Sebenta biotecnologia

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FACULDADE DE CIÊNCIAS DA UNIVERSIDADE DO PORTO 
Manipulação molecular 
e Biotecnologia 
Sebenta 
 
Sandra Isabel Cunha Silveira 
Ano lectivo 2010/2011 
 
 
 
Professora: Susana Vieira 
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Plasmídeos 
 
Plasmídeos, pequenos fragmentos de DNA, são 
conhecidos em quase todas as células bacterianas. 
Encontram-se separados do material DNA principal da 
bactéria, representando 2% da informação genética total 
do organismo. Contem de dezenas a centenas de genes, 
comparando com o material DNA principal , que contém 
milhares de genes. 
 
O plastídeo é uma molécula de DNA extra cromossómico separado do DNA 
cromossómico, que é capaz de replicar-se independentemente do DNA cromossómico. 
Em muitos casos, é circular e de dupla cadeia. 
Os plasmídeos ocorrem naturalmente em bactérias, mas, por vezes, são encontrados 
em organismos eucarióticos (ex: Saccharomyces cerevisiae) 
 
Os plasmídeos são: 
 Fechados e peças circulares de DNA; 
 Capazes de auto – replicação; 
 São transportados por muitas bactérias; 
 Fornecem funções únicas à bactéria, permitindo-as replicarem-se sexualmente 
e na passagem de material genético entre elas; 
 Responsáveis pelos factores genéticos que facultam a resistência a antibióticos 
e fornecem enzimas necessárias para quebrar os recursos alimentares pouco 
metabolizados. 
 
 
 
Os plasmídeos são, tipicamente moléculas circulares de dsDNA com tamanho 
entre 2kb e 100b. Estes plasmídeos serão super enrolados na célula. 
 
Os plasmídeos possuem uma origem de replicação, que é uma sequência 
de DNA que permite copiar as moléculas de DNA. 
 
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Dois plasmídeos diferentes que são originados da mesma origem de replicação não 
coexistem. 
 
Alguns plasmídeos são capazes de replicar num número limitado de espécies 
bacterianas; eles têm um estreito intervalo hospedeiro. Exemplos como os plasmídeos 
ColE1, pBR322, pUC18 são limitados para E. coli e para algumas espécies. 
Outros plasmídeos são capazes de replicar numa largo intervalo de espécies 
bacterianas; têm um amplo intervalo hospedeiro. 
 
Controlo das cópias do plasmídeo 
 
O número de cópias do plasmídeo pode variar de 1 (o plasmídeo F) a centenas 
(pUC18). Este número é uma propriedade do plasmídeo e depende do mecanismo que 
regula a sua própria replicação. 
 
 
 
Exemplo: Replicação do plasmídeo ColE1 
 
ColE1 é um pequeno e circular plasmídeo que codifica uma toxina (proteína) de 57 
kDal que consegue matar outra E.coli por despolarização da membrana bacteriana. 
 O plasmídeo ColE1 carrega os seguintes genes: 
 
 
 
 
 
 
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Transferência de plasmídeo 
 
Alguns plasmídeos conseguem auto transferir-se entre células bacterianas por 
conjugação bacteriana. Esses plasmídeos codificam todas as funções proteicas que são 
necessárias e que requerem mobilização e transferência de célula hospedeira para a 
célula receptora. 
Alguns plasmídeos são incapazes. Não codificam as proteínas necessárias. Contudo, 
coexistem na células com plasmídeo que automobiliza-se. Assim, eles podem 
conseguir mobilizar-se, se transportarem a sequencia correcta ou sítios que são 
reconhecidos pelas proteínas que são sintetizadas do outro plasmídeo. 
O plasmídeo ColE1 é um bom exemplo de um plasmídeo mobilizador. Ele contém uma 
região bom (base da mobilização) com local nic que é ligado por proteínas codificadas 
na região mob (mobilização). Quando as bactérias juntam-se, a estreita ligação forma 
um complexo com a proteína mob que lida através do canal de conjugação para a 
célula receptora. 
 
Como estudar um gene? 
 
Cada cromossoma é uma molécula contínua de DNA, que pode ser de milhares ou de 
milhões pares de base. 
O vasto tamanho dos cromossomas coloca um problema para os cientistas que tentam 
isolar e estudar porções de DNA que compõe os genes. 
 
Um cromossoma é uma de DNA contínua. Pode ter milhares ou milhões de pares de 
bases. 
 
Tesouras moleculares 
 
Em 1962, Werner arber, um bioquímico suíço, forneceu a primeira existência de 
“tesouras moleculares” que conseguem cortar DNA. 
Ele mostrou que a bactéria E.coli possui um sistema imunológico enzimático que 
reconhece e destrói DNA estranho, e modifica o DNA nativo para o prevenir de auto-
destruição. 
Arber e os seus associados denominam o grupo que corta DNA de enzimas de restrição 
endonucleases. Eles mostraram que as endonucleases de restrição são específicas no 
seu corte. Uma enzima dada irá cortar o DNA apenas quando reconhece a sequência 
certa. 
 
Utilizamos endonucleases de restrição para podermos estudar os genes 
individualmente e, para cortar DNA. 
 
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Bacteriófago é um vírus que infecta bactérias. O DNA do vírus que entrava, era 
cortado, levando assim á descoberta das enzimas de restrição. 
 
Cola molecular 
 
Não muito depois das descobertas de Arber, Arthur Kornberg identificou um 
mecanismo de colar para a o DNA, uma enzima denominada ligase. 
Kornberg estava a tentar construir um DNA viral artificial de fragmentos virais, mas 
não consegui criar uma molécula activa, biologicamente. Depois de ele adicionar 
ligase, descobriu que a enzima torna possível colar as extremidades da molécula de 
DNA. 
 
A DNA ligase torna possível ligar as extremidades da molécula de DNA. 
 
Fazer mais cópias… 
 
Pelo fim de 1960, a molécula de DNA podia ser cortada e colada. Mas os cientistas 
necessitavam de um mecanismo de cópia a fim de manter uma grande amostra para 
trabalhar. 
 
Essa descoberta veio em 1971, quando cientistas descobriram uma maneira eficiente 
de introduzir pequenos loops de DNA chamados de plasmídeos na bactéria e.coli. estes 
loops de DNA plasmídico consegue transportar um “pacote” de DNA estranho para as 
células hospedeiras, e conferir um benefício como a resistência a drogas. 
 
Cientistas conseguem importar plasmídeos que contêm uma parte selectiva do DNA 
para uma bactéria. A reprodução normal de bactérias produz uma grande quantidade 
do DNA desejado. 
 
A revolução recombinante 
 
A etapa foi definida pela revolução tecnológica. Cientistas descobriram como cortar, 
colar e copiar DNA. 
O que ficou por fazer foi como aplicar estas técnicas para editar e personalizar DNA. 
Esta criação de “DNA recombinante” poderia manipular coisas vivas no seu nível mais 
básico. 
 
Poderão os cientistas criar organismos que combinem os genes de diferentes 
espécies? 
Poderá ajudar a salvar vidas, ou pode ameaçá-la? 
 
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Técnica de transformação/células competentes 
 
A transformação é a introdução de plasmídeos num organismo, como por exemplo 
bactérias. A bactéria ao multiplicar-se origina milhares de cópias de DNA – clonagem 
de genes seleccionados. 
Esta técnica induz a bactéria a incorporar o DNA plasmídico. Espalhamos a bactéria 
transformada numa placa de petri que contém tretaciclina e Canamicina. Apenas as 
bactérias transformadas contendo os dois genes de resistência poderão crescer na 
presença de ambos antibióticos. 
O resultado foi consistente com a bactéria ter sido transformada com um plasmídeo 
com os genes tetr e kanr. Contudo, também é possível que algumas bactérias possam 
ter sido duplamente transformadas por versões re-ligadas do plasmídeo original. 
 
Estas bactérias vivas deixam entrar as moléculas porque não as reconhecem como 
desconhecidas. 
 
Extracção de DNA plasmídico e electroforese em gel de agarose 
 
Análise da restrição mostra que algumas colónias foram transformadas pelo plasmídeo 
recombinante. É permitido saber quando cortamos o plasmídeoe corremo-lo em gel 
de agarose. 
 
 
Crescimento do fago 
 
Existem dois tipos de bacteriófagos, o fago lamda e o fago 
M13. O fago lambda pode existir em pró-fago (integrado no 
genoma bacteriano, lisogénico) ou como um elemento 
genético independente (lítico). 
O fago lambda é um bacteriófago linear de cadeia dupla 
quando carrega no fago uma película proteica. 
 
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Durante a infecção, um fago ataca a bactéria e injecta o material genético no 
citoplasma da bactéria. 
A informação genética do fago assume maquinaria da bactéria, desligando a síntese 
dos componentes da bactéria e redirecciona a síntese do material bacteriano para 
fazer mais componentes fágicos. 
 No ciclo de infecção do fago, a lise é quando a célula rebenta para libertar os 
componentes. Depois da lise, os fagos descendentes infectam as células vizinhas. 
Este é um fenómeno exponencialmente explosivo (causa um crescimento exponencial 
do numero de células que sofrem lise). 
 
 
Como quantificar o crescimento do fago? 
 
Existe uma camada contínua de bactérias (filmes) e são colocados os fagos em baixa. 
Cada roda clara foi um fago que lisaram a bactéria e os pontos são as bactérias que 
foram destruídas e são fagos que ficaram – placa fágica. 
 
 
 
Restrição do crescimento de fagos 
 
É conhecido desde 1950, de que as partículas dos fagos crescem bem e eficientemente 
infectam uma linhagem de bactérias que frequentemente são incapazes de crescer 
bem e infectam outras linhagens da mesma espécie bacteriana. 
 
Em adição, as partículas fágicas que conseguem, com sucesso, infectar uma segunda 
linhagem, frequentemente demonstram um padrão oposto. Estes são capazes de 
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infectar, eficientemente uma segunda linhagem enquanto crescem pobremente na 
linhagem original. 
 
Uma série de estudos mostra que as partículas fágicas que crescem eficientemente e 
infectam a célula hospedeira têm moléculas de DNA que são quimicamente 
modificadas pela adição de grupos metilo em algumas das suas bases adeninas e/ou 
citosinas, enquanto o DNA do fago que pobremente infecta não mostra este tipo de 
modificação química ou metilação. 
 
Partículas fágicas sem metilação do DNA não crescem e nem infectam eficientemente 
porque as suas moléculas de DNA são clivadas e degradadas por enzimas da célula 
hospedeira, enquanto as que possuem DNA metilado estão protegidas da degradação. 
Este fenómeno da degradação do DNA não metilado destrói a habilidade de 
crescimento do fago e é responsável pelo padrão de restrição do crescimento. 
 
Descoberta dos sistemas de modificação-restrição 
 
Apesar do fenómeno biológico do sistema de modificação-restrição crescer das 
observações dos microbiologistas, a variedade das células hospedeiras dos fagos é 
influenciada pela estirpe bacteriana em que o fago se propagou. Apesar dos fagos 
produzirem numa estirpe de Escherichia coli, poderão infectar uma cultura da mesma 
estirpe, eles não alcançam uma infecção de sucesso em células de estirpes diferentes 
da E.coli. Esta descoberta implica que os fagos transportam um “imprint” que 
identifica as suas proveniências imediatas. Testes biológicos simples demonstram que 
a infecção com sucesso numa estirpe diferente resulta na produção de fagos que 
perderam os seus “imprint” e adquiriram um novo. 
 
Observação: 
 Fagos produzidos numa estirpe de E. coli, infectavam a mesma estirpe. 
 Mesmos fagos não infectavam eficazmente SEGUNDA estirpe: PORQUÊ? 
 
 
Em 1960, experiências moleculares demonstraram que o “imprint” de um DNA 
modificado foi perdido quando o DNA fágico numa estirpe bacteriana diferente. Esses 
fagos, que conservam uma parte original da cadeia de DNA retêm o imprint, ou a 
modificação, enquanto fagos que contêm as duas cadeias de um novo DNA sintetizado 
não retêm o imprint. A modificação fornece protecção contra a endonuclease, a 
barreira que previne a replicação do genoma fágico. Mais tarde, foi comprovado que 
as enzimas de modificação e de restrição reconhecem o mesmo alvo, uma sequência 
nucleótica especifica. 
 
 
 
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1960: 
o “imprint” é uma MODIFICAÇÃO do DNA perdida na nova estirpe bacteriana 
Os fagos com UMA das cadeias modificadas retinham o “imprint” 
Os fagos com DNA completamente novo perdiam o “imprint” 
 A MODIFICAÇÃO deveria dar PROTECÇÃO contra uma ENDONUCLEASE 
 
Mais tarde: 
A modificação e a restrição reconheciam o mesmo alvo (sequência nucleotídica) 
 
Nota: Nesta altura não estavam caracterizados os sistemas de Modificação/Restrição 
 
As enzimas de modificação são um DNA metiltransferase que metila bases específicas 
da sequência alvo e na ausência da metilação específica , o DNA da sequência alvo é 
sensível às enzimas de restrição. 
Quando falta no DNA o imprint de modificação apropriado, entra a célula competente 
da restrição que reconhece o DNA como estranho e é degradado por uma 
endonuclease. 
A barreira controlo-hospedeiro para uma infecção com sucesso pelos fagos que não 
possuem uma correcta modificação foi referida como “restrição” e as endonucleases 
adquiriram o nome de enzimas de restrição. Similarmente, as metiltransferases são, 
normalmente, denominadas de enzimas de modificação. Classicamente, a enzimas de 
restrição é acompanhada pela enzima de modificação e as duas compreendem o 
sistema de modificação-restrição. 
 
O hospedeiro “barra” uma infecção por fagos = restrição não protegidos pela 
modificação correcta. 
 
 
E.coli C aparentemente não apresenta sistema R-
M. 
Prever: eficiência de fagos crescido em C quando 
infectam K-12. 
Fagos crescidos em K-12: diferenças quando 
infectam K-12 e C? 
Prever eficiência na formação de lambda K em 
E.coli B. 
E.coli B possui um sistema R-M com especificidade diferente de K-12. 
 
Eschericia coli K-12 possui, enquanto a Escherichia coli C tem em falta, o sistema 
Restrição – Modificação do tipo I. o fago λ (lambda) propagado na E.coli C. (λ.C) não é 
protegido da restrição pela Eco KI e assim, forma placas com eficiência reduzida de 
plaqueamento (EOP) na E.coli K-12 em comparação com a E.coli C. os fagos que nai 
sofrem restrição são modificadas pela Eco KI metiltransferase (λ.K) e, 
consequentemente, forma placas com a mesma eficiência na E.coli K-12 e C. DNA 
modificado é indicado por “hatch marks”. 
 
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A descoberta de uma 
barreira para a 
infecção do seu 
hospedeiro natural, 
E.coli k-12, se o fago 
foi, previamente, 
propagado em E.coli C. 
isto leva a um 
fenómeno do sistema R-M. Eschericia coli K-12 possui um sistema M-R, Eco KI, ausente 
na E.coli C. o fago propagado na E. coli C não é protegido da restrição pela Eco KI e 
forma placas de baixa eficiência na E.coli K-12 em comparação com a E.coli C. 
 
 Bertani e Weigle: uma barreira para a infecção do bacteriófago no seu 
hospedeiro natural, Escherichia coli K-12, que pode “lifted” pela variação 
hospedeiro – controlo do vírus. 
 
 Arber e um aluno de doutoramento Dussoix mostram que o DNA foi rejeitado e 
degradado depois da infecção de diferentes hospedeiros bacterianos, a não ser 
que transporta-se a modificação específica do DNA, e assim, dando 
fundamentos para o fenómeno da restrição e modificação (R- M). 
 
 A enzima de restrição da E.coli k-12, Eco KI, foi purificada em 1968 e necessita 
de S-adenosilmetionina (AdoMet) e ATP como cofactores. 
 
 Pelo fim da década, houve uma evidência substancial para um locus do 
cromossoma hsdk com três genes que codificam as subunidades da restrição 
(C), modificação (M) e especificidade (S) que reúnem num grande complexo de 
mais de 400 kDa. 
 
Em 1970 trouxeram a mensagem de que a Eco KI cortam longe do local de 
reconhecimento do DNA, no local onde a enzima permanece ligada enquanto a 
translocaçãodo próprio DNA passado, com hidrólise de ATP, e subsequente com 
espaços na cadeia dupla. Esta translocação DNA loops, claramente, visível no 
microscópio electrónico. 
A restrição ocorre quando uma sequência alvo específica (sequência de DNA a azul 
escuro que é mostrada como um tubo) sem a 
metilação apropriada (locais amarelos) em 
ambas as cadeias de DNA é reconhecida pela 
enzima. Uma enzima de restrição do tipo II, 
tipicamente uma proteína dimérica, cliva o 
DNA num local definido dentro ou perto da 
sequência alvo específica e dissocia do DNA 
deixando duas terminações livres. Alvos não 
metilados causa à enzima de restrição do 
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tipo I a segurar o alvo e activa a translocação do DNA (direcção mostrada pelas setas 
vermelhas) pelas subunidades motor. Múltiplos contactos com o DNA que expandem 
loops são extrusados a partir da enzima como bobinas no DNA. Adiando a translocação 
por colisão com, por exemplo, com outra enzima de restrição do tipo I, activa a 
clivagem no local da colisão. Depois da clivagem do DNA, a enzima de restrição do tipo 
I permanece ligada ao DNA e não vira na reacção de restrição. A enzima de restrição 
do tipo I compreende as sequências de DNA da subunidade (S), duas subunidades 
metiltransferase (M) e duas subunidades de restrição (R). O núcleo do M2S é 
responsável pela (i) manutenção da metilação do cromossoma hospedeiro pela 
modificação sequência específica hemimetilada produzida pela replicação do DNA e (ii) 
activação da reacção de restrição caso a sequência especifica do DNA reconhecida é 
não metilada em ambas as cadeias e a partir da fonte estranha. Esta reacção de 
restrição compreende ATPases dependentes da translocação do DNA pelos motors, 
que são membros da SF2, que é da família das helicases, e cliva o DNA. A reacção de 
restrição é transportada pela subunidade R, em que cada uma contém um motor e um 
domínio de clivagem do DNA. 
 
 Eco KI tornou-se na arquetípica enzima tipo I do sistema R-M com a 
translocação do DNA com propriedades reminiscentes das helicases, 
reconhecendo o local assimétrico bipartido AAC(N6)GTGC. 
 
