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TECNOLOGIA 
DO DNA RECOMBINANTE
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Conjunto de técnicas que permitem a manipulação de moléculas de DNA especificas.
Baseia-se nas propriedades do DNA:
 Repositório da informação genética
 Formado por 2 cadeias de ácido desoxirribonucleico
 As duas cadeias são complementares;
 Orientam-se em direções opostas;
 É relativamente estável em meio alcalino;
 Pode ser desnaturado e re-naturado;
 Pode ser sintetizado quimicamente com marcações;
 As propriedades do DNA são universais.
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DNA - Fita dupla complementar: permite autorreplicação
REPLICAÇÃO DO DNA
 Separação das fitas
 Síntese de uma fita complementar para cada uma delas
 Cada fita funciona como molde. 
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DNA nativo 
DNA desnaturado 
DNA renaturado 
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Clonagem: produção de organismos idênticos derivados de um ancestral
comum
 Clonagem Molecular: Perpetuação de uma MOLECULA DE DNA de sequencia
especifica
Organismo Geneticamente Modificado: OGM = Transgênico
Organismo portador de material genético – um gene, parte de um gene, ou um
conjunto de genes – oriundo de um ou mais organismos diferentes.
Transgene
Gene ou fragmento de DNA que foi transportado artificialmente de um
organismo Doador para um organismo Receptor criando o OGM.
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Tecnologia do DNA Recombinante: Aplicações
• Estudo dos genes de um organismo = Estudos genomicos;
• Estudo da regulação de um gene ou conjunto de genes;
• Desenvolvimento de Vacinas e de Vacinas de DNA;
• Desenvolvimento de Terapias genicas;
• Obtenção de transgênicos;
– Vegetais ou animais resistentes a pragas;
– Vegetais ou animais mais produtivos;
– Vegetais ou animais que produzem medicamentos ou vacinas;
• Produção de produtos biotecnologicos/medicamentos/enzimas;
• Diagnostico medico;
• Tecnologia forense (crimes, paternidade, controle se qualidade);
• Estudo do produto final do gene: RNA/Proteína.
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Tecnologia do DNA recombinante 
1. CORTAR O DNA EM LOCALIZAÇÕES PRECISAS - ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO – fornecem as “tesouras moleculares” 
2. SELEÇÃO DE UM DNA PEQUENO CAPAZ DE AUTO-REPLICAÇÃO: PLASMÍDIO OU VIRAL (VETORES DE CLONAGEM) 
3. UNIR OS FRAGMENTOS DE DNA - DNA LIGASE Moléculas de DNA compostas do vetor de clonagem e o DNA a ser clonado - DNA RECOMBINANTES 
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4. TRANSFERIR O DNA RECOMBINANTE DO TUBO DE ENSAIO PARA UMA CÉLULA HOSPEDEIRA - ENZIMAS PARA A REPLICAÇÃO – maquinaria enzimática para a replicação do DNA
5. SELECIONAR OU IDENTIFICAR AS CÉLULAS HOSPEDEIRAS QUE CONTENHAM O DNA RECOMBINANTE 
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE - forma informal - ENGENHARIA GENÉTICA. 
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ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO e DNA LIGASES
Endonucleases de restrição são as enzimas responsáveis por reconhecer e quebrar o DNA em sequencias de específicas, denominadas sequencias de reconhecimento ou sítios de restrição – resultado são fragmentos menores da molécula do DNA.
Isoladas de bactérias e hoje se conhece milhares de endonucleases.
DNA ligase – une o fragmento separado a um vetor de clonagem, catalisa a ligação fosfodiéster que une os nucleotídeos. 
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VETORES DE CLONAGEM USUALMENTE UTILIZADOS:
 PLASMÍDEOS
 BACTERIÓFAGO
 CROMOSSOMOS ARTIFICIAIS DE BACTÉRIAS
 CROMOSSOMOS ARTIFICIAIS DE LEVEDURA 
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PLASMÍDEO 
São moléculas de DNA circulares que replicam separadamente do cromossomo hospedeiro.
São introduzidos nas células bacterianas por TRANFORMAÇÃO: células e plasmídeos incubados juntos a 0ºC, depois muda-se rapidamente a temperatura para 37 – 43ºC – não se sabe o porque, mas as células bacterianas incorporam o DNA plasmídeo em seu DNA.
ELETROPORAÇÃO: células incubadas com o DNA plasmídeo recebem pulso de alta voltagem, membrana se torna permeável à moléculas grandes. 
