Sebenta biotecnologia

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FACULDADE DE CIÊNCIAS DA UNIVERSIDADE DO PORTO 
Manipulação molecular 
e Biotecnologia 
Sebenta 
 
Sandra Isabel Cunha Silveira 
Ano lectivo 2010/2011 
 
 
 
Professora: Susana Vieira 
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Plasmídeos 
 
Plasmídeos, pequenos fragmentos de DNA, são 
conhecidos em quase todas as células bacterianas. 
Encontram-se separados do material DNA principal da 
bactéria, representando 2% da informação genética total 
do organismo. Contem de dezenas a centenas de genes, 
comparando com o material DNA principal , que contém 
milhares de genes. 
 
O plastídeo é uma molécula de DNA extra cromossómico separado do DNA 
cromossómico, que é capaz de replicar-se independentemente do DNA cromossómico. 
Em muitos casos, é circular e de dupla cadeia. 
Os plasmídeos ocorrem naturalmente em bactérias, mas, por vezes, são encontrados 
em organismos eucarióticos (ex: Saccharomyces cerevisiae) 
 
Os plasmídeos são: 
 Fechados e peças circulares de DNA; 
 Capazes de auto – replicação; 
 São transportados por muitas bactérias; 
 Fornecem funções únicas à bactéria, permitindo-as replicarem-se sexualmente 
e na passagem de material genético entre elas; 
 Responsáveis pelos factores genéticos que facultam a resistência a antibióticos 
e fornecem enzimas necessárias para quebrar os recursos alimentares pouco 
metabolizados. 
 
 
 
Os plasmídeos são, tipicamente moléculas circulares de dsDNA com tamanho 
entre 2kb e 100b. Estes plasmídeos serão super enrolados na célula. 
 
Os plasmídeos possuem uma origem de replicação, que é uma sequência 
de DNA que permite copiar as moléculas de DNA. 
 
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Dois plasmídeos diferentes que são originados da mesma origem de replicação não 
coexistem. 
 
Alguns plasmídeos são capazes de replicar num número limitado de espécies 
bacterianas; eles têm um estreito intervalo hospedeiro. Exemplos como os plasmídeos 
ColE1, pBR322, pUC18 são limitados para E. coli e para algumas espécies. 
Outros plasmídeos são capazes de replicar numa largo intervalo de espécies 
bacterianas; têm um amplo intervalo hospedeiro. 
 
Controlo das cópias do plasmídeo 
 
O número de cópias do plasmídeo pode variar de 1 (o plasmídeo F) a centenas 
(pUC18). Este número é uma propriedade do plasmídeo e depende do mecanismo que 
regula a sua própria replicação. 
 
 
 
Exemplo: Replicação do plasmídeo ColE1 
 
ColE1 é um pequeno e circular plasmídeo que codifica uma toxina (proteína) de 57 
kDal que consegue matar outra E.coli por despolarização da membrana bacteriana. 
 O plasmídeo ColE1 carrega os seguintes genes: 
 
 
 
 
 
 
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Transferência de plasmídeo 
 
Alguns plasmídeos conseguem auto transferir-se entre células bacterianas por 
conjugação bacteriana. Esses plasmídeos codificam todas as funções proteicas que são 
necessárias e que requerem mobilização e transferência de célula hospedeira para a 
célula receptora. 
Alguns plasmídeos são incapazes. Não codificam as proteínas necessárias. Contudo, 
coexistem na células com plasmídeo que automobiliza-se. Assim, eles podem 
conseguir mobilizar-se, se transportarem a sequencia correcta ou sítios que são 
reconhecidos pelas proteínas que são sintetizadas do outro plasmídeo. 
O plasmídeo ColE1 é um bom exemplo de um plasmídeo mobilizador. Ele contém uma 
região bom (base da mobilização) com local nic que é ligado por proteínas codificadas 
na região mob (mobilização). Quando as bactérias juntam-se, a estreita ligação forma 
um complexo com a proteína mob que lida através do canal de conjugação para a 
célula receptora. 
 
Como estudar um gene? 
 
Cada cromossoma é uma molécula contínua de DNA, que pode ser de milhares ou de 
milhões pares de base. 
O vasto tamanho dos cromossomas coloca um problema para os cientistas que tentam 
isolar e estudar porções de DNA que compõe os genes. 
 