Endonuclease de restrição 
 
Quando um bacteriófago é transferido do crescimento em um hospedeiro para um 
hospedeiro diferente, a sua eficiência é, frequentemente, comprometido várias vezes. 
Contudo, quando o fago que sobreviveu e multiplica-se é usado para reinfectar um 
segundo hospedeiro, eles agora crescem normalmente. 
O pobre crescimento inicial é causado pela acção sobre o DNA do fago numa sequência 
específica da endonuclease bacteriana (conhecida como endonuclease de restrição 
porque restrita o crescimento do fago). Seguido da clivagem inicial, o DNA do fago é 
rapidamente degradado a nucleótidos por acção da exonuclease, embora algumas 
regiões possam ser resgatadas pela recombinação. 
O DNA do hospedeiro não é degradado porque a sequência de nucleótidos que é 
reconhecida pelas enzimas de restrição foi modificada (geralmente por metilação). 
As poucas moléculas do DNA do fago que sobrevivem à infecção inicial é devido a estas 
modificarem-se pela metilase do hospedeiro antes da enzima de restrição actuar. Esta 
metilação do DNA dos descendentes torna-os resistentes a uma segunda infecção. 
Um processo inverso é a degradação da citosina no DNA na E.coli infectada com T dos 
bacteriófagos em que o seu próprio DNA contém hidroximetilocitosina. 
Os cromossomas de E.coli codificam a endonuclease de restrição do tipo I, conhecida 
por Eco B (na E.coli na estirpe B). outras enzimas de restrição são codificadas por 
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plasmídeos e são na maioria enzimas do tipo II, mas alguns fagos e plasmídeos 
codificam enzimas do tipo III que são conhecidas por intermediarias em propriedades 
entre as enzimas do tipo I e do tipo II. Enzimas do tipo I e do tipo II catalisam ambas 
endonucleotídeos. 
 
Enzimas do tipo I 
 
São proteínas complexas multifuncionais que clivam DNA mão modificado na presença 
de S-adenosil-l.metionina (AdoMet), ATP e Mg2+. São multisubunidades de enzimas, 
que, são, também DNA metilases e ATPases. 
As subunidades estão presentes em diferentes proporções nas enzimas EcoB e na 
EcoK. Elas são codificadas por três genes contíguos conhecidos como hsdM 
(modificação) e hsdS (espicificidade). As três subunidades são, respectivamente, 
responsáveis pela acção das nucleases, pela metilação e pela especificidade da 
sequência da enzima. 
 
Os locais de reconhecimento para as 
enzimas de restrição EcoK e EcoB do tipo 
I são mostrados na imagem. As adeninas 
com um asterisco na sequência EcoB é 
metilada pela enzima EcoB e as adeninas 
correspondentes á sequência EcoK são os locais da metilação pela metilase de 
restrição EcoK. As sequências de reconhecimento consistem num grupo de três bases e 
num grupo de quatro bases separadas por seis (EcoK) ou oito (EcoB) bases 
inespecíficas. 
 
Sistemas de modificação-restrição 
 
Metilase e nuclease 
 
No fim de 1960, o cientista Stewart Linn e Werner Arber isolaram amostras de dois 
tipos de enzimas responsáveis pelo crescimento restrito de fagos na Escherichia coli. 
Uma destas enzimas metilaram DNA, enquanto que a outra cortou DNA não metilado 
uma grande variedade de locais ao longo do comprimento da molécula. 
O primeiro tipo de enzimas foram chamadas de metilases enquanto as outras são 
chamadas de nucleases de restrição. 
Estas ferramentas enzimáticas eram importantes para os cientistas que estavam a 
reunir as ferramentas necessárias para “cortar e colar” moléculas de DNA. 
 
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O que era necessário agora era uma ferramenta que cortaria o DNA em locais 
específicos, em vez de locais ao acaso ao longo do comprimento da molécula, para que 
os cientistas podessem cortar DNA numa forma previsível e reprodutível. 
 
Breve história: 
o Década de 50 – descoberta de um sistema imunitário primitivo em bactérias – 
algumas estirpes de E.coli eram resistentes à infecçao por vários bacteriófagos. 
o Década de 60 – descoberta de um sistema enzimático bacteriano que 
reconhecia e destruía selectivamente DNA estranho, enquanto que modificava 
o DNA endógeno, prevenindo a sua destruição. 
 
 Extractos bacterianos capazes de clivar DNA fágico devido à presença de 
nucleases as quais eram capazes de reconhecer e cortar DNA. 
 
 Endonucleases – cortam DNA em posições internas 
 Exonucleases – cortam DNA externamente 
 
Para além da actividade nuclease, algumas enzimas apresentavam a capacidade de 
modificar o DNA por metilação de nucleótidos dentro da sequência por elas 
reconhecida: 
 
 
Modificação do DNA – Metilação 
 
 
 
 
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Exemplos de metilação 
 
 
 
Metilações mais frequentes 
 
 M6A-N6-metiladenina 
 M5C-C5-metilcitosina 
 M4C-C4-metilcitosina 
 Hm5C-C5-hidroximetilcitosina 
 
O DNA metilado pode ser passado à descendência. O X está 
protegido, ou seja, o seu DNA está protegido pelo sistema de 
metilação. 
As bactérias que se protegem os fagos pela metilação. 
Os sistemas de modificação-restrição são e metilação são 
específicos para cada estirpe. 
 
 
O sistema de modificação-restrição e metilação têm que reconhecer uma sequência da 
estirpe em locais específicos. 
 
Se ocorrer um erro na metilação, o próprio fago pode ser metilado e fica protegido. 
 
Tipos de Sistemas de restrição‐metilação com base na composição das subunidades, 
tipo de clivagem, tipo de especificidade, necessidade de co‐factores 
 
Tipo I – são enzimas complexas, multiméricas, combinando as duas actividades de 
restrição e modificação, e cortam o DNA em locais aleatórios e distantes do local de 
reconhecimento. Consomem ATP na reacção da hidrólise.Não têm aplicação prática 
no laboratório. 
 
Tipo II – cortam o DNA dentro ou próximo da sequência de reconhecimento, 
produzem fragmentos de DNA discretos, que formam padrões de bandas 
característicos, e são as únicas usadas no laboratório para análise de DNA e clonagem. 
Não necessitam de ATP para a hidrólise, apenas Mg++. 
 
Tipo III – são também enzimas com actividade de restrição e modificação. Cortam fora 
da sequência de reconhecimento e necessitam de duas dessas sequência em 
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orientações opostas, numa mesma molécula de DNA, para executar a clivagem. 
Raramente produzem digestões completas, e também consomem ATP. 
 
Características das enzimas dos Sistemas de Modificação-Restrição de tipo I, II, III 
 
 
 
Enzimas de tipo I ligam-se à sequencia alvo, metilando-a, ou clivando o DNA, 
consoante o estado de metilação deste 
 
 
 
 
Tipo I 
 
Para clonagem de sequências de DNA desconhecido na E.coli, a mais importante é o 
sistema tipo I, codificado por hsdR, hsdM e hsdS, o sistema de restrição EcoK. 
 
Os produtos dos três genes formam uma enzima multimérica capaz de clivar ou metilar 
um sequência alvo particular (5’-AAC[N6]GTGC-3’ na E.coli estirpe K-12). 
 
 O sistema de restrição EcoK do tipo I é codificado pelos genes hsdSMR. (hsd significa 
“especificidade para o DNA hospedeiro). O gene hsdS 
produz a subunidade de especificidade que reconhece a 
sequência de DNA: 
 
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Se a sequência alvo é hemimetilada (apenas uma cadeia é metilada e ocorre durante a 
replicação do DNA no cromossoma do hospedeiro), então a enzima actua como 
metilase e protege a sequência da clivagem. 
 
Se a sequência não é metilada em nenhuma cadeia, então a enzima actua como uma 
endonuclease de restrição e corta a sequência alvo. 
 
Normalmente, o DNA de outro organismo não será metilado na sua sequência alvo e 
será degradada quando introduzida na cadeia os tipos dos três genes. 
 
O sistema de restrição EcoK codifica proteínas que degradam DNA estranho que não 
é, propriamente, metilado na sequência 5’-AAC-(N)5-GTGC-3’ que irá ocorrer no DNA 
clonado. 
 
 
 
Quais são os efeitos do sistema de modificação-restrição do DNA bacteriano na 
clonagem e manipulação do DNA da E.coli? 
 
O gene hsdR é necessário apenas para a clivagem da sequência alvo pela 
endonuclease. 
Os genes hsdM e hsdS são necessários e suficientes para a metilação da sequência 
alvo. 
As estirpes de E.coli que são mutadas pelo gene hsdR são denominadas de minus 
restrição, modificação mais fenótipo (r-, m+). 
 
Genótipos e fenótipos de mutantes hsd no sistema EcoK 
 
 
 
A subunidade hsdM é indispensável à função de restrição por hsdR 
 
 
 
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O tipo II inclui as típicas enzimas de restrição utilizadas na biologia molecular. 
 
 
 
Sequências de reconhecimento das enzimas de restrição 
 
 
 
O segundo tipo do sistema modificação-restrição consiste das endonucleases que 
clivam, directamente, o DNA alvo que é metilado em certas sequências. 
Na E.coli existe dois tipos de sistema de restrição metil-citosina denominados de McrA 
e McrBC. 
 
Nenhum destes sistemas cliva DNA que foi metilado por enzimas do tipo I (codificadas 
pelos genes hsdRMS), sistemas Dcm ou Dam. 
 
Ambos os sistemas McrA e McrBC restringem DNA hemimetilado assim como DNA 
metilado nas duas cadeias. O DNA que foi metilado pela metilase Sss (metila as 
citosinas do dinucleótido CG) e pela metilase Hpa II (metila a segunda citosina da 
sequência 5’-CCGG-3’) são restringidas pelo sistema McrA (4,5). 
 
O segundo tipo de sistema de modificação é o complexo mcrA/mcrB/mrr que degrada 
o DNA estranho e que não é propriamente metilado, como o DNA metilado obtido de 
células do rato ou humanas que contêm CpG DNA metilado. 
 
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Quais os efeitos do sistema modificação-restrição do DNA bacteriano na clonagem e 
manipulação do DNA na E.coli? 
 
O DNA de mamíferos tende a metilar as citosinas nas sequências CG e DNA de plantas 
nas citosinas das sequências CNG. É recomendado em estirpes que são mutadas por 
esses sistemas (mcrA/mcrB/mrr) para aumentar a recuperação do DNA genómico 
propagado na E.coli durante as experiências de clonagem. 
 
E.coli K12 (MG1655) – sistemas de restrição 
 
Segundo a informação do Ecocyc e Escherichia coli e Salmonella, o seguinte sistema de 
restrição é encontrado na E.coli K12. 
Contém enzimas de restrição EcoK do tipo I codificadas pelo hsdR que cliva na 
sequência AAC(N6)GTCG, se o segundo A é não metilado. Contém também o sistema 
Mcr. Este sistema de restrição não parece ter uma sequência, apenas corta nos 
resíduos metilados. 
O sistema mrr, também contido nesta bactéria, que cliva resíduos de m6A e m5C. a 
sequência de especificidade é desconhecida. 
 
A presença do gene hsdR no MG1655 pode explicar porque é que plasmídeos (exemplo 
pSB4A3 e pCH1497-ASD1) que contêm sequência de reconhecimento para a função da 
EcoK incerta na MG1655. Pelo contraste, constrói o que não contém a sequência para 
a função da EcoK na MG1655. 
 
Metilação do DNA 
 
A maioria das estirpes de E.coli contém duas enzimas que metilam o DNA: 
 
1. dam metiltransferase (DNA Adenina Metilase) 
 Responsável por mais de 90% da metilação do DNA; 
 Introduz grupos metilo na posição N6 da adenina na sequência 5’ GATC 
3’ 
 As estirpes bacterianas mutantes nesta enzima designam-se por dam- 
 
19 
 
 
 
2. dcm metiltransferase (DNA Citosina Metilase) 
 Introduz grupos metilo na posição C5 da citosina 
mais interna da sequência 5’ CCAGG 3’; 
 As estirpes bacterianas mutantes nesta enzima 
designam-se por dcm- 
 
 
As estirpes bacterianas mais correntemente usadas em Biologia 
molecular são geralmente dam- e dcm-, em simultâneo, de 
modo a garantir que o DNA clonado não seja metilado e possa 
ser processado pela maioria das enzimas de restrição 
disponíveis. 
 
 
Ao pegar num plasmídeo e coloca-lo numa bactéria Rk- Mk-. Purifica-o e coloca-o 
numa estirpe Rk + o plasmídeo propaga-se ? 
Sim, o plasmídeo propaga-se porque está protegido pois foi metilado pela bactéria. 
 
Sequências de reconhecimento sobrepostas total ou parcialmente às sequências de 
metiltransferases são um indicador de que bases metiladas podem impedir a acção das 
enzimas de restrição. 
20 
 
 
 
Quadro resumo: 
 
 
 
Marcadores moleculares 
 
Os marcadores específicos serve para estudar as variações a nível das populações, 
espécie, ou seja, estudar os polimorfismos (variações fisiológicas). 
 
Usando polimorfismos visíveis 
 
Vantagens Desvantagens 
Pouco dispendioso para contar Polimorfismos visíveis raros 
Passíveis de experimentar nas populações 
naturais 
Maioria das variações genéticas difíceis 
de visualizar 
 Base da variação genética pode ser 
complexa e não é necessariamente fácil 
de determinar 
 Espécies secretas 
 
Porque é que nos preocupamos com as variações? 
 
Estudamos as variações para estudar: 
 As diferenças fenótipicas subjacentes; 
 O que causa doenças hereditárias; 
 Para permitir o historial humano (antigo e moderno) 
21 
 
Polimorfismos bioquímicos 
 
Marcadores bioquímicos 
 
Proteínas aloenzimas 
 
Variâncias electroforéticas das proteínas produzidas por diferentes alelos dos genes 
codificantes de proteínas. 
 
Método: 
1. Homogenizar o tecido; 
2. Separar o extracto por electroforese num gel de 
amido. Coloca-se o gel numa solução com 
reagentes que necessitam de actividade 
enzimática da enzima que estamos a monitorizar. 
3. Mancha-se o gel com um corante que a enzima pode catalisar num reagente 
com cor que mancha a proteína. 
 
Usando polimorfismos proteicos 
 
Vantagens Desvantagens 
Pouco dispendioso Apenas revela uma pequena proporção 
da variação de DNA 
Marcadores são co-dominantes 
(marcadoresco-dominantes analisa um 
locus 
Muitas variâncias de DNA não resultam 
em mudanças na sequência de 
aminoácidos (e.x. substituições 
sinónimas) 
 Algumas mudanças na sequência de 
aminoácidos não resultam em mudanças 
na mobilidade no gel. 
 
Polimorfismos moleculares 
 
Marcadores moleculares 
 
Marcadores moleculares são baseados em polimorfismos que ocorrem naturalmente 
na sequência de DNA (e.x. delecções de par de bases, substituições, inversões, adições 
e repetições). 
Existe vários métodos para detectar e amplificar estes polimorfismos: 
 RFLP 
 RAPD 
 AFLP 
 
Existe cinco condições que caracterizam um marcador molecular adequado: 
 Tem que ser polimórfico; 
 De preferência co-dominante; 
 Distribuído pelo genoma frequentemente e aleatoriamente; 
22 
 
 Fácil e barato de detectar; 
 Reprodutível 
 
Um primer amplificando um marcador dominante pode amplificar vários loci na 
mesma amostra de DNA com uma única reacção de PCR. Um marcador co-dominante 
analisa um apenas um locus. Um primer que amplifica um marcador co-dominante 
produziria o produto pretendido. 
 
Os marcadores moleculares podem ser utilizados em diferentes aplicações: 
 
 Caracterização do germplasma (colecção de recursos genéticos de um 
organismo); 
 Diagnóstico genético (doenças, etc.); 
 Caracterização de transformantes (e.x. análise e detecção GMO); 
 Estudos de paternidade e forenses; 
 Estudos do presente e do passado sobre a distribuição e ecologia das 
populações; 
 Genética da população e fluxo de genes; 
 Estudo do genoma; 
 Delimitação de espécies e análise filogénica. 
 
Técnicas usadas para a análise de marcadores moleculares 
 
As técnicas utilizadas para a análise de marcadores moleculares são: 
 Digestão por enzimas de restrição; 
 Electroforese; 
 PCR; 
 Por vezes a combinação de todas (RFLP-PCR) 
 
Técnicas de marcadores moleculares 
 
Restriction fragment length polymorphism (RFLP) 
 
 Esta técnica envolve a digestão do DNA genómico por enzimas de restrição. 
 As enzimas de restrição são isoladas de bactérias e consistem em cortar o DNA 
em locais específicos na sequência de par de bases, em que são denominados 
de locais de restrição. 
 Os locais de restrição não estão associados a nenhum tipo de gene e 
encontram-se distribuídos aleatoriamente pelo genoma. 
 Quando o DNA genómico é digerido por uma ou mais enzimas de restrição, 
uma série de fragmentos são produzidos em vários comprimentos. 
 Os fragmentos são separados por electroforese em gel de agarose ou em gel de 
poliacrilamida (PAGE) produzem certas características. 
 As variações das características da digestão de RFLP pode ser causados por: 
o Delecções de par de bases; 
o Substituições; 
23 
 
o Inversões; 
o Translocações e transposições 
 Os resultados são perda ou ganho de locais de reconhecimento, resultando 
num fragmento de diferente tamanho e polimorfismo. 
 Os locais de restrição são, muitas vezes, palindrómicos 
 
 
 
Usando RFPL polimorfismos 
 
Vantagens Desvantagens 
Variantes são co-dominantes Trabalho intensivo 
Variações das medidas ao nível da 
sequência de DNA, não na sequência da 
proteína 
Requere grandes quantidades de DNA 
 
PCR baseado nos marcadores moleculares 
 
Randomly amplified polymorphormic DNA markers (RAPD) 
 
 RAPD foram os primeiros PCR baseados em marcadores moleculares 
desenvolvidos e os mais simples; 
 Pequenos primers de PCR (aproximadamente de 10 bases) são aleatoriamente 
e arbitrariamente seleccionados para amplificarem segmentos de DNA do 
genoma; 
 Os produtos da amplificação são criados na região que flanqueia os locais dos 
10 bp na orientação apropriada; 
 RADP, muitas vezes mostram relações dominantes devido ao primer ser 
incapaz de ligar-se a alelos recessivos; 
 Os produtos de RAPD são, normalmente, visualizados em gel de agarose corado 
com brometo de etídio, SYBR Safe, Gel Red ou outros corantes de DNA. 
 