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VETORES DE PLASMÍDEOS DIFERENTES FORAM DESENVOLVIDOS
Contendo sequencia para início da replicação
Confere resistência à antibióticos – separar células que incorporaram o plasmídeo desejado
Alvos para diferentes endonucleases de restrição - sítios para plasmídeo ser cortado e incorporado ao DNA
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Vetor de
 clonagem
(plasmídeo) 
Vetor de clonagem
é quebrado com endonuclease de restrição 
CROMOSSO
CÉLULA EUCARIÓTICA 
Fragmento de interesse do DNA é obtido por clivagem do cromossomo com endonuclease de restrição 
Fragmentos são ligados para a preparação do vetor de clonagem 
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Vetor recombinante
Fragmentos são ligados para a preparação do vetor de clonagem 
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Vetor 
recombinante
DNA é introduzido em uma célula hospedeira 
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Propagação (clonagem) – produz muitas cópias do DNA recombinante 
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Plasmídeo pBR322 é clivado no elemento resistência à ampicilina 
Pstl endonuclease de restrição 
DNA “estranho”
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DNA “estranho é ligado ao plasmídeo. O plasmídeo perde a região de resistência à ampicilina e mantém a região de resistência à tetracicilina 
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Células de E. Coli transformadas, crescem em placas contendo tetraciclina para selecionar as que receberam o plasmídeo. 
Transformação das células de E. coli. 
DNA do
 hospedeiro
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Seleção das células transformadas
Agar contendo tetraciclina
Todas as colônias contem plasmídeos. 
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Colônias com 
plasmídeos 
recombinantes 
Agar contendo tetraciclina (controle) 
Agar contendo ampicilina + tetraciclina
Células que cresceram em tetraciclina mas não em tetraciclina + ampicilina contêm os plasmídeos recombinantes com a resistência à ampilicina retirada, consequentemente o DNA “estranho”. As células com pBR322 sem o DNA “estranho” mantém a resistência a ampicilina 
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BACTERIÓFAGOS 
Substitui-se 1/3 do genoma do bacteriófago 
 DNA empacotado em partículas de fagos infecciosas
Fragmentos de bacteriófago  são ligados a fragmentos de DNA estranho e empacotados em partículas virais e transmitidos para células. 
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DNA recombinante
DNA recombinante
Empacotamento in vitro 
Bacteriófago contendo DNA “estranho”
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http://sillarbajalh.wordpress.com/2011/01/21/el-futuro-sustituto-de-los-antibioticos-los-bacteriofagos/
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CROMOSSOMOS ARTIFICIAIS
De bactérias (BACs): plasmídeos simples designados para clonar segmentos de DNA muito longos.
 incluem marcadores de seleção como a resistência ao antibiótico cloranfenicol e origem de replicação bem definida. 
DNA circulares são introduzidos nas células hospedeiras por eletroporação. 
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Sítios de clonagem 
Eletroporação 
Eletroporação 
Grande fragmento de DNA “estranho” com extremidades ligantes
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Agar contendo cloranfenicol e substrato para a -galactosidase 
Seleção das 
células resistentes ao clorofenicol 
Colônias com BACs recombinantes são brancas e as colônias com -galactosidase ativa e não possuindo nenhum inserto de DNA no vetor BAC azuis. 
 
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REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Amplificação de segmentos de DNA. 
Dois oligonucleotídeos sintéticos – complementares às sequencias em fitas opostas do DNA alvo – iniciadores da replicação. 
DNA é aquecido – desnaturação
Resfriado na presença de oligonucleotídeos sintéticos. 
DNA é replicado seletivamente. 
Ciclo é repetido 25-30 vezes, em poucas horas, processo automatizado, amplificando o segmento de DNA. 
IMPORTANTE FERRAMENTA DA QUÍMICA FORENSE. 
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Região alvo do DNA a ser amplificada 
Calor para separar 
as fitas 
Adição de oligonucleotídeos primers – resfriamento 
Adição de DNA polimerase termoestável que catalisa a síntese de DNA 5’3’
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Repetidas etapas 1 e 2 
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Síntese do DNA é catalisada pela DNA polimerase termoestável 
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Repetir etapas 
Depois de 25 ciclos, a sequencia alvo foi amplificada cerca 106 vezes
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IMPRESSÃO DIGITAL DO DNA
Polimorfismo das sequencias – pequenas diferenças de bases entre indivíduos, cada diferença ocorre numa pequena fração da população humana: TODO INDIVÍDUO APRESENTA ALGUMAS DIFERENÇAS – SONDAS 
A combinação de várias sondas torna o teste altamente seletivo, é possível identificar um único indivíduo na população humana inteira. 
