Relatório de Bioquímica

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Coordenadoria de Biotecnologia
Curso de Bioquímica
Prática: Dosagem de proteínas pelo método do Biureto e Propriedades físico-químicas das proteínas 
Alunos: Rosângela Moura e Thaís Farias 
Turma: PMQ 351
Professores: Márcio Martins e Lilian Damiana 
Data da realização da prática: 26/09/2017
Data da entrega do relatório: 10/10/2017
Avaliação:
Introdução 
 Proteínas são moléculas orgânicas que apresentam funções celulares (transporte, catálise enzimática, defesa, estrutural, etc.). A função e a estrutura de uma proteína estão fortemente correlacionadas, por isso pôde-se observar uma grande variedade nas estruturas proteicas que acompanham a diversidade de funções desempenhadas pela mesma.
 Uma das particularidades de uma proteína e que a mesma é formada por aminoácidos unidos por ligações peptídicas e estas são formadas entre o grupo de carboxila de um aminoácido e o grupo amino do aminoácido seguinte com a eliminação de uma molécula de água. O número, a identidade e a disposição destes aminoácidos no espaço (devido às interações entre eles) variam entre diferentes proteínas e determinam as distintas estruturas tridimensionais e funções destas. 
 
 
 
 Formação de uma ligação peptídica. Estrutura tridimensional de uma proteína 
 Um dos métodos de quantificação de proteínas e pelo método do Biureto. Proteínas e peptídeos com no mínimo três aminoácidos, na presença desse reativo desenvolvem uma coloração púrpura. Este procedimento é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino (Reativo Biureto) com proteínas e peptídeos. A uréia aquecida a 180ºC forma um composto chamado Biureto e o mesmo ao reagir com íons de cobre em meio fortemente alcalino formará um composto azul. 
 Quando o composto contém duas ou mais ligações peptídicas, produz um complexo cobre-proteína ou cobre-peptídeo de cor púrpura ou azul-violeta, que absorve luz a 545 nm. A intensidade de cor produzida será proporcional ao número de ligações peptídicas que estão reagindo, portanto, a quantidade de proteínas presentes poderá ser determinada.
 Ainda assim pela lei de Beer a absorção da luz é proporcional à concentração do soluto na solução 
Objetivo 
 Determinar a concentração de proteínas através da formação de produtos com coloração que poderão ser quantificados por espectrofotometria. 
Materiais e Métodos 
III.A. Material Dosagem de uma proteína pelo método do Biureto 
7Tubos de Ensaio 
3 Pipetas de 2 mL 
1 Pipeta de 5 mL 
1Pró-Pipete
 1 Béquer de 50 mL 
6 Cubetas
1 micropipeta automática de 200 microlitro
1 micropipeta automática de 1000 microlitro 
 Soluções:
Solução Padrão de Caseína (5 mg/mL) em PBS pH 7,4 
Amostra de Caseína de Concentração desconhecida em PBS pH 7,4 
Reagente do Biureto: CuSO4. 5H2O, 15% p/V
Tartarato Duplo de Sódio e Potássio 0,60% p/V KI 1,0 % p/V
	
	KCl
	2,680 mmol/L
	KH2PO4
	1,470 mmol/L
	NaCl
	0,137 mmol/L
	Na2HPO4. 7 H2O
	8,060 mmol/L
PBS pH 7,4 (Tampão Fosfato com Salina em pH 7,4)
 