 
 
 
 
 
24 
 
Vantagens Desvantagens 
Rápido Marcadores são dominantes 
Pouco dispendioso Presença de uma banda pode significar 
que o indivíduo é ou heterozigótico ou 
homozigótico para a sequência 
Grande variedade Análise da informação mais complicada 
 
Simple sequence repeats / microssatélites 
 
São repetições de pequenas sequências do genoma de todos os eucariontes e consiste 
em várias a centenas de repetições de 1 a 4 motivos nucleóticos. 
 
 
Amplified fragment lenght polymorphism (AFLP) 
 
 AFLP é um método altamente sensível baseado na combinação dos conceitos 
RFLP e RAPD; 
 Esta técnica é aplicada a todas as espécies, dando resultados reprodutíveis; 
 A base do AFLP é o amplificação por PCR com corte dos fragmentos do DNA 
genómico com enzimas de restrição. 
 
Fragmentos restritos produzidos por um cortar 
frequente (MseI) e um cortador raro (EcoRI). 
 
Os adaptadores consistem na sequência núcleo mais 
enzimas específicas para a sequência. A sequencia 
núcleo é um segmento de DNA conhecida (20 
nucleótidos) que vai ser utilizado como primer no 
próximo PCR. 
 
 
Adaptadores usados como primers. Para uma primeira selecção dos fragmentos 
apenas amplificamos DNA que tenha um adaptador ligado em ambas as extremidades. 
Em adição, os primers têm uma base adicional permitindo a amplificação de um quarto 
com o adaptador em ambas as extremidades. 
 
 
25 
 
Três mais nucleótidos são adicionados ao primer da amplificação anterior. A 
amplificação é mais selectiva e os fragmentos restritos diminuem. Um dos primers é 
marcado com fluorescentes para futura visualização. 
 
 
 
Electroforese 
 
 Um capilar fino contendo um polímero substitui o usual gel de acrilamida. As 
condições da electroforese podem ser resolver a diferenciação de fragmentos 
de DNA apenas com um par de bases. 
 As amostras são carregadas numa faixa e correm uma atrás das outras através 
do capilar. Todos os fragmentos são separados pelo tamanho. 
 Depois de passarem o laser, um corante liga-se ao primer, que excita e emite 
um sinal fluorescente que é recolhido por computador. O resulta da 
fluorescência é visualizado no computador. 
 
 
Vantagens Desvantagens 
Rápido Marcador é dominante 
Barato A presença de uma banda significa que o 
individuo ou é heterozigótico ou 
homozigótico para a sequência 
Grande variedade 
 
Variable number tandem repeats (VNTR) 
 
 Regiões não codificantes; 
 Várias cópias da mesma sequência; 
 Grande quantidade de variações entre indivíduos no número de cópias; 
 Usado para DNA fingerprinting; 
 Microssatélites, minissatélites, short tandem repeats (STR), simple sequence 
repeats (SSR); 
 ISSR – inter-simple sequence repeats 
 
O desenho de primers para flanquear a região é necessário. 
 
 
 
 
26 
 
Microssatélites 
 
 VNTRs mais útil; 
 2, 3 ou 4 par de bases repetidas; 
 De algumas a 100 cópias tandem; 
 Grande variedade; 
 Vários microssatélites loci (1000s) diferentes em várias espécies. 
 
Vantagens Desvantagens 
Grande variedade Relativamente dispendioso e com 
consumo de tempo para desenvolver 
Grande evolução 
Co-dominante 
 
 Usado em estudos de populações; 
 Não muito entre estudos entre populações que evoluem muito; 
 Análise de paternidade ou outros estudos de parentesco 
 
Single nucleotide polymorphisms -SNP 
 
 Variação da sequência de DNA ocorre quando um único nucleótido, no genoma 
(ou outra sequência partilhada) difere entre membros da espécie ou 
emparelhados; 
 Exemplo: duas sequências de fragmentos de DNA de diferentes individuos. 
AAGCCTA para AAGCTTA, contém a diferença num único nucleótico. Neste caso 
são dois alelos : C e T. 
 Quase todosos SNPs têm apenas dois alelos. 
 
Conceitos chaves de SNP 
 
 Definição – mais do que uma base alternativa ocorre numa frequência 
apreciável; 
 Disponibilidade - mais de 10 milhões de SNPs têm sido identificados no genoma 
humano; 
 Função – maioria dos SNPs são neutros e menos de 1% presente em regiões 
codificantes de proteínas. 
 
Os SNP são os: 
 O polimorfismo genético mais comum 
 Distribuído pelo genoma com grande densidade 
 Grande causa da diversidade genética entre diferentes indivíduos, como por 
exemplo, resposta a drogas, susceptibilidade a doenças. 
 Facilita uma grande escala genética associado a estudos como marcadores 
genéticos. 
 Maioria dos SNPs não alteram a síntese proteica nem causam doenças 
directamente. Servem como marcadores, uma vez que podem ser fisicamente 
27 
 
semelhantes ao local da mutação no cromossoma. Por causa desta 
proximidade, os SNPs podem ser partilhados entre grupos de pessoas com 
características comuns. 
 Analisando o padrão de SNP entre diferentes grupos de pessoas podem 
esclarecer a evolução da raça humana e compreender grupos étnicos e raças. 
 
 
 
Locais SNP 
 
 SNPs ligado ou iSNPs não residem entre genes e não afectam o funcionamento 
da proteína. Contudo, eles correspondem a uma resposta a uma droga 
particular ou ao risco de apanhar uma certa doença. 
 
 SNPs causativos afecta a forma como uma proteína funciona, 
correlacionando a doenças ou influenciando a resposta de uma 
pessoa à medicação. SNPs causativos acontecem em duas 
formas: 
 
o Coding SNPs ou cSNPs localizados entre regiões 
codificantes de um gene, alterando a sequência de 
aminoácidos do produto do gene da proteína. 
o Non-coding SNPs or rSNPs, localizados entre a sequencia 
regulatória do gene, alterando o nível da expressão 
genica e, portanto, quanto RNA e proteína é produzida. 
 
 
pUC19 – um plasmídeo de engenharia genética 
 
 2,7KB (pequeno tamanho permite grande espaço para inserir DNA) 
 DNA não genómico circular 
o DNA do fago lambda é linear e muito maior (48,5kb) 
 Tem uma origem de replicação e um grande número de cópias (200/célula) 
 Gene resistente à ampicilina 
o Codifica uma enzima que liga e degrada a ampicilina 
 Gene Lac Z (parte do operão Lac) 
o Codifica a β-galactosidase 
o Uma enzima que degrada a lactose em glucose e galactose 
28 
 
o Local múltiplo de clonagem dentro do LacZ 
 Contém sequências de reconhecimento para várias enzimas de 
restrição 
 A ruptura deste local previne a produção de β-galactosidase 
 
 
 
Digestão restrita do plasmídeo pUC19 e fago lambda (λ) 
 
Usa a enzima de restrição Hind III para cortar tanto o plasmídeo pUC19 e o fago 
lambda. A sequência de restrição para o Hind III é A.AGCTT. esta sequência específica 
ocorre uma vez no pUC19 e sete vezes no fago lambda. 
Um local do pUC19 cria uma porção de DNA linear quando cortada. 
Sete locais do lambda origina oito fragmentos quando cortado. 
Os fragmentos de DNA serão separados e analisados em gel de agarose. 
 
Enzimas de restrição 
 
Na base das experiências clássicas de Berg e de Boyer-Cohen-Chang estão as enzimas 
de restrição. Os cientistas logo se aperceberam que as enzimas de restrição podiam 
constituir uma ferramenta notável para investigar a organização, função e expressão 
génicas. 
 
As enzimas de restrição clivam o DNA em locais específicos: 
 
1. Produzindo fragmentos de tamanho discreto que podem ser 
analisados por electroforese. 
 
 
 
 
2. Constituindo um auxiliar precioso na clonagem de 
DNA e permitindo a manipulação de fragmentos de 
DNA relativamente pequenos 
 
 
 
29 
 
As enzimas de restrição (ou endonucleases de restrição) foram descobertas em 1970 
durante investigações sobre o fenómeno de modificação e restrição de bacteriófagos 
pelo hospedeiro. A restrição à infecção resulta da acção de “enzimas de restrição” em 
combinação com DNA-metiltransferases. Estas metilam o DNA bacteriano próprio, 
tornando-o por sua vez resistente à acção das endonucleases, que assim actuam 
unicamente sobre o DNA viral. 
 
Endonuclease + metilase: 
sistema que protege o DNA 
do hospedeiro e digere o 
DNA viral 
 
 
 
 
 
 
Nomenclatura das enzimas de restrição 
 
 
 
Mais de 250 enzimas de restrição com diferentes especificidades de sequência foram 
já caracterizadas. A maioria reconhece sequências simétricas, palindrómicas (porque 
se ligam ao DNA como homodímeros), e portanto que se lêem de igual modo em 
ambas as cadeias. 
 
Taq I 
 
 Microrganismo: Thermusaquaticus 
 A sequência de reconhecimento é 
simétrica (palindrómica), composta 
por 4 pares de bases. A enzima 
produz extremidades coesivas (em 
cadeia simples), de 2 bases, 5’-
protuberantes. 
 
As duas extremidades deixadas pelo corte da enzima são iguais? 
 
 
Palindrómica – molécula de DNA que dá para ler igualmente nos dois sentidos. Tem 
simetria 
30 
 
Hha I 
 
Microrganismo: Haemophilushaemolyticus 
A enzima produz extremidades coesivas 3’-
protuberantes. 
 
Sma I 
 
Microrganismo: Serratiamarcescens 
A sequência de reconhecimento é composta por 6 
pares de bases. 
A enzima produz extremidades não coesivas (em 
cadeia dupla). 
 
 
BbvCI 
 
Microrganismo: Bacillusbrevis 
A enzima tem uma sequência de reconhecimento 
assimétrica (não palindrómica). 
A forma activa da enzima é um heterodímero. 
 
DdeI 
 
Microrganismo: Desulfovibrio desulfuricans 
N pode ser qualquer base. 
Esta enzima reconhece em cada uma das cadeias 
qualquer das 4 sequências CTAAG, CTTAG, 
CTGAG, CTCAG (contudo, estas representam 
apenas 2 locais de ligação diferentes). 
 
MboII 
 
Microrganismo: Moraxellabovis 
A sequência de reconhecimento é contínua e 
assimétrica. A enzima corta o DNA fora da sequência 
de reconhecimento. Possui dois domínios, um de 
ligação ao DNA, outro de clivagem. 
Extremidade coesiva de uma base (N-3’). 
 
SfiI 
 
Microrganismo: Streptomycesfimbriatus 
A sequência de reconhecimento é descontínua. 
As metades da sequência de reconhecimento 
encontram-se separadas por 5 bases. 
 
31 
 
NotI 
 
Microrganismo: Nocardia otitidiscaviarum 
A enzima tem uma sequência de reconhecimento de 8 
pares de bases, e corta o DNA, em média, muito 
raramente. Extremidades coesivas de 4 bases. 
 
Isoesquizómeros são a mesma sequência de reconhecimento e mesmo local de corte. 
Por ex. EcoRIe FunII 
 
 
 
Neoesquizómeros são um subconjunto dos isoesquizómeros: a mesma sequência de 
reconhecimento mas local de corte diferente. Por ex. SacIe Ecl136II 
 
 
 
 
 Nos neoesquizómeros, a mesma sequência de reconhecimento mas local de corte 
diferente. Por ex. ApaI e Bsp120I 
 
 
 
As enzimas Bsp120I , EaeI e EagI têm sequências de reconhecimento diferentes da de 
NotI, e diferentes entre si, mas originam extremidades compatíveis(Y=Py=pirimidina; 
R=Pu=purina) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
32 
 
Nomenclatura para bases específicas incompletas nos ácidos nucleicos Sequences 
 
Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB), 1984 
 
 
A sequência de reconhecimento das enzimas de restrição representa-se normalmente 
em cadeia simples 
 
 
A sequência de reconhecimento da HindIII é 5’-aagctt e portanto não corta na 
sequência representada abaixo. 
 
 
A frequência de corte das enzimas de restrição depende essencialmente do número de 
bases da sequência de reconhecimento, mas é desviado fortemente pela composição 
de bases do DNA e da presença de bases metiladas 
 4 bp-> 256 bp em média (44) 
 6 bp-> 4096 bp em média (46) 
 8 bp-> 65 536 bp em média (48) 
 
Afectado por: 
 Composição de bases do DNA 
 Presença de bases metiladas 
 
 
 
 
 
 
33 
 
Star activity 
 
Staractivity é quando algumas enzimas apresentam relaxamento de especificidade sob 
certas condições experimentais in vitro. 
Por ex. BamHI, em condições de baixa força iónica, reconhece e cliva, para além de 
G/GATCC: 
o N/GATCC 
o G/RATCC 
o G/GNTCC 
 
Condições que contribuem para a actividade “star” de algumas enzimas de restrição 
 
 Concentração elevada de glicerol [>5% v/v] 
 Proporção Enzima/DNA elevada [Variável para diferentes enzimas, 
normalmente >100 U/μg] 
 Força iónica baixa [<25 mM] 
 pH alto [>pH 8.0] 
 Presença de solventes orgânico s[DMSO, etanol, etilenoglicol, 
dimetilacetamida, dimetilformamida] 
 Substituição de Mg++ por outros catiões divalentes [Mn++, Cu++, Co++, Zn++] 
 
 
Subtipos de enzimas de restrição de tipo II 
 
 
 
SalI e SacI originam extremidades compatíveis? 
 
SacI: GAGCTC 
SalI: GTCGAC 
 
BamHI, PsuIe BglII têm extremidades compatíveis? 
Depois de ligar dois fragmentos de DNA, um cortado com BamHI, o outro com PsuI, 
pode-se voltar a cortar com BamHI? 
Depois de ligar dois fragmentos de DNA, um cortado com BamHI, o outro com BglII, 
pode-se voltar a cortar com BamHI ? E com BglII? 
 
34 
 
 
 
Exemplo de um mapa de restrição 
 
 
 
Frequentemente as enzimas de restrição não são eficientes na reacção de hidrólise 
quando a sequência de reconhecimento se encontra demasiado perto da extremidade 
da molécula 
 
 
 A DNA ligase cataliza a formação de ligações fosfodiéster entre grupos terminais 5’-
fosfato e 3’-hidroxilo justapostos, em moléculas de DNA em cadeia dupla, com 
extremidades coesivas ou não. Não tem actividade sobre ácidos nucleicos de cadeia 
simples. 
35 
 
 
 
Reacção catalisada pela DNA ligase: 
 
ATP + (desoxirribonucleótido)n + (desoxirribonucleótido)m= AMP + PPi+ 
(desoxirribonucleótido)n+m 
 
 
 
 
Ligação 
 
 A ligação é a junção de fragmentos de DNA no vector molecular, 
como um plasmídeo ou um bacteriófago, que pode ser replicado 
pela célula hospedeira depois da transformação. A junção ou 
ligação dos fragmentos de DNA é realizado por uma enzima 
conhecida como DNA ligase. 
 
O papel natural da DNA ligase é reparar espaços numa cadeia no 
ligação açúcar – fosfato de uma cadeia dupla de DNA, tal como 
ocorre através de danos no ADN. 
 
A actividade catalítica da enzima necessita da presença de ATP e Mg++. DNAs em que 
falta os resíduos de fosfato, podem ser capazes da ligação por fosforilação da cinase 
polinucleótica T4. A enzima, também, cataliza uma reacção adicional de fosfato entre a 
pirofosfato e ATP. 
 
1. Ligação do DNA, por complementariedade, a terminações coesivas 
 
36 
 
 
2. Reacção de reparação 
 
 
 
 A acção de ligação necessita que o espaço (nick) exponha o 
grupo 3’OH e 5’-fosfato. A digestão com endonucleases de 
restrição corta o DNA dessa forma, por exemplo, deixa o fosfato 
na posição 5’ da desoxirribose. O emparelhamento instável dos 
dois fragmentos de restrição com extremidades compatíveis 
podem, portanto, ser consideradas como moléculas de DNA de 
cadeia dupla com espaços em cada cadeias e, por isso, um 
substrato para a acção da DNA ligase. 
 
 
A T4 DNA Ligase pode ligar extremidades “blunt” mas com 
menor eficiência. 
Algumas DNA ligases, como a T4 DNA ligase (codificada 
pelo bacteriófago T4), é, também, capaz de ligar 
extremidades “blunt”, embora com menos eficiência, 
enquanto outras (a E.coli ligase) não são capazes. Apenas 
se considera a acção da T4 DNA ligase, que é, de longe, a 
mais extensível de se usar. 
Referimos-nos à enzima como T4 ligase (ou só ligase) 
embora é também T4 RNA ligase. 
 
A T4 ligase necessita de ATP como co-substrato. No primeiro passo, a ligase reage com 
o ATP para formar uma enzima covalente, o AMP complexo, que por sua vez reage 
com 5’-fosfato no local do espaço (nick), transferindo o AMP para o grupo fosfato. O 
ultimo passo é o ataque pelo grupo 3’OH, formando uma nova ligação fosfodiéster 
covalente (que restaura a integridade do açúcar-fosfato) e liberta o AMP. A absoluta 
exigência para o 5’-fosfato é extremamente importante; pela remoção do 5’-fosfato, 
consegue-se a prevenção da ocorrência de ligações indesejadas. 
 
 
 
37 
 
Exemplo de remoção do fosfato para impedir ligação 
(religação de vectores) 
Qual a enzima utilizada para remoção do fosfato? 
 
Desde a reacção, que se que quer, normalmente, envolver duas moléculas diferentes 
de DNA (ligação intermolecular), que se espera ser extremamente sensível para a 
concentração de DNA. Portanto, é importante usar altas concentrações de DNA, mas 
que componente de DNA? 
 
Temos dois componentes, o vector e o insert (ignorando por momento, o facto do 
insert pode ser, ele próprio, uma mistura de fragmentos). Existe, portanto, uma 
variedade de possibilidades de reacções que podem ocorrer, assim como, a 
concentração global de DNA, que se pode influenciar a probabilidade destas diferentes 
reacções. 
 
Qual a probabilidade de qualquer destes produtos de reacção ocorrer 
preferencialmente? 
Podemos influenciar o tipo de produto preferencialmente obtido manipulando a 
quantidade e a concentração do DNA? (que DNA?) 
 