PCR – utilizado para amplificar amostras de DNA de um único folículo piloso, uma gota de sangue, uma pequena amostra de
sêmen. 
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DNA cromossômico 
(suspeito1) 
DNA cromossômico 
(suspeito1) 
Separação dos fragmentos por eletroforese em gel de agarose 
Fragmentos de DNA
Clivagem com endonucleases de restrição 
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TRANSGÊNICOS – NOVOS PRODUTOS DA BIOTECNOLOGIA 
Transgênicos ou organismos geneticamente modificados são aqueles organismos que adquiriram, pelo uso de técnicas modernas de Engenharia genética, características de um outro organismo que pode até ser distante do ponto de vista evolutivo. Esse organismo apresenta modificações impossíveis de serem obtidas com técnicas de cruzamento tradicionais 
Cruzamento natural:  ar ou os insetos realizam a troca do pólen
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Melhoramento genético: a troca do pólen não é natural,cruzamento de duas plantas para obter uma nova, com características desejadas (resistência doenças, produtividade, adaptação a uma região etc). 
- desvantagem  além das qualidades desejadas, qualidades indesejáveis são transferidas também 
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Jairo Vidal, na fazenda da Embrapa, onde desenvolveu a cenoura capaz de crescer no Brasil
O empenho de Vidal foi em desenvolver uma espécie brasileira, que pudesse ser cultivada -e colhida- também no verão, uniformizando a oferta de cenouras ao longo do ano e estabilizando seu preço. O resultado foi um legume resistente ao calor e a doenças e com maior teor de carotenóides. 
http://www1.folha.uol.com.br/folha/sinapse/ult1063u875.shtml
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Transformação genética: não há cruzamento entre duas plantas, apenas o gene de interesse é transferido. 
A célula de uma planta recebe um gene em laboratório e se multiplica, resultando numa planta transgênica. 
O gene introduzido na célula pode ser de qualquer organismo.
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Nenhuma plasmídeo de células vegetais foi ainda encontrado para facilitar a inserção do gene desejado no DNA dos vegetais. 
Bactéria do solo Agrobacterium tumefasciens – pode invadir as plantas no local de um ferimento, transformar as células próximas e induzi-las a formar um tumor, chamado de coroa de galha. 
O Agrobacterium tumefasciens contém o plasmídeo Ti, que infecta a célula hospedeira na forma de DNA-T, um fragmento do plasmídeo. Esse DNA-T é transferido para o cromossomo da planta hospedeira. 
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DNA-T codifica enzimas que convertem os metabólitos da planta em duas classes de compostos:
Hormônios do crescimento da planta, auxinas e citocininas que estimulam o crescimento das células do tumor da planta transformada 
 Aminoácidos não usuais chamados de opinas que funcionam como fonte de alimentos para a bactéria. São produzidas em grandes quantidades nas células tumorais e só podem ser utilizadas pela bactéria. 
Agrobacterium – com dois plasmídeos recombinantes diferentes, usado para infectar a folha, mas sem a formação do tumor, pois o DNA-T foi excluído. 
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Célula da planta ferida produz acetossiringona 
Acetossiringona ativa os genes vir 
Cópia do DNA-T é transferida e integrada em um cromossomo da planta
Núcleo da célula da planta 
A célula da planta sintetiza auxinas, citocininas, opinas – forma o tumor 
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Gene estranho 
Resistência à canamicina 
Plasmídeo recombinante com o gene estranho e o gene da resistência à canamicina 
Plasmídeo Ti sem o DNA-T
As bactérias invadem sítios da ferida (onde a folha estiver cortada) 
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Segmentos da folha são transferidos para a placa de Agar 
Placa de Agar com hormônios de crescimento e canamicina 
As plantas são regeneradas a partir dos segmentos da folha 
Estas plantas resistentes à canamicina contêm o gene estranho 
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Planta de tabaco expressando o gene para a luciferase do vaga-lume. A planta recebeu luciferina (substrato da luciferase) na água. 
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Plantas de tomate construídas para serem resistentes às larvas de inseto
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A HISTÓRIA DO ROUNDUP READY 
 Glifosato é um herbicida de amplo espectro 
 Ingrediente ativo do herbicida Roundup; 
 Mata todas as plantas com que entra em contato; 
 Inibe uma enzima chave (EPSP sintase) no metabolismo de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano).