Um cromossoma é uma de DNA contínua. Pode ter milhares ou milhões de pares de 
bases. 
 
Tesouras moleculares 
 
Em 1962, Werner arber, um bioquímico suíço, forneceu a primeira existência de 
“tesouras moleculares” que conseguem cortar DNA. 
Ele mostrou que a bactéria E.coli possui um sistema imunológico enzimático que 
reconhece e destrói DNA estranho, e modifica o DNA nativo para o prevenir de auto-
destruição. 
Arber e os seus associados denominam o grupo que corta DNA de enzimas de restrição 
endonucleases. Eles mostraram que as endonucleases de restrição são específicas no 
seu corte. Uma enzima dada irá cortar o DNA apenas quando reconhece a sequência 
certa. 
 
Utilizamos endonucleases de restrição para podermos estudar os genes 
individualmente e, para cortar DNA. 
 
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Bacteriófago é um vírus que infecta bactérias. O DNA do vírus que entrava, era 
cortado, levando assim á descoberta das enzimas de restrição. 
 
Cola molecular 
 
Não muito depois das descobertas de Arber, Arthur Kornberg identificou um 
mecanismo de colar para a o DNA, uma enzima denominada ligase. 
Kornberg estava a tentar construir um DNA viral artificial de fragmentos virais, mas 
não consegui criar uma molécula activa, biologicamente. Depois de ele adicionar 
ligase, descobriu que a enzima torna possível colar as extremidades da molécula de 
DNA. 
 
A DNA ligase torna possível ligar as extremidades da molécula de DNA. 
 
Fazer mais cópias… 
 
Pelo fim de 1960, a molécula de DNA podia ser cortada e colada. Mas os cientistas 
necessitavam de um mecanismo de cópia a fim de manter uma grande amostra para 
trabalhar. 
 
Essa descoberta veio em 1971, quando cientistas descobriram uma maneira eficiente 
de introduzir pequenos loops de DNA chamados de plasmídeos na bactéria e.coli. estes 
loops de DNA plasmídico consegue transportar um “pacote” de DNA estranho para as 
células hospedeiras, e conferir um benefício como a resistência a drogas. 
 
Cientistas conseguem importar plasmídeos que contêm uma parte selectiva do DNA 
para uma bactéria. A reprodução normal de bactérias produz uma grande quantidade 
do DNA desejado. 
 
A revolução recombinante 
 
A etapa foi definida pela revolução tecnológica. Cientistas descobriram como cortar, 
colar e copiar DNA. 
O que ficou por fazer foi como aplicar estas técnicas para editar e personalizar DNA. 
Esta criação de “DNA recombinante” poderia manipular coisas vivas no seu nível mais 
básico. 
 
Poderão os cientistas criar organismos que combinem os genes de diferentes 
espécies? 
Poderá ajudar a salvar vidas, ou pode ameaçá-la? 
 
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Técnica de transformação/células competentes 
 
A transformação é a introdução de plasmídeos num organismo, como por exemplo 
bactérias. A bactéria ao multiplicar-se origina milhares de cópias de DNA – clonagem 
de genes seleccionados. 
Esta técnica induz a bactéria a incorporar o DNA plasmídico. Espalhamos a bactéria 
transformada numa placa de petri que contém tretaciclina e Canamicina. Apenas as 
bactérias transformadas contendo os dois genes de resistência poderão crescer na 
presença de ambos antibióticos. 
O resultado foi consistente com a bactéria ter sido transformada com um plasmídeo 
com os genes tetr e kanr. Contudo, também é possível que algumas bactérias possam 
ter sido duplamente transformadas por versões re-ligadas do plasmídeo original. 
 
Estas bactérias vivas deixam entrar as moléculas porque não as reconhecem como 
desconhecidas. 
 
Extracção de DNA plasmídico e electroforese em gel de agarose 
 
Análise da restrição mostra que algumas colónias foram transformadas pelo plasmídeo 
recombinante. É permitido saber quando cortamos o plasmídeoe corremo-lo em gel 
de agarose. 
 