A baixas concentrações de DNA, é mais provável ter a junção (por reacção 
intramolecular) de duas extremidades da mesma molécula, desde que a taxa da 
reacção que envolve uma reacção será linearmente relacionado com a concentração, 
assim como, a taxa com dois componentes diferentes, será proporcional ao produto 
das duas concentrações. (ou a reacção que envolve duas moléculas do mesmo 
substrato, a taxa será proporcional ao quadrado da concentração). Portanto, 
aumentando a concentração, será dado um maior aumento da taxa da reacção 
intermolecular (entre duas moléculas) do que numa reacção intramolecular. 
 
 
 
Se aumentar-mos a concentração do vector mas não do insert, teremos um maior 
aumento da ligação entre dois vectores (que não pretendemos) do que na produção 
38 
 
de vector-insert recombinante. Reciprocamente, aumentando a concentração do 
insert, teremos um aumento dos níveis de dímeros insert-insert (que, também, não 
pretendemos, apesar de serem de menor problema como não vão dar origem a 
transformados. 
Assim, não só precisamos de manter a concentração de DNA alta, mas também criar 
um óptima relação vector:insert. Não é fácil prever que relação deve ser, mas 
tipicamente será no intervalo de 3:1 a 1:3. De notar que são as relações molares e tem 
que se ter em conta o tamanho relativo do vector e do insert. Por exemplo, se o vector 
tem 5kb e o insert tem 500 bases, então uma relação molar de 1:1 envolveria 10 vezes 
mais vector, por peso, do que insert (e.x. 500ng de vector e 50 ng de insert). 
Reciprocamente, para o mesmo vector mas um vector com tamanho de 50kb, se 
usarmos 500ng de vector, precisaríamos de 5µg de insert para alcançar a relação molar 
de 1:1. No geral, para converter a quantidade de DNA por peso num valor que pode 
ser usado para calcular a relação molar, dividimos a quantidade usada (por peso) pelo 
tamanho do DNA. Assim, se Wv e Wt são os pesos usados para o vector e para o insert 
de DNA, respectivamente, e Sv e St para o tamanho do vector e do insert (e.x. em 
kilobases (kb)), então, a relação vector:insert é (Wv/Sv):(Wt/St). 
 
Exercício 
 
Qual a massa de vector e insert respectivamente com 5 kb e 500 bp, para obter uma 
ligação na proporção molecular de 1:1 (partindo de uma massa de 500 ng de vector)? 
 
Estimada a concentração do vector e do insert pelo gel de agarose ou por 
manuseamento OD. 
Testa-se várias relações vector:insert para descobrir a melhor relação. Na maioria dos 
casos, as melhores relações são de 1:1 ou 1:3. 
 
Formula: 
 
((ng vector) X (tamanho do insert em kb)) / ((tamanho do vector em kb) X (relaçãomolar do vector:insert) = (ng do insert) 
 
Exemplo: 500bp de insert vão ser ligados com 100ng de um vector com 3,0kb numa 
relação de 3:1 
 
((100ng vector) X (0,5kb de insert) / (3,0 kb de vector) X (3/1)) = (50ng insert) 
 
 
 
 
 
 
39 
 
Algumas reacções de ligação possíveis 
 
 
Recombinante Sem insert Fragmentos Sem ligação 
 
Clonagem de fragmentos de DNA 
1. Extremidades protuberantes 
Compromisso - usar concentrações equimolares de plasmídeo e de insert na reacção 
de ligação. 
Não respeitando esta relação: 
 Maior quantidade de plasmídeo religados; 
 Maior quantidade de insert – maior quantidade de plasmídeos contendo 
repetições do insert (insert em tandem) 
 
Verificar que resultados foram obtidos: 
 Análise do DNA recombinante com enzimas de restrição; 
 Sequenciação do DNA recombinante 
 PCR 
 
Necessidade de verificar a orientação do insert inserido 
 
Uma equação para calcular as relações volumétricas necessárias na reacção de ligação 
 
A reacção de ligação é fundamente importante para a Biologia Molecular, activando a 
junção do vector e dos fragmentos do insert de DNA para criar um novo plasmídeo de 
moléculas de DNA. É importante obter a relação correcta de vector:insert para uma 
óptimo geração de plasmídeos recombinantes e para reduzir a formação de ligações 
entre fragmentos, vectores religados, dímeros de plasmídeos e plasmídeos contendo 
múltiplos inserts. 
A ligação de reacção é, normalmente, realizada num volume total de 10-20µL a 4-37ºC 
(muitas vezes em temperatura ambiente) usando a enzima T4 DNA ligase, e um 
tampão que contém Mg2+ e ATP ( tipicamente de uma concentração stock 10 vezes 
maior com a que vamos trabalhar). A T4 DNA ligase cataliza a junção de terminações 
de DNA adjacentes por formação de ligações fosfodiéster usando ATP como cofactor e 
consegue ligar extremidades “blunt” ou coesivas compatíveis. Numa óptima reacção 
de ligação, o objectivo é inserir um único insert num vector, e as concentrações de 
40 
 
insert e vector que devemos utilizar que desfavorecem a formação de um anel 
monomolecular ou concamerico. 
Existentes equações de ligação apenas permite calcular uma relação molar 
vector:insert. Como o tamanho da molécula de DNA é directamente proporcional ao 
seu peso molecular, como equações que não oferecem nenhuma desvantagem sobre a 
simples determinação da relação do tamanho dos fragmentos. As equações descritas 
permite calcular facilmente o volume dos componentes dados na concentração do 
DNA e no tamanho dos fragmentos, tal como a relação molar vector:insert dada é 
alcançada e a reacção consiste nas soluções de DNA ligase, tampão, insert e vector 
DNA se forem necessárias. 
 
Na relação óptima, teórica, insert:vector que se deve-se ter em conta da relação da 
concentração em toda a reacção (i) com a concentração de uma extremidade de uma 
molécula de DNA num volume ocupado por outra extremidade da mesma molécula (j). 
o valor de j é inversamente proporcional ao tamanho do fragmento de DNA e 
independente da concentração do DNA, então, só será fixada para uma ligação dada. 
As variáveis são o total da concentração de DNA e a relação inser:vector. Para 
extremidades coesivas recomenda-se que j:i seja entre 1:1 e 1:3 (20-60ng/µL para 
clonar um vector do tamanho do pUC18) e a relação insert:vector seja 2:1 para o 
máximo rendimento de recombinantes úteis. 
 
Exemplo: 
 
Quanto insert de DNA 0,5kb deve ser adicionado para uma ligação em que 100ng de 
3kb de vector deve ser usado? A relação vector:insert desejada será 1:3 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ligações de DNA podem ser frustantes 
 
A ligação de reacção tem dois passos básicos: 
1. Primeiro as extremidades de DNA têm de colidir por acaso e estarem juntas 
tempo suficiente para que a ligase as ligue. Este é a parte mais ineficiente da 
reacção. 
2. O segundo passo é a reacção enzimática, onde a DNA ligase cataliza a ligação 
de 3’OH com 5’-fosfato. 
 
Primeiro, os nucleótidos da AMP, que estão ligados aos resíduos de lisina na zona 
activa da enzima, são transferidos para o 5’-fosfato. 
41 
 
Depois, a ligação AMP-fosfato é ligado pela 3’OH, formando uma ligação covalente e 
libertando AMP. 
 
 
DNA ligase 
 
A ligação ocorre entre extremidades “blunt” ou extremidades pegajosas (sticky). As 
ligações das extremidades blunt não são eficientes. A ligase espera por um encontro. 
As ligações das extremidades “blunt” são, usualmente, feitas a altas concentrações. 
A ligação das extremidades “sticky” é mais eficiente. Pontes de hidrogénio forma um 
estado estável. 
 
 
Adicionando extremidades “sticky” (linkers) 
 
Linkers – são fragmentos de DNA pequenos de cadeia dupla e com extremidades 
“blunt”. Contém local de restrição de extremidades “sticky”. 
Linkers são, facilmente, adicionados no fim de uma extremidade “blunt” da molécula 
porque conseguem adicionar grandes quantidades. 
 
 Clivagem resulta em extremidades “sticky na molécula. 
 Potencial problema com os linkers 
 Adição de uma cauda homopolímera 
 
42 
 
 
 
O terminal da enzima desoxinucleótidos transferase (ou terminal transferase) adiciona 
nucleótidos na extremidade 3’ do DNA sem necessidade 
de um padrão. 
 
 
 
Desfosforilação 
 
Quando o DNA é tratado com a enzima alcalina fosfatase, os grupos 5’-fosfato são 
removidos. 
 
 
Se um vector linearlizado é desfosforilado, ele não consegue religar-se porque a 
enzima T4 DNA ligase necessita do grupo 5’-
fosfato presente. O fragmento de DNA em que o 
grupo 5’-fosfato encontra-se presente consegue 
formar uma ponte entre a extremidade 
desfosforilada e a inserção é favorecida. 
43 
 
Quando se tenta combinar duas moléculas, o grupo 5’-fosfato retirado não permite 
religar-se e estraga a construção. 
 
O que temos no fim: existe dois grandes espaços (nick) no produto final, porque duas 
das quatro ligações são prevenidas pela falta de 5’fosfato. A bactéria irá fixar os 
espaços depois do DNA ser transformado. 
 
DNA circular fechado covalentemente e DNA supercoiled 
 
O DNA de cadeia dupla circular fechado covalentemente é mostrado 
esquematicamente. A não ser uma das duas cadeias de DNA que fica com espaços, a 
torção da cadeia da hélice dupla não pode relaxar e a tensão induz uma formação 
espontânea de uma estrutura super enrolada mostrada à direita. 
O espaçamento de outra cadeia de DNA, alivia a tensão permitindo a rotação na 
extremidade livre. 
 
 
Clonagem de vectores plasmídicos 
 
Clonagem 
 
É a inserção de DNA de interesse num vector de clonagem capaz de replicação 
independente, e da respectiva propagação em células hospedeiro. Há muitos tipos de 
vectores de clonagem mas os mais usados são os plasmídeos. 
 
Os plasmídeos mais usados são aqueles que se 
multiplicam em Escherichia coli 
 Moléculas circulares de dsDNA 
 1,2–3kbp (máx.20kbp) 
 Capacidade de duplicação independente 
 
 
 
 
 
44 
 
Recombinação de plasmídeos 
 
1. Plasmídeo e DNA a clonar são cortados com a(s) mesma(s 
)enzima(s) de restrição 
 
2. Plasmídeo pode ser tratado com fosfatasealcalina que 
remove os grupos fosfato das extremidades 5’ do DNA, 
gerando grupos hidroxilo, impedindo assim a religação das 
duas extremidades do plasmídeo na presença da ligase. 
 
3. Incuba-se o DNA e o plasmídeo, na presença de ligase. 
 
 
Transformação 
 
É incubação de uma suspensão de E. coli competentes (células tratadas de modo a 
incorporarem mais facilmente DNA) com a reacçãode ligação. 
 
 
 
Selecção de células transformadas com gene de resistência a um antibiótico 
 
 
45 
 
Características básicas dos plasmídeos 
 
Origem de replicação (ORI) – permite a replicação do 
plasmídeo independentemente do DNA genómico. 
Local múltiplo de clonagem (MCS) – permite a inserção do 
fragmento a clonar–grande número de locais únicos de 
restrição. 
Marcador de selecção – permite seleccionar os hospedeiros 
que incorporaram o DNA “estranho” (ex: gene que confere 
resistência a um antibiótico, como a ampicilina) 
 
O controlo do número de cópias de plasmídeo/célula é feito pela origem de replicação: 
1 a mais de 100 cópias/célula. 
De um modo geral, os plasmídeos contêm uma só ORI, à qual estão associados 
elementos reguladores, que constituem uma “unidade genética” designada por 
Replicão. 
 
A maioria dos plasmídeos em uso possui um replicão derivado do pMB1 ou do ColE1, e 
que permite a manutenção de mais de 15 plasmídeos/célula – plasmídeos de controlo 
relaxado (ou “High-copyplasmids”) 
 
 
 
Plasmídeos de controlo restrito ou “Low-copy plasmids” 
 1 a 5 cópias/célula 
 São menos utilizados na biologia molecular, mas são úteis quando a presença 
de um número elevado de plasmídeos ou dos seus produtos é deletéria para o 
hospedeiro. 
 
Marcadores de selecção 
 
São genes, localizados no plasmídeo, que codificam proteínas relacionadas com a 
selecção das células transformadas. 
O mais comum é a resistência a antibióticos – quando as células são crescidas em 
meios de cultura, contendo um determinado antibiótico, apenas as que contêm o 
plasmídeo que confere resistência a esse antibiótico é que sobrevivem. 
46 
 
Os antibióticos não podem ser autoclavados. Habitualmente as soluções de 
antibióticos são esterilizadas por filtração (tamanho de poro 0,22 μm) e guardadas em 
alíquotas a -20 °C. 
São adicionados aos meios de cultura a temperaturas inferiores a 65 °C 
 
Antibióticos e genes resistentes a antibióticos 
 
 
 
Clonagem de fragmentos de DNA 
 
1. Extremidades protuberantes 
São os mais fáceis de clonar, uma vez que as 
extremidades foram criadas pela mesma enzima de 
restrição, deixando 1 a 6 nucleótidos em cadeia simples, que 
emparelharão com outros existentes no outro fragmento de 
DNA 
 
 
a) Usando uma enzima de restrição 
 
O DNA alvo pode ser introduzido no plasmídeo numa 
determinada orientação ou na orientação oposta. 
As moléculas de DNA recombinantes formadas correspondem a 
inúmeros produtos formados durante a reacção de ligação, entre 
os quais: plasmídeo vazio, produtos lineares ou circulares de 
plasmídeo/insert; plasmídeo/plasmídeo; insert/insert; 
plasmídeo/insert/insert; entre outros... 
Nos plasmídeos recombinantes o local de restrição usado deixa 
de ser único. 
47 
 
Compromisso – usar concentrações equimolares de plasmídeo e de insert na reacção 
de ligação. 
 
Não respeitando esta relação: maior quantidade de plasmídeo 
 Maior quantidade de plasmídeos religados 
 maior quantidade de insert - maior quantidade de plasmídeos contendo 
repetições do insert (inser tem tandem). 
 
Verificar que resultados foram obtidos: 
 Análise do DNA recombinante com enzimas de restrição 
 Sequenciação do DNA recombinante 
 PCR 
 
Necessário verificar a orientação do DNA inserido. 
 
b) Usando duas enzimas de restrição com extremidade incompatíveis (clonagem 
direccional) 
 
Permite aumentar o rendimento de moléculas recombinantes com inserção de um só 
fragmento 
 
 
 
Clonagem direccional usando enzimas de restrição com extremidades compatíveis 
Qualquer DNA alvo cortado com BamHI e com BglII pode entrar no 
plasmídeo em qualquer direcção, se este também tiver sido cortado 
com ambas as enzimas. 
Contudo, se uma das enzimas de restrição for incluída na reacção de 
ligação (ou se a enzima for usada para digerir o plasmideo 
recombinante antes da transformação) só as ligações BamHI/BglII (e 
vice-versa) darão origem a produtos recombinantes em E. coli 
 
 
 
48 
 
Extremidades 3’-A protuberantes de produtos de PCR obtidos com Taq DNA 
polimerase (TA cloning) 
 
A Taq DNA polimerase adiciona extremidades protuberantes 3’-A a cada extremidade 
dos produtos formados. Estes podem ser usados para inserirem vectores TA os quais 
possuem extremidades protuberantes 3’-T 
 
 
2. Extremidades em cadeia dupla (blunt-end cloning) 
 Comparativamente às anteriores é bastante menos eficiente. 
 Se razão molar plasmídeo/DNA alvo muito alta >> plasmídeos vazios 
 Se plasmídeo/DNA alvo >> muito baixa >> homo- e heteropolímeros de 
composição e orientação várias. 
 (A orientação e número de inserts em cada plasmideo recombinante 
têm sempre que ser validados por análise de restrição ou por qualquer 
outro processo) 
 Melhores resultados podem ser obtidos com quantidades equimolares 
de plasmídeo e de DNA alvo, com concentração total de DNA < 
100μg/ml 
 
 
 
 
 O pBR322 foi o primeiro plasmídeo a ser largamente usado pela comunidade 
científica: uma origem de replicação, um local de clonagem (BamHI), e dois genes de 
resistência a antibióticos. Permitiu identificar recombinantes por selecção negativa. 
 
49 
 
 
 
 
 Os plasmídeos de clonagem pUC constituíram um novo 
grande avanço nos métodos de clonagem. São derivados do 
pBR322 pela substituição do gene de resistência à 
tetraciclina por um segmento génico que codifica para 
parte da enzima beta-galactosidase. Podem ser usados em 
estirpes de E. coli que expressem a região carboxi-terminal 
da beta-galactosidase 
 
Regulação negativa do operão lac 
 
 
Indutores do operão lac, tais como o IPTG, 
inactivam a proteína repressora, 
resultando numa des-repressão 
transcricional do operão. 
 
 
A função enzimática da beta-galactosidase 
pode ser reconstituída a partir de dois 
fragmentos polipeptídicos artificiais. Estes 
fragmentos não são funcionais por si só. A 
reconstituição é conhecida por alfa-complementação. Este sistema de 
complementação tem sido usado para monitorizar a clonagem de fragmentos de DNA 
em plasmídeos que contêm locais de restrição na sequência codificante do segmento 
alfa (lac Z’). 
 
Estrutura de uma única sub-unidadeda beta-galactosidase 
evidenciando a região alfa N-terminal (azul) e a região ómega C-
terminal (amarelo). A enzima funcional é um tetrâmero (à 
direita). 
50 
 
 
X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido), um substrato cromogénico da β-
galactosidase. 
 
 
Desenvolvimento de vectores plasmídicos 
 
Três fases do deseenvolvimento de plasmídeos vectores de clonagem 
 
1. Na primeira fase, os vectores que se encontravam disponíveis em 1973-1976 
incluíam pSC101, Co1E1 e pCR1, e todos eles sofriam com dos seguintes 
inconvenientes: 
i. Replicação pobre; 
ii. Realizavam uma selecção inadequada de marcadores; 
iii. Transportavam não mais que dois locais de restrição para a clonagem 
 Esses inconvenientes forma tomados em conta no pBR313, mas era 
desnecessariamente grande, sendo metade do DNA não essencial. 
 O tamanho foi reduzido, dando origem ao pBR322 (4,362kB; ambos pBR313 e 
pBR322 foram produzidos em 1977), que se tornaram populares durante vários 
anos. 
 
