Técnicas de biológia molecular aplicadas na medicina veterinária

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Iandra Carine Teixeira Ramos Silvério
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS NA MEDICINA VETERINÁRIA
PALMAS
2017
Iandra Carine Teixeira Ramos Silvério
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADAS NA MEDICINA VETERINÁRIA
Trabalho apresentado ao Centro Universitário Luterano de Palmas – ULBRA, com o requisito parcial para a obtenção notas da disciplina de Genética Aplicada as Ciências Agrarias da Graduação do curso de Medicina Veterinária sob a orientação da prof.(o) Luiz Fernando Albarello Gellen.
PALMAS
2017
SUMÁRIO
 INTRODUÇÃO ----------------------------------------------------------------------4
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE ------------------------------------5
PCR na Medicina Veterinária ------------------------------------------------5
REAÇÃO DA TRANSCRIPTASE REVERSA --------------------------------6
Reação da Transcriptase reversa na Medicina Veterinária ----------7
PCR EM TEMPO REAL -----------------------------------------------------------7
PCR em Tempo Real na Medicina Veterinária --------------------------8
 RAPD ----------------------------------------------------------------------------------8
5.1. RAPD na Medicina Veterinária -------------------------------------------------9
6. RFLP ------------------------------------------------------------------------------------9
6.1. RFLP na Medicina Veterinária ------------------------------------------------10
7. SEQUENCIAMENTO DE DNA --------------------------------------------------11
8. TECNICA DE BLOT ----------------------------------------------------------------11
8.1. SOUTHERN BLOTTING --------------------------------------------------------12
8.2. NORTHERN BLOTTING --------------------------------------------------------12
8.3. Técnicas de BLOT na Medicina Veterinária -------------------------------13
9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS --------------------------------------------14
INTRODUÇÃO
A Biologia Molecular é a biologia que estuda as interações bioquímicas celulares envolvidas na duplicação do material genético e na síntese de proteínas.
É uma área muito ligada a genética e a bioquímica, e consiste principalmente em estudar as interações dos vários sistemas das células, partindo da relação entre o DNA, RNA e a síntese de proteínas, e o modo como essas interações são reguladas.
Na Medicina Veterinária, a Biologia Molecular é utilizada principalmente no diagnóstico antecipado de algumas doenças parasitárias e infecciosas, desenvolvimento de vacinas e terapêutica, terapia gênica, genética da resistência a doenças, genotipagem de patógenos, e etc. Sendo realizados com algumas das várias técnicas de Biologia Molecular existentes, exemplos como, a técnica da PCR, Eletroforese de DNA e proteínas, sequenciamento de DNA, digestão de DNA e clonagem gênica.
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE 
A reação em cadeia da polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) é uma técnica de biologia molecular revolucionária, pois permitiu o rápido desenvolvimento do estudo de sequências de ácidos nucléicos, proporcionando com isso grandes avanços em diversas áreas como, por exemplo, medicina forense, genética, sequenciamento do genoma humano e microbiano e diagnóstico de doenças de infecciosas (MOLINA; TOBO, 2004). 
A PCR consiste na síntese enzimática in vitro de cópias de fragmentos específicos de ácidos nucleicos, onde a partir de uma única molécula de DNA molde, é possível gerar até cem bilhões de moléculas similares em uma reação (SAIKI et al., 1988; MULLIS; FALOONA, 1987; MULLIS, 1990). 
A técnica de PCR promove, por meio de etapas de variação de temperatura, a duplicação de cadeias de DNA in vitro. A reação envolve o emprego dos quatro deoxinucleotídeos (dNTPs) do DNA (A-T-C-G), sequências de iniciadores específicos ou primers, uma DNA polimerase termoestável, o DNA molde - previamente extraído da amostra clínica suspeita, cloreto de magnésio (MgCl2) - um cofator para atividade da Taq DNA polimerase, um tampão, geralmente cloreto de potássio (KCl), para manter pH e condição adequada para atividade enzimática e água ultrapura, como diluente. 