 
Crescimento do fago 
 
Existem dois tipos de bacteriófagos, o fago lamda e o fago 
M13. O fago lambda pode existir em pró-fago (integrado no 
genoma bacteriano, lisogénico) ou como um elemento 
genético independente (lítico). 
O fago lambda é um bacteriófago linear de cadeia dupla 
quando carrega no fago uma película proteica. 
 
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Durante a infecção, um fago ataca a bactéria e injecta o material genético no 
citoplasma da bactéria. 
A informação genética do fago assume maquinaria da bactéria, desligando a síntese 
dos componentes da bactéria e redirecciona a síntese do material bacteriano para 
fazer mais componentes fágicos. 
 No ciclo de infecção do fago, a lise é quando a célula rebenta para libertar os 
componentes. Depois da lise, os fagos descendentes infectam as células vizinhas. 
Este é um fenómeno exponencialmente explosivo (causa um crescimento exponencial 
do numero de células que sofrem lise). 
 
 
Como quantificar o crescimento do fago? 
 
Existe uma camada contínua de bactérias (filmes) e são colocados os fagos em baixa. 
Cada roda clara foi um fago que lisaram a bactéria e os pontos são as bactérias que 
foram destruídas e são fagos que ficaram – placa fágica. 
 
 
 
Restrição do crescimento de fagos 
 
É conhecido desde 1950, de que as partículas dos fagos crescem bem e eficientemente 
infectam uma linhagem de bactérias que frequentemente são incapazes de crescer 
bem e infectam outras linhagens da mesma espécie bacteriana. 
 
Em adição, as partículas fágicas que conseguem, com sucesso, infectar uma segunda 
linhagem, frequentemente demonstram um padrão oposto. Estes são capazes de 
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infectar, eficientemente uma segunda linhagem enquanto crescem pobremente na 
linhagem original. 
 
Uma série de estudos mostra que as partículas fágicas que crescem eficientemente e 
infectam a célula hospedeira têm moléculas de DNA que são quimicamente 
modificadas pela adição de grupos metilo em algumas das suas bases adeninas e/ou 
citosinas, enquanto o DNA do fago que pobremente infecta não mostra este tipo de 
modificação química ou metilação. 
 
Partículas fágicas sem metilação do DNA não crescem e nem infectam eficientemente 
porque as suas moléculas de DNA são clivadas e degradadas por enzimas da célula 
hospedeira, enquanto as que possuem DNA metilado estão protegidas da degradação. 
Este fenómeno da degradação do DNA não metilado destrói a habilidade de 
crescimento do fago e é responsável pelo padrão de restrição do crescimento. 
 
Descoberta dos sistemas de modificação-restrição 
 
Apesar do fenómeno biológico do sistema de modificação-restrição crescer das 
observações dos microbiologistas, a variedade das células hospedeiras dos fagos é 
influenciada pela estirpe bacteriana em que o fago se propagou. Apesar dos fagos 
produzirem numa estirpe de Escherichia coli, poderão infectar uma cultura da mesma 
estirpe, eles não alcançam uma infecção de sucesso em células de estirpes diferentes 
da E.coli. Esta descoberta implica que os fagos transportam um “imprint” que 
identifica as suas proveniências imediatas. Testes biológicos simples demonstram que 
a infecção com sucesso numa estirpe diferente resulta na produção de fagos que 
perderam os seus “imprint” e adquiriram um novo. 
 
Observação: 
 Fagos produzidos numa estirpe de E. coli, infectavam a mesma estirpe. 
 Mesmos fagos não infectavam eficazmente SEGUNDA estirpe: PORQUÊ? 
 
 
Em 1960, experiências moleculares demonstraram que o “imprint” de um DNA 
modificado foi perdido quando o DNA fágico numa estirpe bacteriana diferente. Esses 
fagos, que conservam uma parte original da cadeia de DNA retêm o imprint, ou a 
modificação, enquanto fagos que contêm as duas cadeias de um novo DNA sintetizado 
não retêm o imprint. A modificação fornece protecção contra a endonuclease, a 
barreira que previne a replicação do genoma fágico. Mais tarde, foi comprovado que 
as enzimas de modificação e de restrição reconhecem o mesmo alvo, uma sequência 
nucleótica especifica. 
 