 Planta morre porque faltam aminoácidos 
 Um gene que produz uma enzima resistente (EPSP sintase) ao glifosato permite que as culturas sobrevivam mesmo quando pulverizadas
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GLIFOSATO
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PORCOS TRANSGÊNICOS 
Contêm quantidade maior de ácidos graxos -3, benéficos para o coração e uma quantidade menor de -6. 
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POSITIVOS
Alimento pode ser enriquecido com um componente nutricional essencial
O alimento pode ter a função de prevenir, reduzir ou evitar riscos de doenças
Planta pode resistir ao ataque de insetos, seca ou geada
Aumento da produtividade agrícola através do desenvolvimento de lavouras mais produtivas e menos onerosas. 
NEGATIVOS 
 O local onde o gene é inserido não pode ser controlado completamente
Os genes transferidos entre espécies não se relacionam
A uniformidade genética leva a uma maior vulnerabilidade do cultivo
Organismos cultivados para a alimentação estão sendo modificados para produzirem medicamentos
Os OGMs poderiam aumentar as alergias 
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Brasil aprova primeira cana transgênica do mundo
 
A Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), órgão responsável pela análise da avaliação de biossegurança de organismos geneticamente modificados (OGM) no Brasil, aprovou, nesta quinta-feira (08), a primeira cana-de-açúcar transgênica do mundo. A variedade, que pode chegar ao mercado nos próximos meses, é resistente à broca da cana (Diatraea saccharalis), principal praga que ameaça a cultura.
Segundo levantamento realizado nas usinas do centro-sul do Brasil, os índices de infestação da broca da cana têm aumentado nas últimas safras. De acordo com especialistas, as perdas causadas pela praga e o custo de seu controle nas lavouras brasileiras chegam a R$ 5 bilhões por ano. A planta Bt poderá ser utilizada para os mesmos fins das variedades convencionais, como produção de açúcar e etanol. A expectativa é de que seu uso viabilize a expansão da cultura em áreas onde a broca da cana é uma condição limitante, contribuindo para a manutenção da posição do Brasil como um líder mundial na produção de cana, açúcar e etanol.
De acordo com a diretora-executiva do Conselho de Informações sobre Biotecnologia (CIB), Adriana Brondani, a aprovação da cana GM no Brasil representa a chegada ao mercado de uma cultura que, até então, não contava com variedades desenvolvidas por meio de biotecnologia. “A característica inserida, a resistência a insetos obtida por meio da introdução de genes da bactéria do solo Bacillus thuringiensis, já trouxe benefícios para outras culturas, a exemplo do milho, do algodão e da soja”, afirma ela.
Segundo relatório divulgado nesta segunda-feira (05) pela consultoria britânica PG Economics, entre 1996 e 2015, produtores de milho Bt de todo o mundo tiveram, em média, rendimento 13,1% maior do que aqueles que plantaram variedades convencionais. No algodão, a diferença é ainda maior, 15%. Para a soja Bt, que está no mercado a menos tempo (2013), a média é 9,6% a mais de rendimento e a amostra são produtores da América do Sul.
 
Fonte: Redação CIB, 08 de junho de 2017
http://ruralpecuaria.com.br/tecnologia-e-manejo/cana-de-acucar/brasil-aprova-primeira-cana-transgenica-do-mundo.html
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CTNBIO APROVA LIBERAÇÃO COMERCIAL DE SEIS ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS
 10 de março de 2017  admin  0  C&T,
Algodão, soja e milho transgênicos são alguns produtos que tiveram a biossegurança aprovada pela CTNBio e poderão ser comercializados.
A Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio) aprovou, nesta quinta-feira (9), em Brasília, a liberação comercial de seis organismos geneticamente modificados (OGMs). Com a decisão, foram liberados dois tipos de algodão, um tipo de soja resistente a insetos, um tipo de milho, uma vacina contra raiva para felinos e um derivado de alfa-amilase, que pode ser usado, por exemplo, na fabricação de xaropes.
“O aspecto mais importante dessa reunião foi um debate amadurecido com a aprovação
de seis processos para liberação comercial com tecnologias relevantes para a saúde animal e produção agrícola. Essas decisões vão contribuir para a competitividade da agricultura brasileira. Conseguimos avançar bastante, e eu tenho segurança que as decisões da comissão são todas corretas e vão conduzir a maior produtividade respeitando a sustentabilidade ambiental”, afirmou o presidente da CTNBio, Edivaldo Velini.