Segundo Erlich (1995), a técnica consiste basicamente em três etapas: a dupla fita de DNA é desnaturada pelo calor; em seguida, cada anela a uma das fitas simples do DNA e após, ocorre o processo de extensão e polimerização da fita, a partir da adição de nucleotídeos e ação da Taq DNA polimerase.
PCR NA VETERINÁRIA
A PCR não é uma técnica muito utilizada na Medicina Veterinária, por causa de seu elevado custo. Pode ser utilizada para detecção de genes de doenças em cães, tanto hereditárias quanto parasitárias ou infecciosas, diagnosticando assim, a doença antes da aparição dos sintomas clínicos.
Um exemplo de uso dessa técnica na veterinária é no exame de detecção de cinomose, que é uma doença infecciosa, de difícil diagnóstico, já que em sua fase inicial se parece muito com outras doenças. Ela acomete cães, canídeos silvestres (Família Canidae) e integrantes da Família Mustelidae (Furões e Ferrets), Mephitidae e Procyonidae, tendo como detector mais eficaz, a técnica da PCR.
REAÇÃO DA TRANSCRIPTASE REVERSA
A RT-PCR é uma reação da Transcriptase Reversa seguida de uma PCR. Ela difere da PCR comum por não utilizar uma cadeia dupla de DNA e sim uma cadeia simples de RNA. Essa técnica é utilizada para a Análises de expressão gênica uma vez que analisa o RNA responsável pela síntese de proteínas. Se há uma proteína específica, é porque há DNA sendo expresso e originando mRNA para tal proteína. É também utilizado para a Detecção de retrovírus.
Vamos entender então passo a passo da RT-PCR:
1º Passo: Síntese de cDNA (DNA complementar ao mRNA) pela Transcriptase Reversa. A Transcriptase Reversa utiliza o RNA como molde para produzir um cDNA. O iniciador (primer) utilizado pela enzima é uma sequência de timinas (T), complementar à cauda poli-A presente em mRNA eucariotos.
2º Passo: Degradação do mRNA por RNAse. Por que acontece isso? Pois a molécula de RNA é muito vulnerável, logo é mais garantido armazenar a informação do mRNA na forma de cDNA.
3º Passo: Amplificação do cDNA por PCR. Aqui acontecem todos os passos como já explicado no nosso outro post sobre PCR.
Podemos ter um amplificação total usando um primer poli-T e vários oligonucleotídeos (6 a 9 nt) que anelam aleatoriamente nas sequências de cDNA ou uma amplificação específica utilizando um par de primers especificamente designado para amplificar o mRNA (o cDNA deste mRNA) de interesse.
REAÇÃO DA TRANSCRIPTASE REVERSA NA VETERINÁRIA
A transcrição reversa, seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR), é uma técnica molecular utilizada com o objetivo de identificação precoce do CDV em cães com sinais clínicos da infecção. Esse método de diagnóstico ante mortem apresenta taxas de sensibilidade e de especificidade elevadas. Entretanto, a RT-PCR pode apresentar resultados falso-negativos, destacando-se o método de extração do ácido nucléico e a seleção do material biológico a ser utilizado para o diagnóstico (Frisk et al., 1999; Gebara et al., 2004a; Negrão et al., 2006).
PCR EM TEMPO REAL 
A PCR em tempo real (Real-Time PCR), é um método semi-quantitativo (qPCR), muito sensível e permite obter resultado em um curto período de tempo. A tecnologia está distribuída mundialmente, suprindo a necessidade na área médica de se ter um teste diagnóstico eficiente e rápido. Atualmente existem protocolos e kits comerciais para identificar uma grande quantidade de patógenos com importância médica. A técnica permite a detecção direta dos produtos da PCR durante a fase exponencial da reação, combinando amplificação e detecção em um só passo (REGITANO et al., 2007) 
A PCR em tempo real requer uma plataforma de instrumentação que contém um termociclador acoplado a um sistema ótico para a excitação e captura da emissão da fluorescência, além de um computador para aquisição de resultados eanálise final da reação (NOVAIS; PIRES, 2004). Várias tecnologias de PCR em tempo real estão disponíveis no mercado. Os dois sistemas mais usados são o SYBR Green® e o TaqMan® (KAEDA; CHASE; GOLDAN, 2002). A técnica de PCR em tempo real é baseada em duas descobertas importantes: a primeira é a atividade exonuclease 5’-3’ da enzima Taq DNA polimerase e a segunda é a construção de sondas de oligonucletídeos duplamente marcadas. As sondas emitem sinal de fluorescência somente quando clivadas (REGITANO et al., 2007).