2. Na segunda fase, o tamanho do plasmídeo for grandemente reduzido, porque a 
eficiência da transformação é inversamente relacionado com o tamanho do 
vector, e, também, porque grandes plasmídeos replicam um menor número de 
cópias. 
 Um número de derivados do pBR322 foram lançados, que incluía pA 
TI53, pXf3, pBR327, etc. 
 Fizeram uso em resistência a antibióticos para a selecção de clones 
recombinantes.3. A terceira fase do desenvolvimento de vectores incluía: 
i. Incorporação do fragmento de HindI do gene da β-galactosidase para 
permitir a selecção de colónias azuis/branas devido à α-
complementação. (e.x. vectores pUC); 
51 
 
ii. Incorporação de sequências de DNA de uma cadeia simples do fago M 
13, para geração de modelos de DNA de cadeia simples para 
sequenciação. 
iii. Incorporaçao do promotor de sequências de DNA para transcrição in 
vitro (e.x. vectores pGEM); 
iv. Incorporação de promotores de alta expressão para expressão de 
grandes quantidades de proteínas estranhas (e.x. variedade de vectores 
de expressão) 
 
Alfa- complementação 
 
Representação - pUC8 
 
 
 
Os plasmídeos da serie pUC foram construídos por Jeffrey Vieira e Joachim Messing e 
sao derivadosdo pBR322. A região do gene de resistência a tetraciclina foi substituído 
por um segmento de um gene que codifica parte da enzima , dentro do qual foi 
inserida uma série de locais únicos de restrição (The multiple cloning site, MCS). 
 
A β- galactosidase é uma enzima tetramérica que contém quatro cadeias idênticas 
com uma sequência conhecida, cada uma com 1021 aminoácidos. 
 
Descobriu-se que um extracto de uma mutante de escherichia coli com delecção na 
região proximal (a região que codifica para a extremidade N-terminal da β-
galactosidase) do gene lacZ, produz β-galactosidase inactiva. Mas, extractos da espécie 
de Escherichia coli com pontos de mutação fora do segmento restauram a actividade. 
 
Um pequeno péptido LacZ a é codificado pelo 
plasmídeo enquanto o grande LacZ é 
codificado em trans pelo cromossoma bacterial. 
 
O processo de α-complementação é uma 
restauração da actividade que ocorre quando os 
extractos de mutantes do operador proximal 
52 
 
LacZ tal como lacZM15 e lacZM122 (aceptores) são misturados com extractos de 
mutantes de terminação LacZ (dadores) que têm uma região operador proximal 
intacta. 
 
Quando os fragmentos de DNA são inseridos no vector, a produção de LacZ é activada 
e as células exibem acrtividade de β-galactosidase. 
 
IPTG é o indutor do operão Lac que inactiva o repressor 
X- gal e o substrato análogo a galactose e quando desdobrado 
produz cor azul 
Monómeros N- terminal e C-terminal quando unidos, 
codificam β- galactosidase, x-gal e desdobrado (actividade 
enzimática). 
 
 
 
 
O resultado final é 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Vectores de expressão 
 
Promotores bacterianos são sequências de DNA às quais se ligam as RNA polimerases. 
Os promotores determinam a polaridade duma sequência determinando qual das duas 
cadeias deve ser transcrita, e são em regra reguláveis, de tal forma que afectam 
fortemente a capacidade de expressar proteínas. As proteínas podem ser produzidas 
em grandes quantidades através da utilização de vectores de expressão: uma 
sequência promotora e uma sequência de ligação aos ribossomas são inseridas no 
vector a montante do MCS. 
 
Agar+ampicilina+X-gal 
 
53 
 
 
 
Os primeiros vectores de expressão desenvolvidos para E. coli usavam o promotor 
regulável lacP 
 
Simples expressão do vector em E.coli. utilizando o promotor lac. 
a) O vector de expressão (plasmídeo) contém um 
fragmento do cromossoma de E.coli, que 
contém o promotor Lac e o gene vizinho LacZ. 
Na presença do análogo de lactose IPTG, a 
RNA polimerase, normalmente, transcreve o 
gene LacZ, produzindo LacZ mRNA, que é 
traduzido para proteína, a β-galactosidase. 
b) O gene LacZ pode ser cortado do vector de 
expressão com enzimas de restrição e 
substituído pelo G-CSF cDNA. Quando o 
plasmídeo resultante é transformado na E.coli, 
a adição de IPTG e a subsequente transcrição 
do promotor Lac produz G-CSF mRNA, que 
traduz a proteína G-CSF. 
 
 
Sistema de expressão procariótico baseado na RNA polimerase do fagoT7 e no 
promotor tardio T7 
 
O cromossoma de uma E.coli (engenharia genética) contém uma cópia do gene da T7 
RNA polimerase debaixo do controlo transcricional do promotor lac. Quando a 
transcrição do promotor lac é induzido pela adição de IPTG, o gene da T7 RNA 
polimerase é transcrito e o mRNA traduzido em enzima. As moléculas da T7 RNA 
polimerase produzidas, iniciam, então, a transcrição, numa grande taxa, do promotor 
tardio T7 no vector de expressão. Cópias múltiplas do vector de expressão estão 
presentes nas células, apesar de que apenas uma cópia encontra-se esquematizado 
aqui. A grande quantidade de mRNA transcrito do cDNA clonado próximo do promtor 
tardio T7 é traduzida, em abundância, em produto proteico. 
 
Vectores de expressão eucarióticos precisam conter sequências regulatórias que sejam 
reconhecidas pelas células de destino. Abaixo, o vector pVKH18En6 contém vários 
elementos regulatórios: melhorador de transcriçãox6, promotor 35S do vírus do 
54 
 
mosaico da couve-flor, sequência líder do vírus do mosaico do tabaco (a montante do 
MCS) e o terminador do gene da nopalina sintase (a jusante do MCS). 
 
 
 
Vectores de expressão frequentemente incluem um sistema repórter. Os genes 
repórter podem ser usados para estudar a actividade de um promotor ou para 
monitorizar a expressão de um gene em estudo. 
 
 
O sinal das proteínas fluorescentes é detectável à escala subcelular. 
 
Beta-Glucoronidase (GUS) 
 
GUS é um gene repórter, particularmente usado em plantas na biologia molecular. Vários 
ensaios do gene repórter encontram-se disponíveis, dependendo do substrato que se utiliza. O 
termo GUS refere-se á mais comum técnica histoquímica. 
O susbstrato mais comum da β-glucoronidase é 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide 
(X-Gluc) e o produto de reacção tem uma cor azul clara. 
 
 
 “Tags” são pequenas sequências de 
aminoácidos que se fundem a uma 
proteína de interesse através de técnicas 
de DNA recombinante. (Fusão: 
justaposição de duas sequências 
codificantes “in frame” com o codão de 
iniciação único, e sem codão de 
terminação intermédio). Vantagem dos 
“tags”: mais anticorpos disponíveis. 
 
55 
 
Proteínas de fusão 
 
São as proteínas criadas com a junção de dois ou mais genes do qual codificou 
originalmente para proteínas separadas 
A inserção de DNA alvo no MCS provoca a respectiva 
fusão com a sequência codificante do gene lacZ. O IPTG 
induz o promotor lacP, resultando na produção de uma 
proteína híbrida. 
 
 
 
 
As proteínas de fusão têm vantagens e desvantagens relativamente ao uso de tags. 
 
Desvantagens Vantagens 
Perda de actividade biológica/função da 
proteína (e/ou do repórter) 
Não são necessários anticorpos 
Alteração da localização subcelular nativa 
Processamento da proteína defeituoso 
Toxicidade 
 
Sobre-expressão 
 
Sobre-expressão - Experimentalmente, uma proteína pode ser expressa em 
quantidades elevadas. Isto pode ser atingido aumentando o número de cópias de um 
gene, ou colocando o gene sob a acção de um promotor constitutivo forte. 
 
1. Estudar a função de uma proteína (normalmente endógena) 
2. Produção de uma dada proteína em quantidades acrescidas para purificação 
(proteína endógena ou não, normalmente se eucariótica usam-se sistemas de 
expressão eucarióticos: leveduras, plantas). 
 
Reacção em cadeia de polimerase (PCR) 
 
A reacção em cadeia de polimerase é: 
 
 Um processo para multiplicar selectivamente um determinado segmento de 
DNA; 
 Esse segmento pode representar uma pequena parte de uma mistura complexa 
de DNAs (por ex. um determinado exão numa preparação de DNA genómico 
total), 
 Através da PCR podemos obter uma quantidade abundante de DNA em cerca 
de 2 horas, 
 A preparação de DNA alvo não precisa ser pura, 
 Pode amplificar-se uma única cópia de DNA alvo (por ex. uma sequência 
específica em uma única célula haplóide). 
56 
 
 
A reacção dePCR envolve componentes obrigatórios, que são são: 
 DNA, ou seja, a sequência de DNA que queremos amplificar 
 DNA polimerase, enzima estável no calor que cataliza a síntese do novo DNA 
 Primer direito (“reverse”) 
 Primer esquerdo (“forward”) 
 dNTPs (nucleótidos), que constroem o novo DNA 
 Solução tampão 
 Mg2+ 
 
Os componentes chave da Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) já eram todos 
conhecidos previamente, só faltando juntar as peças do puzzle. 
 
DNA polimerases 
 
As DNA polimerases para funcionarem necessitam de uma cadeia molde. Estas 
incorporam nucleótidos na direcção 5’-3’, nunca na direcção oposta, mas incorporam 
os nucleótidos numa cadeia já existente, mas não a iniciam. 
 
 
Duplicação de DNA in vivo vs PCR 
 
Para separar as duas cadeias: 
 Helicases e Topoisomerases 
 
 
 
 
 
Para iniciar a nova cadeia: 
 Primers de RNA sintetisados por uma RNA 
polimerase 
 Primers de DNA sintéticos 
 
 
Ciclos do PCR 
 
Cada 30 a 40 ciclos compreende: 
 Desnaturação. Reacção a uma temperatura de 95ºc durante 60 segundos. A 
cadeia dupla de DNA separa-se, ficando duas cadeias simples e toda as 
reacções enzimáticas param. 
 Emparelhamento dos primers. Ocorre a uma temperatura de 55ºC a 60ºC 
durante 45 segundos. As pontes de hidrogénio são constantemente formadas e 
57 
 
quebradas entre a cadeia do primer e a cadeia de DNA. Se os primers são 
complementares com a cadeia de DNA, as pontes de hidrogénio são fortes e o 
primer fica ligado. 
 Extensão, a uma temperatura de 72ºC durante minutos pois depende do 
tamanho do produto. As bases (complementares da cadeia de DNA) são ligadas 
ao primer no lado 3’ ( a Taq polimerase adiciona dNTP’s de 5’ para 3’, lendo o 
DNA de 3’ para 5’, complementar ao DNA). Vão sendo adicionados nucleótidos 
até amplificar toda a cadeia molde. 
 
1º ciclo – parte 1 
 
1º ciclo – parte 2 
 
 
2º ciclo – parte 1 
 
 
2º Ciclo – parte 2 
 
3º ciclo – parte 1 
 
3º ciclo – parte 2 
 
 
 
 
58 
 
Eficiência do PCR 
 
Todo o ciclo resulta na duplicação do número das cadeias de DNA. 
Depois do primeiro ciclo, a maioria do produto das cadeias de DNA são do mesmo 
tamanho que a distancia entre os primers. 
O resultado é uma dramática amplificação do segmento de DNA entre os primers. A 
quantidade da amplificação é 2n, onde n é o número de ciclos efectuados (1 milhão 
após 20 ciclos). 
 
O sucesso de uma reacção de PCR depende de inúmeros factores 
 
Os factores para uma reacção de PCR com sucesso são: 
 Oligonucleótidos: especificidade, tamanho, etc. 
 Concentração de cada oligonucleótido: 0,1-0,5 µM(0,2 µM) 
 Concentração de DNA molde: depende do tipo de DNA (genómico, plasmídeo, 
cDNA) 
 Concentração de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): (200 µM) 
 DNA polimerase: conc. (0,5 U)e tipo (Taq) 
 Mg2+: 1-4 mM (2 mM) 
 Composição do tampão e aditivos: DMSO, glicerol, detergentes 
 
Thermus aquaticus (Taq) DNA polimerase 
 
Uma DNA polimerase termoestável, utilizada na amplificação de fragmentos de DNA 
através da técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido identificada pela primeira 
vez na bactéria Thermus aquaticus, uma extremófila encontrada em fontes 
hidrotermais. A Taq polimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, 
tendo uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a 95ºC). 
 
A Taq polimerase tem a desvantagem de ter uma fidelidade relativamente baixa, ou seja, ao 
fabricar segmentos de DNA durante o processo de PCR pode incorporar nucleótidos errados. 
 
 
Quantidade de amplificado versus número de ciclos 
 
Aumentar o número de ciclos para mais de 35, como por exemplo 40, tem pouco 
efeito benéfico. 
 
O plateau ocorre quando: 
 Os reagentes se esgotam 
 Os produtos re-emparelham 
 A polimerase se degrada 
59 
 
Podemos obter, também, produtos indesejáveis acumulados. 
 
Fidelidade da Taq. 
 
Os erros são importantes? 
 
 A TaqDNA polymerase não possui actividade de revisão (proof-reading) da 
cadeia 3´→5´ (frequentemente encontrada em outras DNA polimerases) 
 A Taq tem uma taxa de erro na ordem dos10-4-10-5 (dependendo do método de 
aferição). 
 Produtos parciais contendo erros são amplificados pelos subsequentes ciclos de 
PCR; 
 Num amplificado de 400 bp, 33% das moléculas poderão conter1 erro (após20 
ciclos). 
 A distribuição dos erros é aleatória. 
 Outras DNA polimerases com actividade de revisão da cadeia apresentam taxas 
de erro até 10-7 (ex: Pfu, Tgo, Pwo, etc.) 
 
Análise dos Produtos de PCR 
 
A análise dos produtos de PCR é: 
 Em regra, por electroforese em gel de agarose (validação por tamanho; falível) 
 Por vezes, por técnicas de hibridação com sondas (dot-blot, etc.) 
 Sequenciação 
 
Optimização do PCR 
 
Para optimizar-mos a reacção de PCR, temos que ter em conta ao: 
 Tamanho do alvo; 
 Concentrações; 
 Parâmetros do ciclo de PCR 
o Tempo 
o Temperatura 
 Desenho dos primers 
 
Notas gerais para o desenho de primers 
 
Primers ou inciadores de uma reacção de PCR são oligonucleotídeos curtos em cadeia 
simples que emparelham com DNA e promovem a síntese de uma cadeia 
complementar na presença de DNA polimerase. 
Para a amplificação de um fragmento de DNA é sempre necessário estarem presentes 
dois primers, cada um deles complementares e flanqueando a região do DNA que 
queremos. 
 
 
 
60 
 
Temos que ter em conta: 
 Especificidade 
 Comprimento 
 Tm 
 Sequências internas de complementaridade 
 Conteúdo em G/C 
 Polipirimidinas (T,C) ou polipurinas (A,G) 
 Terminação 3’ 
 
Especificidade 
 
Uma reacção de PCR é uma reacção extremamente sensível capaz de amplificar um 
único fragmento de DNA contido numa mistura de reacção complexa. Esta capacidade 
depende da especificidade dos primers para realizar essa amplificação. 
Idealmente os primers serão apenas complementares a uma única sequência alvo que 
se pretende amplificar. Contudo, em muitos casos poderá haver outras sequências que 
apresentam complementaridade com os primers em diferentes graus. Um bom primer 
será apenas complementar com a sequência alvo ou com um número reduzido de 
sequências para além desta. Na maior parte dos casos este emparelhamento extra dos 
primers com sequências secundárias não afectará a reacção 
de PCR uma vez que um emparelhamento de um primer 
com uma região isolada do DNA não vai resultar na 
formação de produto amplificado. A amplificação 
geométrica de um fragmento só ocorre quando os primers 
emparelham face a face em cadeias opostas da 
molécula de DNA. 
Comprimento (tamanho do primer) 
Se os primers forem muito curtos para além de emparelharem com a região alvo na 
molécula de DNA têm uma elevada probabilidade de emparelhar adicionalmente com 
centenas de outros locais complementares no genoma. Por outro lado, se forem muito 
longos isso afectará a taxa de emparelhamento na reacção de PCR, uma vez que ela é 
proporcional ao comprimento dos primers. Assim primers muito longos não 
emparelham de modo eficiente o que leva a uma redução da quantidade de produto 
PCR formado. 
Um tamanho de primer que está conforme estes compromissos e que é standard é o 
de 18-24 nucleotídeos, apresentando especificidade e eficiência de emparelhamento 
óptima. 
Tamanho e especificidade de um primer estão interligados 
 
61 
 
Tm (melting temperature) 
 
A estabilidade da estrutura primer-DNA alvo pode ser medida através do seu Tm, o qual 
representa a temperatura para a qual metade das moléculas de DNA numa solução 
está em cadeia dupla e metade está em cadeia simples. 
A temperaturas acima do Tm as moléculas tendem a estar desnaturadas, em cadeia 
simples e a temperaturas abaixo doTm tendem a estar em cadeia dupla. A 
temperatura de desnaturação de uma cadeia dupla de DNA aumenta quer com o seu 
tamanho, quer com o conteúdo em G/C (% de Guaninas + Citosinas em relação ao 
número total de bases). Outros factores numa reacção de PCR têm influência na 
temperatura de desnaturação são o conteúdo em MgCl2, em K
+ ou outros aditivos que 
influenciem a estringência da reacção. 
Numa reacção de PCR a temperatura de emparelhamento tem que ser inferior ao Tm 
dos primers. Por regra, a reacção de emparelhamento ocorre a cerca de 5°C abaixo do 
valor de Tm dos primers. Se a temperatura de emparelhamento numa reacção de PCR 
for muito superior não haverá emparelhamento com a sequência alvo, mas se for 
muito inferior os primers vão emparelhar com muitas outras sequências que não são 
perfeitamente complementares com eles. 
Tendo isto em conta e no que se refere ao desenho de primers, uma consequência 
importante é que os primers desenhados deverão ter valores de Tm semelhantes, 
idealmente dentro de um intervalo de 5°C de diferença um do outro. Quanto mais 
próximos forem os valores de Tm dos primers envolvidos numa reacção de PCR melhor. 
Tm= 2 (A+T) + 4(G+C) 
 
 Fórmula empírica e aproximada 
 Válida para oligonucleótidos de 18-24 bases 
Adicionalmente o Tm dos primers deverá estar entre 55-72°C 
A relação entre Tm e temperatura de emparelhamento não é muito clara. 
 
