Eletroforese da PCR em gel de agarose

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Biomedicina 2ª série
Prática: Eletroforese da PCR em gel de agarose
PORTO ALEGRE, MAIO DE 2017
1. Calcule a quantidade de agarose (em g) necessária para confeccionar 350ml de gel de agarose 2% (massa/volume):
2 g ---------- 100 mL
 x ---------- 350 mL
 x= 7g\mL
Para confeccionar 350 mL de gel de agarose 2% é necessário 7g de agarose.
2. Que volume de TBE 5X você precisa utilizar para preparar 1L de uma solução de TBE 1X, ou seja, concentração de uso normal?
C1.V1 = C2.V2
5X. V1 = 1X. 1L
V= 200 mL
É necessário 200 mL de TBE 5X.
3. Qual a finalidade da utilização do tampão de migração?
Uma solução tampão é composta por um aceptor e um doador de prótons. Por isso, permite o fluxo de elétrons, influenciando na migração do DNA.
4. Por que se utiliza brometo de etídio ou GelRed na confecção do gel de agarose? O que ocorre na presença de DNA na amostra aplicada no gel? 
O método mais usual para se visualizar o DNA em géis de agarose é por coloração com brometo de etídeo. Esse corante se intercala entre as bases dos ácidos nucléicos e, na presença de luz Ultra Violeta, fluoresce em vermelho alaranjado.
5. Qual é o princípio básico da técnica de eletroforese? 
O princípio é baseado no fato da molécula de DNA possuir carga negativa em valores de pH neutro ou alcalino e consequentemente, quando aplicado ou imerso em uma matriz de gel submetida a um campo elétrico, migra em direção ao pólo positivo (anôdo). A velocidade da migração depende do tamanho da molécula. Por isso em um dado momento da eletroforese moléculas de tamanhos distintos se encontram em diferentes pontos da matriz.
6. Quais são os dois principais tipos de géis (suportes) utilizados para a eletroforese de ácidos nucléicos? Faça um quadro comparando os dois tipos de géis, utilize critérios como praticidade de confecção do gel, tipo de cuba utilizado, tamanho dos fragmentos de DNA para separação, na elaboração do quadro. 
	
	AGAROSE
	ACRILAMIDA
	Separação de fragmentos
	Diferença superior a 20 pares de bases
	Diferença inferior a 20 pares de bases
	Confecção do gel
	Mistura de um tampão e agarose. Não apresenta toxicidade.
	Requer mais cautela na sua preparação, em solução é neurotóxica. Requer a mistura de componentes adicionais à poliacrilamida.
	Cuba utilizada
	Cuba horizontal
	Cuba vertical
7. Desenhe esquematicamente o resultado da PCR visualizado no gel e descreva quais são as conclusões possíveis a partir destes resultados. 
8. Você visualizou banda no controle negativo? O que isso significa?
Não visualizamos bandas no controle negativo, que é nosso indicador de contaminação na amostra. Portanto, a amostra não estava contaminada.
Perguntas desafio:
1. Após a realização da eletroforese para conferir o resultado de uma PCR você não visualiza nenhuma banda, nem mesmo a do marcador de peso molecular. O que pode ter ocorrido?
Problemas com o banho de brometo de etídeo e com a coloração do gel com GelRed estão entre as possíveis causas da não visualização das bandas.
 2. Enquanto você estava adicionando as amostras nos “pocinhos” do gel de agarose, após misturá-las com o tampão de migração (azul de bromofenol), as amostras subiam e se difundiam no tampão da cuba de eletroforese. Como esse problema pode ser resolvido?
Podemos introduzir a ponteiro no centro do poço com uma profundidade médica, e depois pipetar lentamente a amostra para que ela permaneça dentro do poço. Também podemos ajustar o volume de amostra que se está adicionando no gel de agarose.
REFERÊNCIAS:
Ciência News. Análise de DNA em eletroforese. Disponível em http://www.ciencianews.com.br/index.php/ciencia/biologia-molecular/biologia-molecular-tecnicas-moleculares/. Acesso em 28 de maio de 2017.