 
 
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1960: 
o “imprint” é uma MODIFICAÇÃO do DNA perdida na nova estirpe bacteriana 
Os fagos com UMA das cadeias modificadas retinham o “imprint” 
Os fagos com DNA completamente novo perdiam o “imprint” 
 A MODIFICAÇÃO deveria dar PROTECÇÃO contra uma ENDONUCLEASE 
 
Mais tarde: 
A modificação e a restrição reconheciam o mesmo alvo (sequência nucleotídica) 
 
Nota: Nesta altura não estavam caracterizados os sistemas de Modificação/Restrição 
 
As enzimas de modificação são um DNA metiltransferase que metila bases específicas 
da sequência alvo e na ausência da metilação específica , o DNA da sequência alvo é 
sensível às enzimas de restrição. 
Quando falta no DNA o imprint de modificação apropriado, entra a célula competente 
da restrição que reconhece o DNA como estranho e é degradado por uma 
endonuclease. 
A barreira controlo-hospedeiro para uma infecção com sucesso pelos fagos que não 
possuem uma correcta modificação foi referida como “restrição” e as endonucleases 
adquiriram o nome de enzimas de restrição. Similarmente, as metiltransferases são, 
normalmente, denominadas de enzimas de modificação. Classicamente, a enzimas de 
restrição é acompanhada pela enzima de modificação e as duas compreendem o 
sistema de modificação-restrição. 
 
O hospedeiro “barra” uma infecção por fagos = restrição não protegidos pela 
modificação correcta. 
 
 
E.coli C aparentemente não apresenta sistema R-
M. 
Prever: eficiência de fagos crescido em C quando 
infectam K-12. 
Fagos crescidos em K-12: diferenças quando 
infectam K-12 e C? 
Prever eficiência na formação de lambda K em 
E.coli B. 
E.coli B possui um sistema R-M com especificidade diferente de K-12. 
 
Eschericia coli K-12 possui, enquanto a Escherichia coli C tem em falta, o sistema 
Restrição – Modificação do tipo I. o fago λ (lambda) propagado na E.coli C. (λ.C) não é 
protegido da restrição pela Eco KI e assim, forma placas com eficiência reduzida de 
plaqueamento (EOP) na E.coli K-12 em comparação com a E.coli C. os fagos que nai 
sofrem restrição são modificadas pela Eco KI metiltransferase (λ.K) e, 
consequentemente, forma placas com a mesma eficiência na E.coli K-12 e C. DNA 
modificado é indicado por “hatch marks”. 
 
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A descoberta de uma 
barreira para a 
infecção do seu 
hospedeiro natural, 
E.coli k-12, se o fago 
foi, previamente, 
propagado em E.coli C. 
isto leva a um 
fenómeno do sistema R-M. Eschericia coli K-12 possui um sistema M-R, Eco KI, ausente 
na E.coli C. o fago propagado na E. coli C não é protegido da restrição pela Eco KI e 
forma placas de baixa eficiência na E.coli K-12 em comparação com a E.coli C. 
 
 Bertani e Weigle: uma barreira para a infecção do bacteriófago no seu 
hospedeiro natural, Escherichia coli K-12, que pode “lifted” pela variação 
hospedeiro – controlo do vírus. 
 
 Arber e um aluno de doutoramento Dussoix mostram que o DNA foi rejeitado e 
degradado depois da infecção de diferentes hospedeiros bacterianos, a não ser 
que transporta-se a modificação específica do DNA, e assim, dando 
fundamentos para o fenómeno da restrição e modificação (R- M). 
 
 A enzima de restrição da E.coli k-12, Eco KI, foi purificada em 1968 e necessita 
de S-adenosilmetionina (AdoMet) e ATP como cofactores. 
 
 Pelo fim da década, houve uma evidência substancial para um locus do 
cromossoma hsdk com três genes que codificam as subunidades da restrição 
(C), modificação (M) e especificidade (S) que reúnem num grande complexo de 
mais de 400 kDa. 
 