PCR EM TEMPO REAL NA MEDICINA VETERINÁRIA 
Vantagem: 
Monitoramento da carga parasitária: quantificação da expressão gênica em diferentes amostras biológicas.
Detecção rápida da Leishmania: graças à amplificação e à detecção simultâneas dos produtos a cada ciclo realizado, a PCR Real Time representa uma significativa redução de tempo na realização nos testes moleculares.
Especificidade: no PCR Real Time para Leishmania, é utilizado material genético específico desse parasita, garantindo que apenas material genético de Leishmania seja alvo da reação.
Sensibilidade: a seleção da sequência alvo determina a sensibilidade e a especificidade do teste. Uma maior sensibilidade é atingida quando sequências de DNA presentes em cópias múltiplas são utilizadas, como, por exemplo, a região conservada dos mini círculos de DNA do Cinetoplasto (kDNA). O kDNA apresenta cerca de 10.000 mini círculos de DNA distribuídos em uma região conservada e uma região variável. Iniciadores específicos para amplificar esta região conservada são úteis na detecção de todas as espécies de Leishmania, enquanto aqueles direcionados para a região variável permitem a diferenciação de cada espécie ou complexo de espécies existentes. Tais particularidades fornecem maior eficiência à reação e, consequentemente, ao diagnóstico e monitoramento durante a terapêutica da leishmaniose.
RAPD 
O “DNA polimórfico amplificado ao acaso”, ou RAPD, tem como princípio à amplificação pela PCR de regiões aleatórias do DNA. Ou seja, não é preciso ter qualquer informação prévia sobre a região a ser amplificada. A estratégia consiste na utilização de primers decâmeros (compostos por dez nucleotídeos) cujas sequências foram geradas aleatoriamente. Quando as amostras de DNA são submetidas à PCR, os primers se anelam às regiões do DNA molde que sejam complementares. Estes primers serão fundamentais para a síntese de uma nova fita de DNA, uma vez a enzima polimerase necessita de ao menos um segmento de DNA dupla fita para iniciar o processo de replicação. Ao final da reação, são amplificadas bilhões de cópias das regiões que os primers flanquearam. Temperaturas de anelamento baixas são utilizadas propositalmente, a fim de reduzir a estringência (especificidade). Após a PCR, as amostras são aplicadas em géis de poliacrilamida e submetidas a um campo elétrico (eletroforese). A molécula de DNA possui carga negativa, devido aos grupamentos fosfato em sua estrutura e, portanto, as amostras devem ser aplicadas no gel próximas ao polo negativo. Quando a corrente elétrica é ligada, as amostras são repelidas pelas cargas negativas e atraídas pelas cargas positivas. Os fragmentos com menor tamanho (isto é, regiões com menor quantidade de pares de bases amplificadas) passam mais rapidamente pela malha do gel e, portanto, distanciam-se mais da origem. A análise dos géis de RAPD consiste na comparação de todas as regiões genômicas amplificadas (bandas no gel) dos diferentes indivíduos testados. Bandas de mesmo tamanho (mesma distância percorrida) são consideradas como alelos pertencentes ao mesmo locus (um dos pressupostos da técnica), ou seja, a comparação é feita observando-se a presença ou ausência de bandas dispostas em uma mesma linha horizontal. O polimorfismo genético é interpretado de maneira binária. À presença de produto amplificado (bandas) para um determinado locus se confere a designação “1” (presença de banda), enquanto que a ausência de bandas receberá designação “0”.