Temperatura de emparelhamento (tanneling) 
 
A temperatura de emparelhamento é a temperatura para qual os primers emparelham 
com a cadeia de DNA. A temperatura de emparelhamento pode ser determinada a 
partir da temperatura de melting (Tm) 
 
o Tm representa uma estimativa da estabilidade do híbrido DNA-DNA e é crítico 
para a temperatura de emparelhamento (Ta) 
o Ta muito elevada, maior hibridação primer-molde insuficiente e maior produto 
de PCR (amplificado) baixo. 
62 
 
o Ta muito baixa, maior produção de amplificados inespecíficos 
o Deve testar-se experimentalmente em incrementos de 1-2 ºC para cima e para 
baixo do Ta estimado 
o Alguns termocicladores têm função de gradiente de temperatura 
 
Existe uma fórmula: 
 
 
 
Sequências internas de complementaridade 
 
Se os primers tiverem uma sequência de bases complementares entre si, pelo menos 
em parte, emparelharão consigo próprios. Se isto acontece não poderão emparelhar 
com o DNA alvo. Há dois tipos principais de consequências que podem resultar de um 
auto-emparelhamento dos primers: as que resultam nos chamados “hairpins” e as que 
resultam na formação de dímeros. 
1. Hairpins 
Considere-se o primer GGC GGT ATG ATC CCG CTA GTT AC. Pode emparelhar 
internamente formando uma estrutura, como a figura abaixo . 
Deste modo não poderá emparelhar com DNA alvo numa reacção de PCR. Os primers 
têm que ser desenhados de modo a evitar a formação destas estruturas. Existe 
software capaz de analisar a sequência 
dos primers e indicar se existe ou não 
possibilidade de eles serem auto-
complementares. São de evitar primers 
que contenham mais de 3 pares de 
bases intramoleculares, como regra 
geral. 
 
2. Dímeros 
Os dímeros formam-se ou por emparelhamento intermolecular, ou seja 
emparelhamento de bases pertencentes aos dois primers em solução, heterodímeros 
ou por emparelhamento entre as bases de um só primer – autodímeros ou 
homodímeros.O exemplo do primer anterior, GGC GGT ATG ATC CCG CTA GTT AC, 
pode formar vários homodímeros, por exemplo: 
 
 
 
 
5' GGCGGTATGATCCCGCTAGTTAC 
 |||| || || |||| 
3' CATTGATCGCCCTAGTATGGCGG 
 
5' GGCGGTATGATCCCGCTAGTTAC 
 ||| | | ||| 
3' CATTGATCGCCCTAGTATGGCGG 
 
 DNA synthesis 
5' GGCGGTATGATCCCGCTAGTTACcgcc 
 ||| | | ||| 
3' ccgcCATTGATCGCCCTAGTATGGCGG 
63 
 
No exemplo á esquerda a estrutura dimérica é bastante estável, numerosas bases 
estão emparelhadas. No exemplo à direita o auto emparelhamento produz um dímero 
menos estável (há menos bases envolvidas), mas igualmente problemático uma vez 
que as bases na terminação 3’ estão envolvidas no emparelhamento. Quando isto 
acontece o segundo primer pode ser usado como alvo para a síntese de DNA e 
algumas bases extra são adicionadas ao primer, destruindo-lhe a especificidade 
necessária para a amplificação do produto PCR correcto. 
Outro exemplo: 
 
Composição de bases 
 
A composição de bases afecta a hibridização específica, a temperatura de melting e de 
emparelhamento e estabilidade interna. Normalmente tem se mais em conta ao 
conteúdo de G/C. 
 
O conteúdo G/C afecta o Tm dos primers. É pois importante que os primers tenham 
uma composição equilibrada em termos de A/T e G/C. Primers com um conteúdo de 
G/C de 40-60% produzem ligações com o DNA alvo suficientemente estáveis para 
promover amplificação. As ligações G-C contribuem mais para a estabilidade da ligação 
primer-DNA alvo que as ligações A-T, aumentando, pois a temperatura de 
desnaturação. 
 
É ainda importante que o primer não contenha regiões com longas sequências de A/T 
(polipurinas/polipirimidinas) ou G/C (poli G7poliC). No primeiro caso para evitar 
emparelhamentos frágeis e no segundo caso para evitar 
 
Posição 3’-terminal 
 
A presença de G ou C na extremidade 3’ dos primers promove o emparelhamento 
correcto nesta extremidade devido ao maior número de ligações de hidrogénio que se 
estabelecem entre estas duas bases. Contudo, sequências com mais de 3 repetições de 
G ou C devem evitar-se nas primeiras 5 bases da extremidade 3’ do primer devido à 
maior probablilidade de se formarem dímeros. A estabilidade no emparelhamento das 
bases na extremidade 3’ é necessária para que as polimerases possam iniciar a síntese 
de uma nova cadeia. 
Desenho de primers – sumário 
 
1. Idealmente um primer deve ter uma mistura aleatória das 4 bases 
2. Os primers devem ter 18-28 bases de comprimento; 
3. Os primers devem terminar em 3’ em G ou C, ou GC ou CG; 
4. Preferencialmente o Tm dos primers deve situar-se entre 55 e 60 °C 
5. Devem ter um conteúdo de G/C de 40-60%; 
64 
 
6. Devem evitar-se sequências de primers que formem estruturas secundárias, 
como hairpins ou dímeros; 
7. É especialmente importante que as extremidades 3’ dos primers não 
emparelhem entre si 
8. A extremidade 3’ do primer deve conter G e C para promover estabilidade da 
ligação com o DNA molde, mas não conter mais de 3 G ou 3 C; 
Tamanho do produto PCR 
A escolha dos primers determina o tamanho do produto PCR. Se os primers forem 
complementares a região próximas no DNA alvo, então a reacção de PCR formará um 
produto pequeno, se forem complementares a regiões afastadas, o produto PCR sera 
maior. As DNA polimerases, sendo a Taq polimerase a mais vulgarmente utilizada, 
amplificam facilmente produtos até 1000 – 2000 bp. Há outras polimerases capazes 
de amplificar produtos maiores 
Programação do termociclador 
 
 
 
Organização 
 
A organização apresenta três áreas de trabalho 
 
 
 
I II III 
Preparação de soluções e 
reagentes 
 
Distribuição da “Master 
mix” pelos tubos de PCR 
Extracção de DNA das 
amostras e de falsas 
amostras (controlos 
negativos) 
 
Adição dos extractos aos 
tubos de PCR 
 
Abertura dos tubos de PCR 
para análise – 
electroforese e/ou dot-
blot 
 
 
65 
 
PCR Proofreading 
 
Neste tipo de PCR, os componente do PCR continuam a ser os mesmos que no PCR 
comum: 
 Sequência de DNA a amplificar 
 dNTPs 
 Primes 
 Mg 2+ 
 Solução tampão 
 DNA polimerase 
 
 
 
 
No PCR proofreading a DNA polimerase utilizadaé a PFU DNA polimerase em vez da 
Taq polimerase. Isso é devido às desvantagens da Taq polimerase, tais como: 
 Não tem actividade de exonuclease de 3’ → 5’ 
 Baixa actividade de exonuclease de 5’ →3’ 
 Em elevada concentração → aparecimento de produtos não específicos 
 Mispriming e formação de dímeros de primers 
 
 
 
Os factores para a optimização da reacção de PCR são: 
 Tamanho da cadeia molde 
 Concentração da solução tampão e 
Mg 2+ 
 Tempos e temperaturas 
 Desenhos dos primers 
 Número de ciclos 
 
 
Fidelidade 
 
Nesta reacção de PCR, é necessário uma grande fidelidade. Para isso utiliza-se a PFU 
polimerase. 
A PFU DNA polimerase, apresenta as seguintes características: 
Em cada ciclo: 
66 
 
 Isolada do Pyrococcus furiosus 
 Dois tipos: nativa e recombinante 
 Origina produtos PCR com extremidades “blunt” 
 
Vantagens Desvantagens 
Com actividade proofreading 3’ → 5’ Sem actividade de exonuclease de 5’→3’ 
Com actividade de polimerase de 
5’→3’ 
Preço 
Muito termostável dUTP, dITP e primers que contenham estes 
nucleoticos, não podem ser usados no PCR 
Menor taxa de erro 
Maior precisão e fidelidade 
 
High – fidelity PCR 
 
Tem como diferença o uso de proofreading DNA polimerase ou mistura de enzimas 
com a mesma actividade, levando a uma redução de erro durante a amplificação. 
 
Condições que podem alterar a fidelidade: 
 Mg 2+ 
 Concentração desigual de nucleotídeos 
 pH 
 Exposição prolongada da cadeia molde a temperaturas elevadas 
 
Aplicações 
 Clonagem 
 Expressão de genes 
 Estudos de mutagénese 
 
Taq polimerase vs Pfu 
 
DNA polimerases termofílicas 
Aplicações Model
o 
3’→5’ 
exo 
5’→3’ex
o 
Deslocaçã
o da 
cadeia 
Inactivação polimerase 
PCR rotina 
 
 
DNA 
 
 
 
inactiv
o 
 
 
 
Activo 
 
 
 
Inactivo 
Rotação de 
coluna ou 
extracção de 
fenol/clorofórm
io 
Taq 
polimersase 
nativa e 
recombinan
te 
RT-PCR 
DNA 
rotulação 
Sequenciaç
ão de DNA 
Clonagem 
TA 
PCR preciso 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rotação de 
coluna ou 
extracção de 
Pfu DNA 
polimerase 
recombinan
PCR para 
clonagem 
67 
 
de vectores 
com ext. 
blunts 
DNA Activo Inactivo Activo clorofórmio te 
Mutagénes
e local-
específica 
 
 
Pfu Taq polimerase 
Actividade proofreading 3’→5’ Sem actividade proofreading 3’→5’ 
Sem actividade proofreading 5’→3’ Actividade exonuclease de 5’→3’ 
Fidelidade limitada para amplificações 
superiores a 3-6kb 
Baixa fidelidade 
Rendimento PCR menor Para produtos PCR superiores 3kb 
 Em (elevadas) aumento da quantidade de 
produtos não específicos 
 
Para combater as desvantagens de ambas as enzimas, efectua-se uma mistura da Taq 
polimerase com a Pfu para, assim, garantir uma maior fidelidade. 
 
Aumento da fidelidade 
 
 AccuPrime™ Taq DNA Polymerase High Fidelity 
 Mistura de enzimas: Taq DNA Polimerase recombinante, Pyrococcus species 
GB-D Polimerase e PlatinumR Taq Antibody. 
 Proteínas acessórias aumentam hibridação dos primers à cadeia molde 
 DNA 
 
True Start Hot Start Taq DNA Polimerase 
 Activada na fase inicial de desnaturação do PCR. 
 Tempo de activação curto. 
 Hot Start PCR. 
 
 
Variação do PCR onde a reacção de amplificação é iniciada a temperaturas elevadas. 
 
 
 
 
 
68 
 
Hot start PCR vs Standard PCR 
 
 
 
Aumento da eficiência 
 Número de ciclos 
 Quantidade dos reagentes 
 Presença de inibidores 
 Tempo de exposição a elevadas temperaturas 
 
Dream taq DNA polimerase 
 Maior sensibilidade e eficiência 
 Maior tamanho dos produtos PCR 
 
 
RT-PCR Race 
 
Transcriptases reversas dos vírus AMV (“Vírus da 
MieloblastoseAviária”) ou M-MuLV (“Vírus de Moloney 
da Leucemia do Ratinho”) podem ser usadas para 
produzir uma cópia de DNA complementar (cDNA) a 
partir de um molde de RNA, com recurso a primers 
específicos, a oligo(dT)15-18, ou a oligonucleótidos 
aleatórios -oligo(dN)6. 
 
R-T PCR em um passo vs R-T PCR em dois passos 
 
 
69 
 
Estudos de expressão e genes de referência. 
 
Os genes AGP6 e AGP11 são expressos unicamente no grão de pólen (GP) e tubo 
polínico (TP). 
A quantidade de cDNA total usada em cada reacção de PCR deve ser equivalente em 
todas as reacções da experiência. Os genes de referência Ubc9 e Tub4 (housekeeping 
genes) são usados para uniformizar a quantidade de cDNA em cada reacção. 
 
RACE (“Rapid amplification of cDNA ends”) é uma variação de RT-PCR que amplifica 
sequências de cDNA desconhecidas correspondentes às extremidades 5’ ou 3’ do 
mRNA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PCR com primers degenerados para, por ex., isolar uma sequência genica num 
organismo quando só conhecemos a sequência desse gene em organismos 
relacionados; encontrar o maior número possível de sequências, traduzi-las, alinhá-las, 
e procurar motivos conservados. Esses motivos podem ser locais adequados para 
desenhar primers degenerados 
 
 
PCR Multiplex: PCR com 2 a 20 pares de primers 
 
 
 
70 
 
 Verificar sequência dos primers “in silico” para possíveis interacções primer-
primer 
 Testar todos os amplificados separadamente usando o mesmo programa de 
PCR (idealmente não deve haver amplificados inespecíficos) 
 Testar conjuntamente com todos os primers em concentrações equimolares e 
mesmo programa. 
 Se alguns amplificados não aparecem (possivelmente os maiores) aumentar a 
concentração de primers para esses amplificados e limitar para os restantes. 
 Outras variáveis: Temperatura de emparelhamento e extensão, concentração 
de tampão, concentração de enzima, qualidade dNTPs. 
 
 
 
 
PCR “nested” 
 
Efectua duas amplificações sucessivas com um par de primers internos no 2º PCR. 
Origina um aumento da especificidade/validação de produto de PCR. 
 
 
PCR invertido (IPCR) 
 
 
 
 
 
 
 
71 
 
Desenhando oligonucleotídeos degenerados 
 
 
Uma sequência de primer de PCR é denominada de degenerado se alguma das suas 
posições têm várias bases possíveis. 
A degenerência do primer é o número das combinações que a única sequência 
contém. 
Um uso comum dos oligonucleótidos é quando a sequência de aminoácidos da 
proteína é conhecida: 
AspGluGlyPheLeuSerTyrCysTrpLeuProHisGln 
 
Consegue-se uma tradução reversa da sequência para determinar todas sequências de 
nucleótidos possíveis que pode codificar a sequência de aminoácidos. 
AspGluGlyPheLeuSerTyrCysTrpLeuProHisGln 
GATGAAGGTTTTCTTTCTTATTGTTGGCTTCCTCAT 
CAA 
 C G C CT CAGC C C T C C C G 
 A A A A A 
 G G G G G 
 
Podemos seleccionar 14 bases da sequência (em azul) para criar um pequeno conjunto 
de oligonucleótidos degenerados. 
Cada oligonucleótido no conjunto terá uma base mudada num momento. Num total 
de 32 oligonucleótidos únicos serão gerados. 
 TATTGTTGGCTTCC 
 TACTGTTGGCTTCC 
 TATTGCTGGCTTCC 
 TACTGCTGGCTTCC 
 etc. 
 
Quando ordenando os oligonucleótidos degenerados, deixa a companhia saber que 
queremos uma mistura de nucleótidos adicionados numa posição especifica usando o 
código abaixo: 
 
 
 
 
 
 
 
72 
 
Real time PCR 
 
Real-time PCR: uma perspectiva histórica 
 
Higuchi et al. foram os pioneiros na análise da cinética do PCR desenvolvendo um 
sistema que detecta os produtos de PCR à medida que eles se acumulam. Este sistema 
de real-time envolvia brometo de etídio em cada reacção de amplificação, um 
termociclador adaptado para irradiar as amostras com luz UV (fibras ópticas 
transmitem a luz de excitação), e a detecção da fluorescência resultante com uma 
câmara CCD, controlada por um computador. Os produtosde amplificação aumentam 
as quantidades de DNA em cadeia dupla, que se liga ao brometo de etídio, resultando 
num aumento da fluorescência. 
 
Do PCR ao Real-time PCR 
 
Real-time PCR Evolution 
 
 
O PCR revolucionou completamente a detecção de ácidos nucleicos, em que a 
vantagem mais evidente foi a possibilidade de, a partir de uma simples cópia de RNA 
ou DNA, uma dada sequência ser especificamente amplificada e detectada. O PCR 
tradicional tem evoluído para, em vez de detectar os produtos de PCR no final da 
reacção, permitir um acompanhamento da formação dos produtos de reacção à 
medida que a reacção ocorre. O gráfico obtido por real-time PCR, que relaciona o 
aumento da fluorescência com o número de ciclos, ilustra de forma mais completa o 
processo de PCR, não avaliando a acumulação de produto de PCR apenas após um 
determinado número de ciclos, como o tradicionalmente usado. 
 
Análise “semi-quantitativa” em gel de agarose 
 
 Análise baseada no tamanho dos fragmentos; 
 Baixa resolução; 
 Brometo de etídio não fornece uma análise quantitativa; 
 Baixa precisão; 
 Baixa sensibilidade 
 Discriminação de tamanho de fragmentos 
 Taxa de dinâmica baixa 
 
73 
 
Métodos tradicionais usam o gel de agarose para a detecção de produtos de 
amplificação ao fim de “n” ciclos de reacção ou apenas no final da reacção de PCR. Este 
método tradicional, para além de demoroso, oferece resultados apenas baseados na 
discriminação do tamanho, o que não é muito preciso. O gel 
de agarose, tal como é ilustrado na figura, não permite 
distinguir muito bem uma banda com 10 cópias de uma com 
50 cópias, conseguindo apenas distinguir bandas com cerca 
de 10x mais fragmentos de DNA do que outra. Já o Real-
time PCR consegue detectar variações de 2x na quantidade 
de DNA. 
Mas o problema mais grave nos métodos tradicionais de 
PCR reside nas ilações erróneas que podem surgir da análise 
dos produtos de PCR quando se atinge a fase de “plateau”. Como sabemos, uma 
reacção de PCR pode ser descrita em quatro maiores fases: uma fase linear 
(normalmente os primeiros 10 a 15 ciclos), uma fase exponencial, em que a duplicação 
ocorre em cada ciclo (assumindo uma eficiência de reacção a 100 %), uma fase linear, 
em que os componentes da reacção estão a ser consumidos e a reacção é mais lenta e 
em que os produtos começam a degradar-
se, e uma fase de “plateau”, onde ocorre o 
“end-point”, e a detecção por métodos 
tradicionais em gel de agarose. Na fase de 
“plateau”, os reagentes esgotam-se, os 
produtos reemparelham e a polimerase 
perde a sua actividade. A quantificação de 
DNA por métodos tradicionais ocorre no 
final do PCR, muitas vezes quando a fase de 
“plateau” é atingida. Mas, como é 
demonstrado pela primeira figura, três amostras semelhantes, que começam com a 
mesma quantidade de DNA, têm quantidades diferentes na fase de “plateau”. Da 
mesma maneira, o PCR de amostras diferentemente diluídas mostra que a fase de 
“plateau” pode ser atingida ao mesmo tempo em toda a gama de amostras com 
diferentes diluições, reforçando que as medições efectuadas na fase de “plateau” não 
reflectem a quantidade inicial de amostra existente. Por isso, é mais preciso fazer 
medições durante a fase exponencial, onde as amostras são amplificadas 
exponencialmente. É esta a área de detecção para real-time PCR. 
 