A liberação comercial concede permissão para uso no meio ambiente, registro, transporte, consumo humano e animal, comércio (importação e exportação) da espécie e descarte. Ao avaliar e aprovar a liberação comercial de um produto, a CTNBio elabora um parecer que examina o risco associado ao OGM no que se refere à biossegurança para o uso proposto. Em seguida, a empresa precisa requerer ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Mapa) a autorização e o registro do item a ser comercializado.
http://www.ddigital.com.br/2017/03/10/ctnbio-aprova-liberacao-comercial-de-seis-organismos-geneticamente-modificados/
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TECNOLOGIA CRISPR/Cas9
Técnicas para editar e modificar o DNA são utilizadas desde a década de 80, mas a CRISPR/Cas9 pode ser considerada revolucionária por permitir a manipulação de genes com maior precisão, rapidez e menor custo.    
Descoberta em 2012, a tecnologia utiliza a enzima Cas9 para cortar o DNA em pontos determinados por uma cadeia-guia de RNA. Utilizando uma metáfora, pode-se compará-la à ferramenta para localizar e substituir palavras no Word, sendo que o primeiro passo é localizar o gene a ser editado para, depois, fazer a alteração desejada.
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CRISPR-Cas9 – técnica única – permite editar partes do genoma pela remoção, adição ou alteração de partes de sequencias do DNA. 
MÉTODO : mais simples, mais versátil e mais preciso de manipulação genética. 
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Sistema CRISPR-Cas9 consiste de 2 moléculas chave que introduzem mudanças (mutação) no DNA
Uma enzima chamada Cas9. Ela atua como um par de “tesouras moleculares” que podem cortar as duas fitas do DNA em localizações específicas no genoma de tal forma que os fragmentos de DNA podem então ser adicionados ou removidos 
Um pedaço de RNA chamado RNA guia (gRNA). Ele consiste de um pequeno pedaço de uma sequencia pré-designada de RNA (cerca de 20 bases) localizado em uma molécula de RNA. 
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O RNA guia é designado para encontrar e se ligar em uma sequencia específica no DNA. 
 gRNA  SEQUENCIA DE BASES COMPLEMENTAR À SEQUENCIA ALVO NO DNA NO GENOMA. 
- gRNA vai se ligar APENAS na sequencia alvo e não em outras regiões do genoma. 
A Cas9 segue o gRNA para a mesma localização na sequencia do DNA e corta ambas as fitas do DNA. 
A célula reconhece o dano ao DNA e tenta repara-lo. Os cientista podem usar o sistema de reparo do DNA para introduzir mudanças em um ou mais genes no genoma de uma célula de interesse. 
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 RNA guia (gRNA) se liga na sequencia alvo no DNA
Sequencia alvo no DNA
Enzima Cas9 se liga ao RNA guia 
Enzima Cas9 corta as fitas do DNA
O corte é reparado introduzindo a mutação 
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Como foi desenvolvido?
Algumas bactérias tem um sistema de edição de genes semelhantes ao sistema CRISPR-Cas9 que utiliza para responder à invasão de patógenos como vírus, como um sistema imunológico. 
Usando CRISPR a bactéria retira fora partes do DNA do vírus e mantém uma parte para ajudar no reconhecimento e defesa contra o vírus em um próximo ataque. 
Os cientistas adaptaram esse sistema para poder ser usado em outras células. 
Várias outras técnicas têm sido usada para edição de genes. O sistema CRISPR-Cas-9 é o mais rápido, mais barato e mais confiável sistema de 'edição' genes.
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Aplicações e implicações 
CRISPR-Cas9 tem um grande potencial como uma ferramenta para o tratamento de uma variedade de condições médicas que têm um componente genético, incluindo câncer, hepatite B ou mesmo colesterol alto.
Muitas das aplicações propostas envolvem os genomas de células somáticas (não reprodutivos) mas tem havido interesse e debate sobre o potencial para editar células germinativas (reprodução). Porque todas as alterações feitas nas células dessa linhagem serão passadas de geração para geração, e isso tem importantes implicações éticas. 
Edição de genes em células germinativas é ilegal na maioria dos países no mundo.  
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Por outro lado, a utilização de outras tecnologias de edição de gene em células somáticas e CRISPR-Cas9 é incontroversa. Na verdade eles já foram utilizados para tratar doenças humanas em um pequeno número de casos excepcionais e/ou risco de vida. 
"É uma tecnologia de modificação de DNA de alta precisão. Com ela, conseguimos introduzir características de forma precisa modificando o DNA sem precisar fazer uma planta transgênica", Alexandre Nepomuceno, EMBRAPA.
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Já foi usado para alterar o genoma de embriões humanos, criar cães extramusculosos, porcos que não contraem viroses, amendoins antialérgicos e trigo resistente a pragas.