RAPD NA MEDICINA VETERINÁRIA
O polimorfismo genético detectado por marcadores RAPD tem natureza binária, isto é, o segmento amplificado (banda no gel) está presente ou ausente. A técnica de RAPD permite gerar uma grande quantidade de polimorfismos de segmentos de DNA distribuídos por todo o genoma do organismo (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1995) e está sendo utilizada na análise de diferentes espécies de bovinos, suínos, caprinos, cães, camundongos e aves (LEE e CHANG, 1994).
RFLP 
O polimorfismo de tamanho dos fragmentos de restrição, ou RFLP (sua sigla em inglês), é uma técnica relativamente simples e de baixo custo que, ao contrário do RAPD, consiste na amplificação pela PCR de uma região do DNA conhecida e subsequente corte. Utilizando-se um par de primers complementares a sítios específicos do DNA, amplifica-se a região-alvo. Posteriormente, as cópias desta região-alvo são digeridas por enzimas extraídas de bactérias chamadas endonucleases de restrição. Essas endonucleases reconhecem e cortam sítios específicos (normalmente de quatro a seis pares de base) da região-alvo, gerando fragmentos que podem ser separados por tamanho após eletroforese em gel de agarose (ou poliacrilamida). Milhares de endonucleases de restrição já foram isoladas e maiores informações a respeito destas enzimas podem ser encontradas na base de dados REBASE. Mas como é possível uma enzima digerir regiões homólogas do DNA de diferentes Técnicas moleculares aplicadas à sistemática e ao controle vetorial Figura 13.4. A técnica de RAPD é considerada dominante, pois não há como diferenciar os fenótipos de bandas do homozigoto dominante (++) e do heterozigoto (+-). O homozigoto recessivo (--) não apresentará nenhuma banda. Nos géis (fenótipo), à esquerda o padrão de tamanho das bandas e à direita o fragmento. 249 Voltar ao Sumário espécies e gerar fragmentos de tamanhos distintos? Isto se deve aos eventos de mutação que podem ocorrer nos sítios de clivagem das enzimas de restrição. (Figura 13.5). Este método pode ser aplicá- vel na detecção de espécies (taxonomia alfa), mas seu uso deve ser evitado em estudos populacionais e filogenéticos. O problema do seu uso em estudos populacionais é que as sequências de indivíduos da mesma espécie serão muito parecidas (ou mesmo idênticas) entre si, inclusive nos sítios de clivagem reconhecidos pelas endonucleases. Isso comprometerá a detecção de variabilidade. Já no caso de estudos filogenéticos, o problema deve-se a limitação de se usar padrões fenotípicos de bandas em um gel para inferir o grau de parentesco entre espécies.
RFLP NA MEDICINA VETERINÁRIA
Técnicas de biologia molecular, que utilizam o DNA, oferecem a possibilidade de detectar ingredientes de origem animal em alimentos e identificar de quais espécies são originários. Em relação à carne, esse método é eficaz tanto em matéria crua, como também em produtos fermentados, cozidos ou autoclavados. A metodologia da Reação em Cadeia da Polimerase associada com o Polimorfismo de Fragmentos de DNA (PCR-RFLP) tem sido amplamente utilizada para a diferenciação espécie específica, pois um único par de primers produz um fragmento que pode identificar múltiplas espécies por meio da utilização de enzimas de restrição apropriadas. Essa característica faz desta uma técnica de boa aplicabilidade e com custo mais baixo quando comparada a outras técnicas moleculares (Lockley e Bardsley, 2000; Ballin et al., 2009; Kesmlen et al., 2009; Bottero e Dalmasso, 2010).
