocinas. 
 Desvantagens da marcação intracelular de citocinas: 
 As células têm de ser mortas (fixadas) e permeabilizadas com detergentes 
para que seja possível a deteção de citocinas 
 Solução: 
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o Técnica de captura, na superfície de células T vivas, de citocinas 
secretadas marcadas. 
 
o Captura de citocinas (ensaio de secreção de citocinas) 
 Permite analisar as células produtoras de citocinas se as matar 
 As células T ativadas são incubadas com ACs híbridos (em que 
os dois sítios de ligação ao AG reconhecen diferentes ligandos 
– um marcador especifico da célula T e a citocina em questão). 
 Se a célula T produz uma determinada citocina, esta é 
capturada antes de se difundir para fora da superfície da 
célula. 
 A deteção da citocina produzida é feita com um segundo AC 
anti-citocina marcado com um fluorocromo 
 
 Existe a possibilidade de isolar as células secretoras de citocinas 
 Marcação das células com AC anti-fluorocromo 
conjugado com microbeads magnéticas. 
 Separação magnética das c+elulas secretoras das 
citocinas. 
 Ensaios de citotoxicidade: 
o Ensaios com base na morte de células-alvo causada por células Tc (células T CD8+ ativadas)o Ensaio de libertação de 51Cr: 
 Incubação das células-alvo com cromato de sódio marcado radioactivamente. 
 Adição de células T citotóxicas provocando a morte de células-alvo que, assim, 
libertam 51Cr. 
 As células vivas não libertam 51Cr 
 Medição de 51Cr nos sobrenadantes das co-culturas de células T citotóxicas: células-
alvo.