Em 28 de outubro de 2016, o time liderado pelo oncologista Lu You, da Universidade de Sichuan, injetou as células modificadas num paciente com um agressivo câncer de pulmão.
Testes clínicos anteriores usando células editadas com uma técnica diferente animaram cientistas. Os pesquisadores coletaram células imunológicas do sangue do receptor e, em seguida, desativaram nelas um gene usando CRISPR-Cas9.
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O gene desativado pelos chineses codifica a proteína PD-1, que normalmente bloqueia a resposta imune de uma célula - os cânceres se aproveitam dessa função da proteína para proliferar.
A equipe de Lu então cultivou as células editadas, aumentando seu número, e as injetou de volta no paciente, que tem câncer de pulmão metastático. A esperança é que, sem a PD-1, as células editadas irão atacar e derrotar o câncer.
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Cientistas acabam de dar um grande passo na criação da primeira vida artificial complexa
Por: Kristen V. Brown
10 de março de 2017 
Pesquisadores construíram, em 2008, o primeiro genoma artificial, uma maravilha da biologia sintética em que os cientistas geraram todos os 582.970 pareamentos de base do genoma da bactéria Mycoplasma genitalium, do início ao fim. Foi uma conquista científica sem precedentes, exigindo que os cientistas cuidadosamente projetassem 101 fragmentos de DNA únicos para que seus códigos se sobrepusessem e ficassem unidos, ligando, então, esses fragmentos pedaço por pedaço. 
Um novo avanço agora leva a humanidade para mais perto do que jamais esteve de desenvolver a primeira vida artificial complexa.
Em um conjunto de sete novos estudos publicados na Science, pesquisadores do Synthetic Yeast Genome Project relataram que haviam, com sucesso, sintetizado seis dos 16 cromossomos que compreendem todo o genoma de levedura. Isso os coloca em mais do que um terço do caminho para gerar levedura projetada desde o início.
Os biólogos atualmente engendram geneticamente grandes faixas de DNA, alcançando triunfos como as maçãs que não apodrecem e a correção de mutações que causam doenças mortais. Mas a sintetização de um genoma inteiro do organismo pode representar um nível sem precedentes de controle humano sobre a natureza.
“Isso é muito empolgante”, afirmou George Church, geneticista de Harvard cujo laboratório está trabalhando na sintetização de genomas humanos e de porcos, nucleotídeo a nucleotídeo. “Eles conseguiram uma das coisas mais difíceis. Os outros dois terços do genoma de levedura acontecerão muito mais rápido.”
A importância da levedura na biologia sintética
Então por que todo esse barulho em cima de alguns milhões de pareamentos de base de um simples fungo unicelular? A levedura tem um papel crucial em biologia sintética. Não apenas é um eucarioto unicelular que compartilha muitos processos celulares importantes com os humanos, mas também, nos últimos anos, cientistas têm o engendrado para que funcione como uma espécie de fábrica viva de biocombustíveis e medicamentos. Além de colocar em evidência questões biológicas básicas e agir como ponto de partida para, um dia,
a sintetização de genomas de organismos mais complexos, um conjunto completo de cromossomos sintéticos pode permitir aos cientistas criarem versões projetadas de levedura que são muito mais úteis e eficientes. Eles podem, por exemplo, um dia projetar uma cepa de levedura otimizada para sobreviver em ambientes de alto nível de álcool, para produzir etanol de maneira mais eficaz.
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“Quando você consegue substituir todos os cromossomos de uma levedura com versões sintéticas, você consegue fazer muito com isso”, disse Eric Topol, geneticista no Instituto de Pesquisa Scripps e que não esteve envolvido nesta pesquisa. “É um grande avanço na biologia. Usamos levedura para tudo.”
Para fazer essa síntese de genoma funcionar, os muitos pesquisadores de todo o mundo que trabalham no Synthetic Yeast Genome Project usaram, primeiramente, um software especialmente projetado para criar versões sintéticas de cinco cromossomos de levedura. O software, chamado de “BioStudio”, é uma conquista quase tão grande quanto a dos próprios cromossomos sintéticos — provavelmente tornará a síntese muito mais fácil no futuro.
No BioStudio, os pesquisadores fizeram vários pequenos ajustes ao DNA de levedura já existente. Coisas como remover áreas de repetição genética e a troca de DNA de um cromossomo para outro, para criar novos cromossomos otimizados, tanto para pesquisa quanto para indústria. Esse DNA projetado foi então quimicamente sintetizado em pequenos pedaços, montado em pedaços maiores e, então, enfim formando um grande cromossomo. Os pesquisadores estão relatando a síntese de cinco novos cromossomos nesta sexta-feira, levando o número total de cromossomos de levedura sintética a seis (o cromossomo de levedura 3 foi sintetizado do início ao fim em 2014).
