Questionário- Transporte Vesicular

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Transporte vesicular
Uma grande variedade de toxinas protéicas, como a toxina bacteriana de Pseudomonas e a toxina Shiga, assim como a toxina vegetal rícino, são proteínas heteroméricas que consistem de subunidades A e B. A subunidade A é catalítica. Para a toxina Shiga, a causa mais comum de contaminação de alimentos (hambúrguer contaminado por bactérias), a subunidade A, é uma N-glicosidase e especificamente cliva o RNA ribossomal 28S, dessa forma intoxicando as células através da inibição da síntese de proteínas. Incrivelmente, uma única molécula de subunidade A, quando introduzida no citosol, é suficiente para matar uma célula. Interessantemente, a subunidade A da toxina Shiga é transferida para o citosol à partir da luz do retículo endoplasmático (ER) pelo translocon Sec61. A subunidade B, por sua vez, direciona a toxina Shiga para o ER através da sua ligação com um glicolipídeo GM3 na superfície celular, e atua como o receptor de internalização da toxina Shiga. A toxina Shiga é internalizada nos endossomos, indo então dos endossomos para o complexo de Golgi e do complexo de Golgi para o ER, onde as subunidades A e B se dissociam, permitindo que a subunidade A seja translocada para o citosol.
Numa série de experimentos desenvolvidos para caracterizar os mecanismos comparativos de transferência das toxinas de Pseudomonas e Shiga, do complexo de Golgi para o ER, cientistas primeiro seqüenciaram as respectivas subunidades de direcionamento. Os 24 aminoácidos do terminal-C das subunidades B das toxinas de Pseudomonas e Shiga estão mostrados abaixo:
24 aminoácidos do terminal-C da subunidade B da toxina de Pseudomonas
KEQAISALPD YASQPGKPPR KDEL
24 aminoácidos do terminal-C da subunidade B da toxina de Shiga
TGMTVTIKTN ACHNGGGFSE VIFR
Através da análise dessas sequências, qual é o provável receptor de direcionamento para a transferência das toxinas de Pseudomonas do aparato de Golgi para o ER?
Para testar esta predição diretamente, cientistas experimentalmente caracterizaram o papel de proteínas envoltórias do tipo COPI e receptores KDEL na intoxicação. Para tanto, células de macaco foram microinjetadas com anticorpos direcionados contra proteínas COPI ou o domínio citosólico dos receptores KDEL. As células foram então incubadas com toxinas de Pseudomonas ou Shiga por 4h. A síntese de proteínas foi determinada através de uma marcação de 30 minutos com metionina radioativa (metionina[35S]). Os resultados estão mostrados na figura abaixo, com os controles mostrando o baixo nível de síntese de proteína causado pela incubação com as toxinas.
Como estes resultados suportam suas predições baseadas em sequência e o papel conhecido da proteína envoltória COPI no transporte retrógrado? Você seria capaz de formular uma hipótese de como a toxina de Shiga é transportada do complexo de Golgi para o ER?
Para explorar ainda mais se a transferência da toxina de Shiga do complexo de Golgi para o ER depende ou não de proteínas envoltórias do tipo COPI, cientistas prepararam duas subunidades B, cada uma conjugada com um corante fluorescente diferente, e então observaram por microscopia de fluorescência o transporte das subunidades B do complexo de Golgi para o ER. O primeiro preparado era composto da subunidade B normal (wild type – tipo selvagem) conjugada com Cy3. O segundo preparado era composto de uma subunidade B modificada, na qual o terminal-C foi aumentado em quatro aminoácidos de acordo com a sequência KDEL. A proteína modificada foi chamada de B-KDEL. As células foram microinjetadas com anticorpos direcionados contra as proteínas COPI. Após a microinjeção, as células foram incubadas com a subunidade B fluorescente por vários tempos e a distribuição da subunidade B na célula foi avaliada. Os resultados são mostrados na figura abaixo.
Qual evidência esses resultados fornecem contra ou à favor do transporte da subunidade B normal da toxina de Shiga do Golgi para o ER nas vesículas recobertas por COPI? Qual a importância desses resultados com B-KDEL na interpretação de todos os resultados do experimento?