Em 1970 trouxeram a mensagem de que a Eco KI cortam longe do local de 
reconhecimento do DNA, no local onde a enzima permanece ligada enquanto a 
translocaçãodo próprio DNA passado, com hidrólise de ATP, e subsequente com 
espaços na cadeia dupla. Esta translocação DNA loops, claramente, visível no 
microscópio electrónico. 
A restrição ocorre quando uma sequência alvo específica (sequência de DNA a azul 
escuro que é mostrada como um tubo) sem a 
metilação apropriada (locais amarelos) em 
ambas as cadeias de DNA é reconhecida pela 
enzima. Uma enzima de restrição do tipo II, 
tipicamente uma proteína dimérica, cliva o 
DNA num local definido dentro ou perto da 
sequência alvo específica e dissocia do DNA 
deixando duas terminações livres. Alvos não 
metilados causa à enzima de restrição do 
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tipo I a segurar o alvo e activa a translocação do DNA (direcção mostrada pelas setas 
vermelhas) pelas subunidades motor. Múltiplos contactos com o DNA que expandem 
loops são extrusados a partir da enzima como bobinas no DNA. Adiando a translocação 
por colisão com, por exemplo, com outra enzima de restrição do tipo I, activa a 
clivagem no local da colisão. Depois da clivagem do DNA, a enzima de restrição do tipo 
I permanece ligada ao DNA e não vira na reacção de restrição. A enzima de restrição 
do tipo I compreende as sequências de DNA da subunidade (S), duas subunidades 
metiltransferase (M) e duas subunidades de restrição (R). O núcleo do M2S é 
responsável pela (i) manutenção da metilação do cromossoma hospedeiro pela 
modificação sequência específica hemimetilada produzida pela replicação do DNA e (ii) 
activação da reacção de restrição caso a sequência especifica do DNA reconhecida é 
não metilada em ambas as cadeias e a partir da fonte estranha. Esta reacção de 
restrição compreende ATPases dependentes da translocação do DNA pelos motors, 
que são membros da SF2, que é da família das helicases, e cliva o DNA. A reacção de 
restrição é transportada pela subunidade R, em que cada uma contém um motor e um 
domínio de clivagem do DNA. 
 
 Eco KI tornou-se na arquetípica enzima tipo I do sistema R-M com a 
translocação do DNA com propriedades reminiscentes das helicases, 
reconhecendo o local assimétrico bipartido AAC(N6)GTGC. 
 
Endonuclease de restrição 
 
Quando um bacteriófago é transferido do crescimento em um hospedeiro para um 
hospedeiro diferente, a sua eficiência é, frequentemente, comprometido várias vezes. 
Contudo, quando o fago que sobreviveu e multiplica-se é usado para reinfectar um 
segundo hospedeiro, eles agora crescem normalmente. 
O pobre crescimento inicial é causado pela acção sobre o DNA do fago numa sequência 
específica da endonuclease bacteriana (conhecida como endonuclease de restrição 
porque restrita o crescimento do fago). Seguido da clivagem inicial, o DNA do fago é 
rapidamente degradado a nucleótidos por acção da exonuclease, embora algumas 
regiões possam ser resgatadas pela recombinação. 
O DNA do hospedeiro não é degradado porque a sequência de nucleótidos que é 
reconhecida pelas enzimas de restrição foi modificada (geralmente por metilação). 
As poucas moléculas do DNA do fago que sobrevivem à infecção inicial é devido a estas 
modificarem-se pela metilase do hospedeiro antes da enzima de restrição actuar. Esta 
metilação do DNA dos descendentes torna-os resistentes a uma segunda infecção. 
Um processo inverso é a degradação da citosina no DNA na E.coli infectada com T dos 
bacteriófagos em que o seu próprio DNA contém hidroximetilocitosina. 
Os cromossomas de E.coli codificam a endonuclease de restrição do tipo I, conhecida 
por Eco B (na E.coli na estirpe B). outras enzimas de restrição são codificadas por 
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plasmídeos e são na maioria enzimas do tipo II, mas alguns fagos e plasmídeos 
codificam enzimas do tipo III que são conhecidas por intermediarias em propriedades 
entre as enzimas do tipo I e do tipo II. Enzimas do tipo I e do tipo II catalisam ambas 
endonucleotídeos. 
 