Cada um desses cromossomos individuais foi então colocado em uma célula de levedura viva, trocando o cromossomo sintético novo por um singular de tipo selvagem. No fim, os pesquisadores acabaram com seis células de levedura parcialmente sintéticas, cada uma com um único cromossomo sintetizado. Para criar uma célula com 16 cromossomos sintéticos, essas células de levedura parcialmente sintetizadas serão pareadas com outras, então produzindo uma célula com um genoma inteiramente sintético. Até agora, três novos cromossomos sintéticos foram integrados em uma célula singular.
“Tínhamos dois objetivos em mente. Queríamos conseguir responder a perguntas da biologia como ‘Como você faz um cromossomo?’ e ‘Por que os genes são organizados da maneira como são?’. E queríamos projetá-los para pesquisa aplicada, como a criação de medicamentos de moléculas pequenas”, disse Joel Bader, engenheiro biomédico na Johns Hopkins e um dos autores dos novos estudos.
Por milhares de anos, os humanos têm manipulado levedura para transformar cepas selvagens em coisas que nos dá produtos como a cerveja e o pão. O objetivo agora é desembaraçar e reorganizar o projeto genético da levedura, então criando uma célula que tenha sido otimizada para remover todas os excessos e elementos de projeto defeituosos que a natureza lhe deu.
Cada novo cromossomo tem seu próprio estudo publicado, além de um que oferece um resumo amplo do progresso e outro que detalha a estrutura física tridimensional da levedura sintética.
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Cromossomo sintético
Até agora, os cromossomos sintéticos não são inteiramente livres de erros — houve alguns efeitos fora do alvo. Os novos cromossomos, no entanto, funcionaram em sua maioria como os pesquisadores esperavam. Bader disse que, dentro de dois ou três anos, eles esperam ter todos os 16 cromossomos sintetizados e montados.
“Agora que descobrimos como fazer, a pesquisa está avançando rapidamente”, contou.
Para ser claro, mesmo quando os pesquisadores alcançarem o incrível feito de sintetizar todo o genoma da levedura, eles não terão criado um organismo inteiramente sintético. Isso porque há mais na vida do que um genoma. O DNA é a molécula que codifica material hereditário. Há outras partes na célula, como o citoplasma. Pense no genoma como as instruções de operação para um computador — você ainda precisa do restante da máquina para fazer o seu programa funcionar.
Topol disse que o avanço, menos de três anos após cientistas anunciarem que haviam sintetizado um par único de bases de genoma de levedura, destaca o quão rapidamente o campo está progredindo.
“Quando comecei minha carreira, achava que um dia conseguiria ler DNA, apenas sonhando em um dia conseguir editá-lo”, comentou.
A curto prazo, um genoma de levedura sintético pode levar à criação de levedura projetada para a fabricação de vacinas, remédios e biocombustíveis mais sustentáveis. Mais para a frente, poderia levar a organismos projetados customizados, talvez até mesmo humanos projetados um dia.
Hank Greely, bioético em Stanford, disse que ainda não está claro se a síntese de genoma completa será uma maneira mais eficiente de fazer as mudanças desejadas aos genomas do que a edição de genomas existentes.
“Daqui a dez anos, será mais fácil e mais barato mudar milhares de pareamentos de base utilizando o CRISPR ou fazer um genoma do início ao fim?”, questionou. “Essa é uma pergunta que depende de tecnologias que ainda estão sendo inventadas.”
Bader, no entanto, disse que deveríamos olhar as duas abordagens como complementares. “Às vezes, você vê algo escrito contendo alguns erros, então você quer editar isso. Às vezes, está tão errado que você precisa começar do princípio”, afirmou.
De um jeito ou de outro, a síntese de genoma provavelmente será atormentada pelo mesmo tipo de questões éticas que cercaram o CRISPR. O quão longe deveríamos levar a intromissão humana na natureza? Se conseguimos crar verdadeiros organismos sintéticos, deveríamos? E como nos certificamos de que nossas tecnologias sejam usadas para o bem e não para o mal?