 Equipamentos:
Espectrofotômetro UVmini – 1240 UV-VIS SPECTOR PHOMETERS/120V (E) SHIMADZU
Vortex Marca: Vertex, modelo: QL-901
III.B. Métodos
 Adicionou-se a um béquer, aproximadamente 7 mL da solução padrão de caseína e em outro béquer foram adicionados 10 mL da solução de PBS, com o auxílio de uma pipeta e pró-pipete. Foram transferidas alíquotas das soluções de proteína para tubos de ensaio enumerados que estavam sobre a bancada. Conforme a tabela abaixo:
	Tubos
	PBS (mL)
	Caseína
5 mg/mL
(mL)
	Solução[?]
de Caseína(Ml)
	Reagente de Biureto (mL)
	Abs (540nm)
	B
	2,0
	0
	-
	5,0
	-
	1
	1,5
	0,5
	2,5
	5,0
	-
	2
	1,0
	1,0
	5,0
	5,0
	-
	3
	0,5
	1,5
	7,5
	5,0
	-
	4
	-
	2,0
	10,0
	5,0
	 -
	5
	-
	-
	-
	5,0
	-
Tabela 1
 Em seguida os tubos foram homogeneizados e incubou-se a temperatura ambiente durante 15 minutos. Posteriormente, a solução de cada tubo foi transferida para uma cubeta, enchendo-a acima da metade. Esta cubeta foi levada para o espectrofotômetro, para que fossem lidas as absorbâncias, contra o tubo branco, no comprimento de onda de 540 nm. Os valores obtidos foram anotados.
- Resultados 
Absorbância encontras na amostradas enumeradas que correspondem ao comprimento de onda de 540 nm.
A partir do valor da absorbância e da concentração de cada tubo, conseguimos desenhar uma curva padrão da caseína e, assim, calcular o valor da concentração de caseína desconhecida.
	Tubos
	PBS (mL)
	Caseína
5 mg/mL
(mL)
	Solução[?]
de
Caseína (mL)
	Reagente de Biureto (mL)
	Abs (540nm)
	B
	2,0
	0
	-
	5,0
	-
	1
	1,5
	0,5
	2,5
	5,0
	0,093
	2
	1,0
	1,0
	5,0
	5,0
	0,162
	3
	0,5
	1,5
	7,5
	5,0
	0,432
	4
	-
	2,0
	10,0
	5,0
	0,290
	5
	-
	-
	-
	5,0
	0,128
 
Tabela 2 
Cálculos: 
	Tubo 1 
Ci x Vi = Cf x Vf 
5mg x 0,5mL = Cf x 7mL
Cf= 0,357 mg/mL
	Tubo 2
Ci x Vi = Cf x Vf 
5mg x 1,0 mL = Cf x7mL 
Cf= 0,714 mg/mL
	Tubo 3 
Ci x Vi = Cf x Vf
5mg x 1,5mL = Cf x 7mL
Cf= 1,07 mg/mL 
	Tubo 4 
Ci x Vi = Cf x Vf
5 mg x 2mL = Cf x 7mL 
Cf= 1,43 mg/L-1 
Curva padrão com outlier 
	Concentração 
	Abs
	0,357
	0,093
	0,714
	0,162
	1,07
	0,432
	1,43
	0,290
Curva sem outlier 
	Concentração 
	Abs
	0,357
	0,093
	1,07
	0,432
	1,43
	0,29
	Amostra 
	0,128 
Discussão 
  Como foi mencionado o reativo Biureto é muito eficiente quando se deseja descobrir uma concentração desconhecida de proteína e com o auxílio do espectrofotômetro pode-se determinar absorbância de cada tubo de ensaio no experimento num determinado comprimento de onda. Por meio destes resultados obteve-se a curva padrão da amostra Absorbância X Concentração (mg/ml). Após a construção da curva padrão obteve-se as absorbâncias para diferentes concentrações de uma solução de concentração desconhecida (solução padrão). Aplicando-se a Lei de Lambert-Beer onde se afirmar que “A absorção de uma solução é proporcional à concentração da solução e a distância percorrida pelo feixe de luz através da solução”. Então ao construir o gráfico (em anexo) com os dados obtidos na tabela.
 Determinou-se a equação da reta de calibração é y = 0,2247x + 0,0577 (curva sem outlier) e usando mais uma vez a lei de Lambert- Beer pois o coeficiente de correlação foi igual a 0,5193, quando deveria tomar valores de 0,9999. Pode-se concluir também que este é um método muito sensível, daí a existência de desvios, que podem ter sido cometidos ao pouco cuidado na execução e utilização ao pipetar a amostra. Percebemos que o tubo 2 e tubo 4 apresentaram este problema visto que o ultimo devida maior concentração deveria obter uma maior absorbância segundo a Lei de Beer. 
Bibliografia 
LEHNINGER, A. L. Principles of Biochemistry vol. I. 4th Edition. W H FREEMAN & Co., 2004. 1125p.
VOET, D.; VOET, J. G. Bioquímica. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, 2013. 1512 p
Critério:�
Nota:�
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Apresentação�
�
�
Introdução�
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�
Objetivos�
�
�
Métodos�
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Resultados�
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Discussão�
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Bibliografia�
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Total:�
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�
 
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