 
 
Ct – número de ciclos em que o produto 
amplificados têm um rendimento para 
um sinal de fluorescência detectável. 
Ciclo onde a reacção cruza o limiar de 
detecção 
Baseline – fase onde a intensidade do 
sinal do produto amplificado ainda não 
ultrapassa a intensidade da fluorescência 
encontrada no meio 
74 
 
Threshold – nível de fluorescência onde a reacção é detectada durante a fase 
exponencial. Linha de comparação entre amostras. 
 
Rn – sinal do repórter dividido pelo sinal de referência passiva (sinal do Rox). 
Normalização empregada para corrigir erros de pipetagem. 
 
Princípios do Real-time PCR 
 
Real-Time PCR monitoriza a fluorescência emitida durante a reacção como indicador 
dos produtos de amplificação em cada ciclo PCR (em tempo real), em oposição à 
detecção no final da reacção. 
 
 Permite detecção da fluorescência associada à amplificação, em cada ciclo, 
durante o PCR; 
 Análise com recurso a software; 
 Não é necessária a análise do produto em gel de electroforese no final do PCR. 
 
O real-time PCR (também designado por qPCR) permite detectar e quantificar ácidos 
nucleicos em tempo real enquanto são amplificados, mesmo que em fases iniciais da 
reacção, sem a necessidade de realizar purificações e análises adicionais. Baseado na 
detecção e quantificação de repórteres fluorescentes, o primeiro aumento significativo 
do produto de PCR correlaciona-se com a quantidade inicial da amostra. Portanto, 
para se detectar o número do produto de PCR ao longo de cada ciclo, é necessário 
marcar o DNA amplificado com algum tipo de molécula fluorescente (Ex: SYBR Green e 
TaqMan…). O real-time PCR permite obter resultados rápidos, precisos e fiáveis. A 
quantificação decorre na fase exponencial dos produtos de PCR. Usando sequências 
específicas de primers, o número relativo de cópias de uma determinada sequência de 
DNA ou RNA pode ser determinada. O termo relativo é aqui usado uma vez que a 
técnica compara números de cópias entre tecidos, organismos, ou diferentes genes 
relativamente a “housekeeping genes”. 
 
Como funciona o Real-time PCR? 
 
-Instrumentos: um termociclador para a amplificação, uma 
fonte luminosa para que ocorra a excitação das sondas 
fluorescentes, uma câmara para registo e um computador 
para analisar os dados. A fonte luminosa é apenas uma 
lâmpada de halogénio que ilumina a amostra através de 
cinco diferentes filtros de excitação. Uma câmara CCD é 
posicionada por debaixo das amostras e regista a 
fluorescência. Algumas marcas e modelos utilizam uma 
cabeça de leitura que se move sobre a fluorescência da placa, excitando e lendo a 
fluorescência nos poços individualmente. 
 
 
 
 
75 
 
Há vários métodos para marcar o DNA amplificado: 
 
1. Através de sondas que emparelham com o DNA alvo entre os primes (ex. 
5’nuclease assay) 
 
 
 
 
Dois dyes fluorescentes, um repórter e um quencher, são ligados de 5’ para 3’ na 
sonda. Depois de separados do quencher, o repórter dye emite uma característica 
fluorescente. 
Quando ambos os dyes são ligados à sonda, o repórter dye emite o seu quenched. 
 
Permite detectar apenas produtos específicos de amplificação. Um oligonucleotídio 
(ex: sonda TaqMan) é adicionado à mistura de reagentes de PCR. A sonda emparelha 
com a sequência alvo entre o primer foward e o reverse. Quando a DNA polimerase 
atinge a sonda, a sua actividade de exonuclease permite-lhe degradar a sonda, 
permitindo que a extensão a partir dos primers continue até ao final da cadeia. Novas 
moléculas repórter são “desligadas” das suas respectivas sondas a cada ciclo de PCR, 
aumentando a intensidade de fluorescência, que é proporcional à quantidade de 
produto amplificado produzido. 
 
 Holland et al. foram os primeiros a demonstrar que a clivagem da sonda alvo durante 
o PCR pela actividade de 5´nuclease da Taq DNA polimerase pode ser usada para 
detectar a amplificação de produto alvo específico. Para além dos componentes típicos 
para a amplificação, as reacções incluíam uma sonda marcada com 32P na 
extremidade 5´e bloqueada na extremidade 3´, por isso não podendo ser utilizado 
como primer. Durante a amplificação, o emparelhamento da sonda à sua sequência 
alvo gerava um substrato que era digerido pela actividade de 5´nuclease da Taq DNA 
polimerase quando a enzima atingia a região da sonda. Esta dependência de 
polimerização assegura que a clivagem da sonda ocorra apenas se a sequência alvo 
estiver a ser amplificada.Depois do PCR, Holland et al. mediam a clivagem da sonda usavam os princípios da 
cromatografia para separar os fragmentos digeridos das sondas intactas. 
76 
 
O desenvolvimento de sondas fluorogénicas por Lee et al. tornaram possivel eliminar o 
processamento pós-PCR para a análise da degradação da sonda. A sonda é um 
oligonucleotídeo com um “reporter fluorescent dye” e um “quencher dye”. Enquanto 
a sonda está intacta, a proximidade do “quencher” reduz a fluorescência emitida pelo 
“reporter dye”. Esta técnica chama-se FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer). 
Quando um corante de alta energia está próximo de um corante de baixa energia, há 
uma transferência de energia do maior para o menor. 
 
2. “Double-Stranded DNA Binding Dyes”. 
 
 Quando o DNA é desnaturado, o SYBR Green Dye fica livre; 
 A fase de extensão inicia-se com o emparelhamento dos primers 
 A polimerização é completa. SYBR Green Dye liga-se ao produto de cadeia 
dupla e fluoresce. 
 
Pequenas moléculas ligam-se às cadeias duplas de DNA. Higuchi et al. usaram brometo 
de etídio para o seu real-time PCR (ver slide 2). Independentemente do mecanismo de 
ligação, há dois requisitos para que o corante possa ser aplicado para detecção em 
Real-time PCR: aumento da fluorescência quando ligados às moléculas de DNA em 
cadeia dupla e a não inibição do PCR. 
 
SYBR Green é um corante que se liga à “minor groove” da cadeia dupla de DNA. 
Quando SYBR Green se liga à cadeia dupla do DNA, a intensidade da emissão de 
fluorescência aumenta. Quantos mais produtos de amplificação em cadeia dupla 
forem produzidos, maior será o sinal de SYBR Green. 
No entanto, SYBR Green liga-se a qualquer molécula de DNA em cadeia dupla, 
enquanto que o método de 5´nuclease é específico para um alvo pré-determinado. A 
vantagem das sondas fluorogénicas sobre “DNA binding dyes” é que o 
emparelhamento entre a sonda e o alvo é necessário para gerar o sinal fluorescente. 
Por isso, com as sondas fluorogénicas, artefactos devido a amplificação não-específica 
por “mis-priming” ou “primer-dimer” não gera sinal, enquanto que “DNA binding 
dyes” não é específico, podendo conduzir a falsos positivos. 
 
Análise dos resultados 
 
As curvas de amplificação traçam a acumulação de emissão de fluorescência em cada 
ciclo de reacção. Cada curva pode ser dividida em diferentes fases: uma fase linear, 
uma fase exponencial, uma fase log-linear e fase de plateau. Rn diz respeito à 
intensidade da emissão de fluorescência; 
O aumento do sinal do repórter é capturado por instrumentos que detectam a 
sequência e processado por um software. A quantidade do sinal do repórter é 
proporcional à quantidade de produto gerada pela amostra dada. A linha que 
representa o “limiar” é o nível de detecção ou o ponto no qual a reacção atinge a 
intensidade fluorescente acima do “background fluorescence”. O ciclo no qual a 
amostra atinge este nível chama-se “cycle threshold, Ct”. 
Quanto mais alto for o número de cópias iniciais de ácido nucleico, mais rapidamente 
se dá um aumento significativo na fluorescência e mais baixo o valor Ct. 
77 
 
Um gráfico de amplificação relaciona o sinal de fluorescência com o número de ciclos. 
Nos ciclos iniciais de PCR há pouca variação no sinal de fluorescência, o que define o 
valor “limiar” do gráfico de amplificação. Um aumento da fluorescência acima do 
“limiar” detecta a acumulação de produto de PCR. 
Tal como é possivel ver pelo gráfico, os primeiros ciclos de PCR são caracterizados por 
um aumento exponencial dos produtos de PCR. À medida que os componentes de 
reacção se tornam limitantes, a taxa de amplificação decai quando a fase plateau é 
atingida. 
 
 
 
De 5 séries de diluição resultaram fases de plateau semelhantes mas fases 
exponenciais bastante distintas, reforçando o facto de, se as quantificações forem 
realizadas na fase de plateau, os dados não representarão as verdadeiras quantidades 
iniciais de cada amostra. 
 
One-Step ou Two-Step real-time RT-PCR 
 
 One-step real-time RT-PCR” efectua a reacção de transcrição reversa e PCR no 
mesmo sistema tampão e num tubo; 
 Em “two-step RT-PCR” estes dois passos são realizados separadamente em 
tubos diferentes. 
 
Utilizado para quantificar o mRNA, o real-time PCR pode ser realizado numa reacção 
que envolve um só passo, onde toda a reacção de síntese de cDNA para amplificação 
por PCR é realizada num único tubo, ou através de uma reacção de PCR em dois 
passos, onde ocorrem separadamente a transcrição reversa e a amplificação por PCR. 
Há muitos prós e contras associados a cada método. O primeiro foi pensado para 
minimizar a variação experimental, um vez que ambas as reacções enzimáticas 
ocorrem no mesmo tubo. No entanto, este método usa RNA como amostra inicial, que 
pode sofrer uma degradação se não for convenientemente manipulado. O real-time 
RT-PCR em dois passos separa a reacção de transcrição reversa da reacção de PCR. 
 
 
 
 
 
 
78 
 
Vantagens e desvantagens relativamente a métodos tradicionais 
 
Vantagens Desvantagens 
Resultados não são influenciados por 
amplificação não específica 
Não é um método ideal para um PCR 
multiplex (isto é, com 2 a 20 pares de 
primers) 
Amplificação é monitorizada em tempo-
real 
Custo do equipamento elevado 
 
Baixo risco de contaminação O número de produtos detectados é 
limitado pelo número de fluróforos 
Não é muito mais caro do que o PCR 
convencional, excepto o equipamento 
 
 
Aplicações do real-time PCR: 
 
1. Quantificação viral; 
2. Quantificação da expressão genética; 
3. Drug Therapy Efficacy; 
4. DNA Damage measurement 
5. Detecção de patogénicos; 
6. Genotipagem; 
7. Detecção de metilação 
8. Discriminação alélica 
 
Microarrays 
 
DNA microarrays são microslides de vidro ou membranas de nylon que contém 
amostras de DNA (DNA genómico, cDNA ou oligonucleóticos) numa matriz de duas 
dimensões. 
 
DNA microarrays podem ser utilizados para analisar: 
 Expressão genica; 
 Clones genómicos 
 Detecção de polimorfismos de nucleótidos (SNPs) 
 
Os métodos tradicionais da Biologia Molecular, normalmente, trabalham com um gene 
numa única experiencia, que significa que é muito limitado e a “figura toda” da função 
de um gene é muito difícil de obter. 
 
No passado, uma nova tecnologia, chamada de DNA microarray, foi muito atractiva 
pelos biologistas. 
Esta tecnologia promete a monitorização do genoma todo num único chip, para que os 
investigadores podem observar melhor as alterações entre os genes simultaneamente. 
 
Terminologias que têm sido usados na literatura para descrever esta tecnologia: 
 Biochip; 
 DNA chip; 
79 
 
 DNA microarray; 
 Gene array 
 
High density filters 
(macroarrays) 
Glass slides (microarrays) Oligonucleótidos chips 
 2400 clones por 
membrana 
 Rotulação 
radioactiva 
 Uma condição 
experimental por 
membrana 
 10000 clones por 
slide 
 Rotulação 
fluorescentes 
 Duas condições 
experimentais por 
slide. 
 300000 
oligonucleótidos 
por slide 
 Rotulação 
fluorescente 
 Uma condição 
experimental por 
slide 
 
Devido aos métodos de construção destes arrays de síntese de oligonucleótidos foram 
adoptados dos métodos por manufacturação microscópica integrando circuitos 
usados em computadores. Este tipo de oligonucleótidos microarrays são, muitas vezes 
denominadas de DNA chips. 
 
DNA microarrays ou DNA chips são fabricados por robôs de grande velocidade, 
normalmente, de vidro mas, por vezes, em substrato de nylon, em que cada sonda 
com identidade conhecida sai usados para determinar a complementariedade, que 
permite uma massiva expressão genica paralela e estudos de descoberta de genes. 
Uma experiencia com apenas um DNA chip pode fornecer aos investigadoresinformação de milhares de genes simultaneamente. 
 
 
 
Processo das experiências microarrays 
 
 
80 
 
Aplicações dos microarrays 
 
Existem duas grandes aplicações para a tecnologia de DNA microarrays: 
 Identificação da sequência ( mutação gene/gene); 
 Determinação do nível (abundância) da expressão de genes. 
 
Análise da expressão 
 
Uma forma dos chips de DNA permitirem os cientistas de observar genes trabalhando 
em conjunto chama-se de análise da expressão. 
(relembrando que para expressar um gene como proteína, as células primeiro 
transcrevem a sequência do gene de DNA numa cópia de mRNA complementar. Depois 
um ribossomas traduz a sequência de mRNA numa cadeia de aminoácidos que fazem a 
proteína. 
 
 
 
A análise de expressão tem aplicações médicas, permitindo a classificação de 
diferentes tipos de leucemia, com a ajuda dos chips de DNA. usam os modelos da 
expressão do gene para encontrar nos dois grupos , que correctamente pensavam e 
sabendo, assim, que tipo de leucemia o paciente tem. 
Existem três tipos de leucemia: 
 All – acure lymphocytic leukemia 
 AML – acure myelogenous leukemia 
 MLL – mixed lineage leukemia 
 
Outra aplicação dos chips de DNA é o estudo do metabolismo de medicamentos, com 
o gene CYP450. 
 
81 
 
Mapeando as nossas diferenças 
 
Escolhendo duas pessoas no mundo, descobrimos que os seus DNAs são 99,9% 
idênticos. Os 0,1% restantes são a base genética para as diferenças da humanidade, 
desde a forma da cara ao facto das pessoas terem cancro e como os pacientes 
respondem de maneira diferente ao mesmo medicamento. 
 
Os microarrays podem ser utilizados para descobrir a base genética da variação 
fenotípica entre indivíduos: 
 Single nucleotide polymorphism (SNP) 
 Polimorfismo 
 Expressão de genes 
 
Single nucleotide polymorphism 
 
Para mapear SNPs é necessário um outro tipo de chip. Para a análise de expressão 
precisamos de um chip contendo todos os genes possíveis, em que para o SNP 
funcionar, o chip tem de conter, também, as várias variações possíveis de um gene. 
 
Como proceder: 
 Retiramos uma amostra de DNA da pessoa que queremos testar, utilizamos o 
PCR para múltiplas cópias do gene de interesse e colocamos o gene amplificado 
no chip. 
 O local onde a luz aparece corresponde à sequência particular de variação que 
a pessoa tem. 
 Pelo teste ser rápido e não muito caro, podemos fazer muitas vezes. 
 Podemos, então, correlacionar, por exemplo, as diferentes reacções a uma 
certa droga (farmogenómico), ou a probabilidade de ganhar uma doença no 
coração, com as diferentes variações genéticas. 
 
Mutagénese dirigida 
 
A mutagéne dirigida é a capacidade de se poder provocar mutações específicas. 
Pode-se substituir especificamente um determinado nucleótido de um gene por outro, 
com a consequência de alterar um aminoácido de proteína codificada por esse gene. 
 
Utiliza-se oligonucleótidos mutagénicos sintéticos que emparelham na zona do gene 
que se pretende alterar. Estes possuem uma (ou mais) base interna que não 
emparelha e que especifica a mutação a introduzir. 
 
Processo da mutagénese dirigida 
 
O processo de mutagénese dirigida utiliza um PCR que contém, aproximadamente, 50 
ng de dsDNA, 125 ng de cada primer, 1 µL de mix de dNTP, 1 µL (2,5 U) de polimerase e 
5µL de tampão de reacção 10x, numa reacção de 50 µL. Todos os oligonucleótidos 
excepto os primes são fornecidos num kit. A reacção é efectuda usando Pfuturbo DNA 
polimerase e dois oligonucleótidos da mutação desejada. 
82 
 
Os primers são desenhados para incorporar a 
mutação desejada e a Pfuturbo DNA 
polimerase replica ambos os cadeias do 
plasmmídeo com alta fidelidade sem deslocar 
os oligonucleótidos mutantes. 
Os ciclos térmicos consistem numa 
desnaturação inicial a 95ºC durante 30 
segundos, seguido de 16 ciclos de 
desnaturação durante 30 segundos, depois 
emparelhamento a 55ºC durante 1 minuto e 
extensão a 68ºC por 15 minutos (2 
minutos/kb do tamanho do plasmídeo). 
Os oligonucleótidos complementam a cadeia 
oposta do plasmídeo durante o ciclo que origina uma cópia inteira do plasmídeo 
mutante com quebras. Seguido do PCR, o produto é tratado com a enzima Dpn I ( em 
que a sequência alvo é 5’-Gm6ATC-3’). O vector de DNA com quebras, contendo a 
mutação é, então, transformado em células super competentes XL1-Azul. 
O volume de 1µL do produto é usado para transformar e a transformação foi 
plaqueado em agar com YT-ampicilina, incubado a 37ºC por 16h aproximadamente. 
As colónias recombinantes são preparadas num mini-prep, seguido de análise RE e 
para confirmação mais tarde, a sequenciação. 
 