“Vivemos em um mundo em que tudo o que comemos foi projetado por nossos ancestrais e regularmente conversamos com pessoas a milhares de quilômetros. A civilização se trata de brincar de deus. A questão já não é mais se devemos fazer isso, mas como fazer de maneira inteligente. Precisamos descobrir isso”, encerrou Greely.
http://gizmodo.uol.com.br/vida-artificial-genoma/
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http://www1.folha.uol.com.br/ciencia/2014/03/1432094-cientistas-criam-cromossomo-sintetico.shtml
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Conselheiros de Obama pedem ação contra a ameaça de bioterrorismo com CRISPR
Em uma carta ao presidente, os conselheiros dizem que um aumento "exponencial" da biotecnologia criou poderosas ferramentas que os terroristas poderiam explorar.
SEXTA-FEIRA, 18 DE NOVEMBRO DE 2016 POR EMILY MULLIN TRADUÇÃO POR ELISA MATTE (OPINNO)
 
Conselheiros científicos do presidente Obama alertam que os Estados Unidos precisam urgentemente de uma nova estratégia de biodefesa e devem regularmente informar o presidente eleito Donald Trump sobre os perigos colocados pelas novas tecnologias como a CRISPR, a terapia genética e o DNA sintético, que poderiam ser co-interpretados por terroristas.
Em uma carta dirigida ao presidente, o Conselho de Assessores de Ciência e Tecnologia (PCAST) do Presidente da República pede pela criação de uma nova entidade encarregada de desenvolver uma estratégia nacional de biodefesa dentro de seis meses. Essa estratégia foi desenvolvida em 2009, mas é realizada por várias agências governamentais em uma abordagem não coordenada, diz Piers Millet, um especialista em bioterrorismo do Wilson Center em Washington, D.C.
O conselho também está pedindo ao presidente que pela ao Congresso para criar um fundo de US$ 2 bilhões para responder a emergências de saúde pública que possam ser causadas por novas biotecnologias.
"Durante as últimas duas décadas, o governo concentrou seus esforços de biodefesa em uma lista de patógenos conhecidos - como antraz, varíola e Ebola - declarados pelo Departamento de Saúde e Serviços Humanos e pelo Departamento de Agricultura como tendo o potencial de ameaça grave à saúde pública e à segurança." A pesquisa financiada pelo governo sobre estes patógenos
recebe atenção especial, e os institutos nacionais da saúde limitam investigadores de conduzir experimentos que poderiam fazer determinados germes, como a gripe, mais perigoso.
Imagem: Voluntários da Cruz Vermelha alemã colocam roupas de isolamento enquanto treinando para uma resposta ao vírus ebola em outubro de 2014
Mas os membros da PCAST dizem que o recente crescimento "exponencial" da biotecnologia tornou esta abordagem ultrapassada. Uma nova estratégia, dizem eles, "deve se preparar não só para agentes biológicos conhecidos, mas também para um leque muito mais amplo de ameaças biológicas novas e em constante mudança que podem ser impossíveis de antecipar completamente".
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Especificamente, o conselho argumenta que o DNA sintético, a terapia genética e as tecnologias de edição do genoma como o CRISPR abrem novas possibilidades de uso indevido intencional, como modificar um vírus ou bactéria para torná-lo resistente a drogas. DNA sintético refere-se a DNA artificial que pode ser criado em um laboratório, enquanto terapia genética e edição de genes são métodos para alterar o DNA dentro de células vivas. E os avanços no sequenciamento genômico estão permitindo que os cientistas gerem a leitura completa da informação de DNA de forma rápida e barata para organismos que poderiam potencialmente ser usados por terroristas para criar uma arma biológica.
"Se você conseguir acesso aos dados de sequenciamento, isso é realmente tudo que você precisa", diz Todd Kuiken, pesquisador sênior de pesquisa do Centro de Engenharia Genética e Sociedade da North Carolina State University.
Será quase impossível monitorar todas essas experiências, diz Kuiken. Mas um melhor sistema nacional de vigilância que inclui informações detalhadas sobre o DNA de um microrganismo, como sugerido na carta, poderia dizer aos funcionários do governo se os patógenos envolvidos em surtos de doenças foram projetados ou modificados.
Os membros do conselho também propõem investir no desenvolvimento de novos antibióticos e medicamentos antivirais contra ameaças naturais e provocadas pelo homem, e reservar US$ 250 milhões anuais para estocar vacinas.
Mas enquanto Kuiken diz que ele vê a carta como um passo na direção certa, ela aborda principalmente ameaças biológicas tradicionais, como vírus e outros patógenos. Ele diz que não faz o suficiente para considerar ataques biológicos mais exóticos, como um inseto que foi geneticamente modificado para acabar com a oferta do país de uma cultura básica.
http://www.technologyreview.com.br/read_article.aspx?id=52400
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