SEQUENCIAMENTO DE DNA 
Esta técnica pode ser considerada como a mais informativa para estudos em sistemática molecular. Por utilizar como matéria-prima o conteúdo genético propriamente dito, os nucleotídeos, o sequenciamento de DNA é objetivo e aplicável em qualquer nível taxonômico, desde que se escolha a região gênica adequada. No genoma animal é possível encontrar mais de 1011 pares de nucleotídeos, que podem constituir regiões mais conservadas entre as espécies (i.e. codificam proteínas essenciais à sobrevivência do organismo) ou menos conservadas. Existemdois genomas distintos: o nuclear (herdado do pai e da mãe) e o mitocondrial (de herança materna). O genoma nuclear pode ser dividido, de maneira simples, em éxons e íntrons. Os éxons são regiões codificantes de aminoácidos e geralmente muito conservadas. A baixa taxa de mutação se deve ao eficiente mecanismo de reparo do núcleo (proofreading). Quando a DNA polimerase insere Técnicas moleculares aplicadas à sistemática e ao controle vetorial 253 Voltar ao Sumário no genoma nuclear erroneamente um nucleotídeo e não faz a correção, existem proteínas de reparo que “revisam” esses nucleotídeos inseridos nos éxons e identificam os possíveis erros. Caso exista algum, exonucleases clivam a região complementar errada e a polimerase refaz de maneira correta o fragmento.
TECNICA DE BLOT
Southern Blotting e Northern Blotting dizem respeito a dois métodos muito sensíveis para detecção duma sequência particular de DNA ou RNA, por combinação de separação por electroforese, hibridização com sondas marcadas radioactivamente e auto-radiografia.
 
SOUTHERN BLOTTING
Técnica capaz de detectar um único fragmento de restrição específico numa mistura complexa de fragmentos produzidos pela clivagem de DNA com uma enzima de restrição, mesmo no caso da clivagem de todo o genoma, inclusivé o humano. Numa mistura tão complexa, muitos fragmentos poderão ter o mesmo tamanho e por isso migrarão juntos durante a electroforese. Apesar de nem todos os fragmentos serem separados completamente por electroforese - originando bandas que correspondem a fragmentos que codificam genes diferentes, é no entanto possível identificar um fragmento específico de qualquer banda por hibridização com uma sonda específica para esse fragmento.
Como as sondas não se difundem no gel original, os fragmentos de restrição presentes no gel são desnaturados e transferidos para um filtro de nitrocelulose ou membrana de nylon por blotting (Figura F9.1).
O filtro é então incubado em condições de hibridização com uma sonda específica marcada radioactivamente, usualmente obtida a partir de um fragmento de restrição clonado. Desta forma, a sonda hibridiza com o fragmento de restrição que lhe é complementar e a sua localização no filtro é revelada por auto-radiografia.
 
NORTHERN BLOTTING
Uma forma de caracterizar um gene clonado é determinar quando e onde no organismo esse gene é expresso.
O Northern blotting é um blotting dirigido para RNA: a amostra de RNA é desnaturada por forma a que estas moléculas se mantenham lineares. Os RNAs são separados por electroforese e transferidos para um filtro de nitrocelulose. O filtro é então exposto a sondas marcadas radioactivamente e complementares ao gene de interesse. Finalmente, o filtro é sujeito a auto-radiografia.
TECNICAS DE BLOT NA MEDICINA VETERINARIA
Método Western Blotting Para Detecção De Mormo
Western Blotting (WB), também conhecido como Imunoblotting (IB), é uma técnica bem estabelecida e amplamente utilizada para a detecção e análise das proteínas. Essa técnica é baseada na construção de um complexo anticorpo-proteína através da ligação de anticorpos específicos em proteínas imobilizadas sobre uma membrana e a detecção de anticorpo ligado a partir de vários métodos de detecção. O teste detecta animais com clínica inaparente e aqueles infectados em fase crônica.
REFERENCIA BIBLIOGRAFICA
https://users.med.up.pt/~med05009/bcm/blot_frame.htm
http://informativoequestre.com.br/metodo-western-blotting-para-deteccao-de-mormo/
https://biomolnaveterinaria.wordpress.com
http://faef.revista.inf.br/imagens_arquivos/arquivos_destaque/5D3Iu05EHeEnqPl_2017-1-12-8-29-47.pdf
http://books.scielo.org/id/mw58j/pdf/galvao-9788598203096-13.pdf
http://www.scielo.br/pdf/abmvz/v59n1/42.pdf
http://www.santelaboratorio.com.br/pcr-real-time-diagnostico-quantitativo-para-leishmaniose-visceral-canina/