Desenho de primers 
 
Na maioria dos casos, os primers são desenhados para facilitar a incorporação de uma 
novo local de RE ou para remover um local RE existente. Isto foi alcançado pela criação 
de mutações silenciosas em ou à volta da região da mutação desejada. 
Tanto o primer forward como o primer reverse contêm o mutante desejado. Os 
primers emparelham na mesma sequência na cadeia oposta do plasmídeo. 
 
Características dos primers: 
 O tamanho do primer deve ser, aproximadamente, de 25 a 30 bases; 
 Dever ter um mínimo de 10 bases a flanquear o local mutante; 
 O conteúdo de G/C deve ser de 40 a 60%; 
 A temperatura de desnaturação (temperatura melting), Tm, dos primers é 
calculada pela seguinte fórmula: 
Tm = 81,5 + 0,41 (%G/C) – 675/N – (% incompatabilidades) (N é o tamanho do 
primer) 
 
 Os primers não devem ter nem formação de hairpins ou formação de dímeros. 
 
PCR na mutagénese dirigida 
 
Para manipulações de plasmídeos, esta técnica foi suplentada por uma técnica 
parecida com o PCR, onde um par de primers mutagénicos complementares são 
usados para amplificar o plasmídeo. 
83 
 
Este origina uma quebra, em que o DNA circular repara-se por maquinaria endógena 
bacteriana. 
Mas, este processo na amplifica o DNA exponencialmente, mas sim linearmente. Isto é 
devido à reparação da quebra e de o plasmídeo não estar super enrolado, resultando 
na eficiência da transformação bacteriana. 
Finalmente, o produto de DNA é do mesmo tamanho que o plasmídeo. Assim, o DNA 
molde tem que ser eliminado por digestão enzimática com enzimas de restrição 
específicas para o DNA metilado. Já o plasmídeo mutante é preservado porque foi 
criado in vitro e por isso é não metilado. 
 
Sequenciação genómica 
 
Qualquer método de sequenciação de DNA inicia-se com a população de uma 
fragmento de DNA definido e marcado numa extremidade. Dessa população, um 
conjunto de moléculas criadas diferem por uma base na outra extremidade. Essas 
moléculas são depois fraccionadas. 
 O fraccionamento é realizado por electroforese em gel de agarose ou em gel de 
acrilamida das moléculas de cadeia dupla de DNA. A mobilidade da cadeia é 
inversamente proporcional ao logaritmo do comprimento. 
Esta técnica é tão sensível que fragmentos que diferem no comprimento por apenas 
um nucleótido podem ser separados. A base cortada de cada extremidade das 
moléculas fraccionadas é determinada e, portanto, a sequência de nucleótido é 
estabelecida. 
 
Moléculas de DNA podem ser rapidamente sequenciadas por dois métodos. 
 
As técnicas disponíveis para produzir e separar fragmentos restritos de DNA de 
algumas centenas de nucleótidos levou ao desenvolvimento de dois procedimentos 
para determinar a sequência de nucleótidos exacta de fragmentos de DNA até 500 
nucleótidos. Estes métodos de sequenciação de DNA juntos com a tecnologia para 
construir bibliotecas representam o genoma inteiro de um organismo, tornado 
possível determinar a sequência exacta de todo o DNA do organismo. 
 
Método de Maxam – Gilbert 
 
Neste método uma cadeia simples de DNA é marcada com 32P a extremidade 5’. De 
seguida, separam-se as duas cadeias de DNA.Distribui-se por 4 tubos, um para cada 
base. Em cada tubo irão ocorrer alterações químicas específicas para uma base (A, C, G 
ou T). As moléculas são clivadas. Por exemplo, no tubo em que o tratamento foi 
direccionado para a adenina, após a clivagem, a extremidade do fragmento de DNA 
marcada com o radioisótopo, apresentará uma base que corresponde à que precede a 
adenina. 
O passo seguinte é idêntico ao método de Sanger. Cada molécula é separada em gel de 
electroforese e a sequência é lida a partir do próprio gel. Os fragmentos menores são 
clivados mais próximo da extremidade 5’ enquanto que os fragmentos maiores são 
84 
 
clivados mais próximo da extremidade 3’. Só os fragmentos radioactivos são 
detectados por autoradiografia. 
 
 
 
Método de (dideoxy) Sanger 
 
Componentes da reacção 
 
 O molde é uma cadeia de DNA que queremos sequenciar. Pode ser um produto 
de PCR, DNA genómico ou fragmentos clonados. 
 O primer é uma fragmento de DNA que se liga à extremidade de DNA molde. 
Os primers fornecem especificidade à reacção e, também, serve como ancora 
aos nucleótidos que são adicionados. 
 Deoxynucleótidos (dNTPs) ampliam o primer, formando uma cadeia de DNA. 
Todos os nucleótidos (A,T,G,C na forma deoxunucleótidos) são adicionados à 
reacção de sequenciação. 
 Didesoxinucleótidos (ddNTPs) são outra forma de nucleótidos que inibem a 
amplificação do primer. Uma vez o ddNTP seja incorporado na cadeia de DNA, 
mais nenhum nucleótido pode ser adicionado. 
 DNA polimerase incorpora os nucleótidos e os didesoxinucleótidos na cadeia de 
DNA a ser formada. 
 Tampão é a solução que estabiliza os reagentes e os produtos na reacção de 
sequenciação. 
 
Ciclo de sequenciação 
 
Ciclo de sequenciação é o poder de reutilizar o mesmo molde muitas vezes. 
 
O ciclo de sequenciação ou, também, denominado por sequenciação de amplificação 
linear, é um tipo de sequenciação PCR. Tal como a reacção de PCR comum, usa uma 
DNA polimerase termoestável e um ciclo de temperatura de desnaturação, 
emparelhamento e síntese de DNA. A diferença do ciclo de sequenciação emprega 
apenas um primer e inclui ddNTPs que terminam a reacção. 
 
Marcadores fluorescentes são a base da leitura da sequência. 
 
85 
 
A terminação do método de sequenciação comum utiliza marcadores radioactivos, e o 
padrão de bandas no gel de poliacrilamida é visualização por autoradiografia. 
A marcação fluorescente tem sido importante para o desenvolvimento do método de 
sequenciação, particularmente devido à detecção de sistemas por fluoromarcação, 
que abriu caminho para a leitura automática de sequenciação. 
 
 
O marcador é ligado aos ddNTP, com diferentes fluorocromos para cada base. 
Agora é possível cocnhecer as quatro reacções de sequenciação para A, C, G e T, 
num único tubo e carregar todas as quatro famílias de moléculas num só gel de 
poliacrilamida, uma vez que o detector de fluorescência consegue descriminar 
entre a diferença de marcadores de determinar que banda representa um A, C, G 
ou T. 
 
Quando combinado com aparelhos robóticos que preparam as reacções de 
sequenciação e carregam o gel, o sistema de detecção de fluorescência evita erros que 
poderiam aparecer quando a sequencia é lida por olho nu e entra manualmente num 
computador. É pelo uso destas técnicas automáticas que podemos obter rapidamente 
dados da sequência, para um projecto para estudar um genoma completo num espaço 
de tempo razoável. 
 
 
Sequenciação completa de genomas 
 
Existe duas estratégias gerais para a sequenciação 
completa de genomas. O método preferido pelo 
Projecto Genoma Humano é o método de 
sequenciação shotgun hierárquica. 
Nesta abordagem, o DNA genómico é cortado em 
pedaços de cerca de 150 Mb e inserido num vector 
BAC e transformado na E.coli, onde são replicados e 
armazenados. Os inserts de BAC são isolados e 
mapeados para determinar no fim cada fragmento de 
150 Mb clonados. Depois são alinahdos e agregados 
numa sequência final. 
 
86 
 
Mapeamento físico 
 
Na preparação de mapas físicos de genomas, os vectores que podem carregar uma 
grande parte de inserts são os mais usados. Cosmídios, YACs (yeast artificial 
chromossomes), BACs (cromossomas artificiais de bactérias) e PACs ( cromossomas 
artificiais baseados no fago P1) são os mais utilizados. 
 
 
Cada fragmento BAC é fragmentado aleatoriamente em 
pequenos pedaços e cada pedaço é clonado num plasmídeo 
e sequenciado em ambas as cadeias. Esta sequenciação é 
alinhada para que sequências idênticas sejam sobrepostas. 
Estes pedaços contíguos são, então, agregadas numa 
sequencia final quando cada cadeia já foi sequenciada cerca 
de 4 vezes para produzir 8 vezes uma grande qualidade de 
informação. 
 
 
Localização do gene por inspecção de sequenciação 
 
A inspecção da sequencia pode ser utilizada para localizar genes porque os genes não 
são séries de nucleótidos aleatórios mas em vez disso tem características distintas. 
Essas características determinam a sequência do gene ou não, e pela definição não são 
possuídos por DNA não codificante. 
 
Pirosequenciação 
 
A pirosequenciação é sequenciar por síntese. Esta técnica assenta na detecção do 
pirofosfato libertado e não na terminação de cadeias (Sanger). 
 
Método de sequenciação baseado no real time pirofosfato 
 
No novo método de sequenciação, 4 nucleótidos são adicionados perto da molde 
hibridizado com um primer. 
O PPi libertado na DNA polímeras que cataliza a reacção 
é detectado pelo ATP sulfurilase e luciferase na reacção 
coplada. Os nucleótidos adicionados são 
continuadamente degradados pela enzima degradadora 
de nucleótidos. Depois do primeiro nucleótido 
adicionado ter sido degradado, o próximo nucleótido 
pode ser adicionado. 
87 
 
Pirosequenciação 
 
Recentemente, Ronaghi et al, mostraram que nucleótidos naturais podem ser usados 
para obter uma incorporação eficiente durante o protocolo da sequenciação por 
síntese. 
 
A detecção foi baseada no pirofosfato (PPi) libertado durante a reacção da DNA 
polimerase, na quantidade de conversão do pirofosfato em ATP pela sulfurilase e a 
subsequente produção de luz visível pela luciferase. 
 
Enzimas envolvidas nestes processos: 
 DNA polimerase 
 sulfurilase 
 luciferase 
 
A pirosequenciação apresenta um problema, que é a remoção de nucleótidos não 
incorporados. Para isso, encontrou-se uma resolução básica, como a adição de uma 
enzima que degrada os nucleotídeos não incorporados, a enzima aspirase. 
Passou a usar‐se na reacção uma mistura de quatro enzimas: a DNA polimerase, a 
sulfurilase, a luciferase e a aspirase. 
 
Processo de pirosequenciação 
 
1. o fragmento de DNA de interesse (primer da 
sequenciação hibridizado à cadeia simples de DNA 
molde) é incubado com as enzimas, DNA 
polimerase , ATP sulfurilase, luciferase e apirase, 
assim como, com substratos, adenosina 5’ 
fosfosulfatase (APS) e luciferina. 
 
2. O primeiro deosinucleótido trifosfato (dNTP) é 
adicionado à reacção. Repetição de ciclos de adição 
de deosinucleótidos. A adição de dNTPs é realizada 
sequencialmente pela DNA polimerase. A 
deosinucleótido é incorporado na cadeia de DNA se 
for complementar à cadeia molde. Cada incorporação é acompanhado pela 
libertação de pirofosfato numa quantidade equimolar à de nucleótidos 
incorporados. 
 
3. A ATP sulfurilase converte PPi em ATP na presença de adenosina 5’ fosfosulfato 
(APS). A concentração de ATP activa a luciferase (que converte a luciferina e 
oxiluciferina) originando luz numa quantidade proporcional à concentração do 
ATP. A quantidade de luz produzida pela luciferase pode ser estimada pelo 
aparelho sensível à luz. 
88 
 
 
 
4. Os deosinucleótidos não incorporados são degradados pela aspirase, assim 
como o ATP. Quando a degradação estácompleta, outro nucleótido é 
adicionado. 
 
 
Características da aspirase 
 
 A enzima deve ser hidrolisar todos os nucleótidos na mesma taxa, 
aproximadamente. Isto inclui a α-tio-dATP, que é usado em vez do dATP para 
melhorar a sequenciação. 
 
Nota: na mistura inicial de nucleotídios o dATP é substituído por dATPαS 
(desoxiadenosina alfa‐tio trifosfato) uma vez que é eficientemente usado pela DNA 
polimerase, mas não e reconhecido pela luciferase. 
 
 Deve, também, hidrolisar ATP para prevenir a acumulação de ATP entre os 
ciclos. 
 O tempo da degradação dos nucleótidos pela enzima tem que ser mais lento 
que a incorporação dos nucleótidos pela DNA polimerase. Obviamente, estas 
duas enzimas competem pelo mesmo substrato, e é importante que o 
rendimento da incorporação seja perto dos 100% antes da enzima degrade os 
nucleótidos para uma concentração inferior à Km para a polimerase. 
 A cinética das reacções enzimáticas deve ser de modo a garantir que a 
incorporação de dNTPs decorre muito mais rapidamente que a sua 
degradação! 
 A velocidade da síntese de ATP pela sulfurilase deve ser mais rápida que 
hidrólise de ATP, para se obter concentrações de ATP e produção de luz numa 
proporção igual ao PPi libertado. 
 
Outros problemas 
 
Um problema inerente com o método descrito é a dificuldade na determinação do 
número de nucleótidos incorporados nas regiões homopoliméricas devido à resposta 
não linear da luz seguido da incorporação de mais de três ou quatro nucleótidos 
idênticos. A resposta não linear da luz pode ser compensada por um software de 
algoritmos. 
89 
 
Desenvolvimento 
 
Um processo paralelo de grande número de amostras pode ser, facilmente, visualizado 
com o uso de um microtiter de alta densidade e por tecnologia de microinjecçao. 
O desenvolvimento de instrumentos automatizados baseados na precisão de volumes 
em submicrolitros dos quatro nucleótidos por tecnologia “ink-jet” em placas microtiter 
copladas com uma detecção simultânea de todas as amostras de uma única unidade 
CCD. 
 
Bibliotecas 
 
Biblioteca genómica 
 
Colecção dos fragmentos de DNA que representam todo o genoma de um 
determinado organismo. 
 
Processo: 
1. Extracção de DNA dos tecidos; 
2. Cortar o DNA genómico com a ajuda de enzimas de restrição (digestão) 
3. Todos os fragmentos são clonados. 
 
Uma biblioteca genómica pode ser feita por clonagem de genes num bacteriófago 
lambda. 
 
Bibliotecas de cDNA 
 
É uma colecção de clones das moléculas de DNA complementares (cDNA) de todos os 
mRNA’s presentes num determinado tecido. 
Representa apenas o conjunto de genes que está a ser expresso num determinado 
momento e num determinado tecido. 
Cada clone representa um gene sem intrões. 
 
Processo: 
1. Extracção de RNA total do tecido; 
2. Síntese de cDNA por uma transcriptase reversa; 
3. Ligação do cDNA a uma sequência de restrição em cada extremidade 
4. Clonagem – ligação do cDNA com um vector e transformação da célula 
hospedeira 
 
Como encontrar cDNA nas bibliotecas? 
 
Temos uma colónia numa placa. Depois dispõe-se um filtro que faz uma cópia da 
colónia. De seguida, procede-se a um tratamento químico para destruir as bactérias e 
o DNA fica desnaturado. 
Uma sonda marcada radioactivamente é incubada, que descobre o DNA 
complementar. Lava-se para retirar o que fica preso na membrana, sobrando apenas o 
cDNA complementar com a sonda. 
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Existem outros processos que se utilizam nas bibliotecas genómicas: 
 Southern Blotting 
 Nothern Blotting 
 Western Blotting 
 
Southern Blotting 
 
Permite a detecção de sequências de DNA, após separação electroforética, por 
hibridação com uma sonda, cuja a sequência é complementar à do DNA. 
As moléculas de DNA são transferidas de um gel de agarose para uma membrana. 
Este processo permite então, localizar uma sequência particular de DNA, dentro de 
uma mistura complexa. 
 
Processo: 
1. Corte do DNA por enzimas de restrição; 
2. Submeter os fragmentos de DNA a uma electroforese em gel de agarose, em 
que depois é fotografado com iluminação UV; 
3. Desnaturação do DNA – o gel e submerso em uma solução alcalina (NaOH) para 
desnaturar o DNA, passando este para cadeia simples. 
4. Despurinação (opcional) – retira-se as bases puricas para os fragmentos de DNA 
serem ainda mais pequenos. 
5. Transferência do DNA desnaturado para uma membrana 
a. Neutralização do pH por imersão do gel numa solução apropriada; 
b. Gel colocado sobre um papel grosso que se encontra em contactp com 
uma solução salina tampão. 
c. Colocação de uma membrana de nylon, seguido de camada de folhas 
papel absorvente e depois um objecto pesado por cima do gel. 
d. A solução salina tampão vai passar para as folhas de papel e os 
fragmentos de DNA ligam-se à membrana de nylon na posição que 
ocupavam no gel. 
6. Hibridação – incubação de um DNA heterólogo para uma ligação não especifica 
das sondas. Sondas marcadas radioactivamente são lançadas na membrana de 
nylon , que vão emparelhar com o fragmento de DNA complementar. Depois 
várias lavagens para remover sondas e ligações não específicas. 
7. Visualização - visualização por autoradiografia. 
 
Nothern Blotting 
 
Processo idêntico ao southern mas serve para detectar moléculas de RNA em vez de 
DNA. 
 
Processo: 
1. As moléculas de RNA são separadas no gel, que tem características 
desnaturantes; 
2. Transferência para uma membrana; 
3. Hibridação por uma sonda marcada radioactivamente; 
4. Detecção dos híbridos por autoradiografia. 
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Western Blotting 
 
Segue os mesmos princípios que o southern e northern mas aplica-se a proteínas. 
 
Processo: 
1. As proteínas são separadas em gel de poliacrilamida contendo um detergente 
desnaturante SDS. 
2. Transferência para uma membrana, mantendo as proteínas a posição relativa 
no gel. 
3. Incubação das membranas com anticorpos que reconhecem e ligam-se ás 
proteínas especificas, formando o complexo antigénio/anticorpo devido à 
incubação com um anticorpo secundário que se encontra marcado 
radioactivamente. O anticorpo pode estar ligado a uma enzima, que após reagir 
com o substrato desenvolve uma reacção colorida na membrana ou uma 
reacção que é detectada por um filme de raio X.