Enzimas do tipo I 
 
São proteínas complexas multifuncionais que clivam DNA mão modificado na presença 
de S-adenosil-l.metionina (AdoMet), ATP e Mg2+. São multisubunidades de enzimas, 
que, são, também DNA metilases e ATPases. 
As subunidades estão presentes em diferentes proporções nas enzimas EcoB e na 
EcoK. Elas são codificadas por três genes contíguos conhecidos como hsdM 
(modificação) e hsdS (espicificidade). As três subunidades são, respectivamente, 
responsáveis pela acção das nucleases, pela metilação e pela especificidade da 
sequência da enzima. 
 
Os locais de reconhecimento para as 
enzimas de restrição EcoK e EcoB do tipo 
I são mostrados na imagem. As adeninas 
com um asterisco na sequência EcoB é 
metilada pela enzima EcoB e as adeninas 
correspondentes á sequência EcoK são os locais da metilação pela metilase de 
restrição EcoK. As sequências de reconhecimento consistem num grupo de três bases e 
num grupo de quatro bases separadas por seis (EcoK) ou oito (EcoB) bases 
inespecíficas. 
 
Sistemas de modificação-restrição 
 
Metilase e nuclease 
 
No fim de 1960, o cientista Stewart Linn e Werner Arber isolaram amostras de dois 
tipos de enzimas responsáveis pelo crescimento restrito de fagos na Escherichia coli. 
Uma destas enzimas metilaram DNA, enquanto que a outra cortou DNA não metilado 
uma grande variedade de locais ao longo do comprimento da molécula. 
O primeiro tipo de enzimas foram chamadas de metilases enquanto as outras são 
chamadas de nucleases de restrição. 
Estas ferramentas enzimáticas eram importantes para os cientistas que estavam a 
reunir as ferramentas necessárias para “cortar e colar” moléculas de DNA. 
 
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O que era necessário agora era uma ferramenta que cortaria o DNA em locais 
específicos, em vez de locais ao acaso ao longo do comprimento da molécula, para que 
os cientistas podessem cortar DNA numa forma previsível e reprodutível. 
 
Breve história: 
o Década de 50 – descoberta de um sistema imunitário primitivo em bactérias – 
algumas estirpes de E.coli eram resistentes à infecçao por vários bacteriófagos. 
o Década de 60 – descoberta de um sistema enzimático bacteriano que 
reconhecia e destruía selectivamente DNA estranho, enquanto que modificava 
o DNA endógeno, prevenindo a sua destruição. 
 
 Extractos bacterianos capazes de clivar DNA fágico devido à presença de 
nucleases as quais eram capazes de reconhecer e cortar DNA. 
 
 Endonucleases – cortam DNA em posições internas 
 Exonucleases – cortam DNA externamente 
 
Para além da actividade nuclease, algumas enzimas apresentavam a capacidade de 
modificar o DNA por metilação de nucleótidos dentro da sequência por elas 
reconhecida: 
 
 
Modificação do DNA – Metilação 
 
 
 
 
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Exemplos de metilação 
 
 
 
Metilações mais frequentes 
 
 M6A-N6-metiladenina 
 M5C-C5-metilcitosina 
 M4C-C4-metilcitosina 
 Hm5C-C5-hidroximetilcitosina 
 
O DNA metilado pode ser passado à descendência. O X está 
protegido, ou seja, o seu DNA está protegido pelo sistema de 
metilação. 
As bactérias que se protegem os fagos pela metilação. 
Os sistemas de modificação-restrição são e metilação são 
específicos para cada estirpe. 
 
 
O sistema de modificação-restrição e metilação têm que reconhecer uma sequência da 
estirpe em locais específicos. 
 
Se ocorrer um erro na metilação, o próprio fago pode ser metilado e fica protegido. 
 
Tipos de Sistemas de restrição‐metilação com base na composição das subunidades, 
tipo de clivagem, tipo de especificidade, necessidade de co‐factores 
 
Tipo I – são enzimas complexas, multiméricas, combinando as duas actividades de 
restrição e modificação, e cortam o DNA em locais aleatórios e distantes do local de 
reconhecimento. Consomem ATP na reacção da hidrólise.Não têm aplicação prática 
no laboratório. 
 
Tipo II – cortam o DNA dentro ou próximo da sequência de reconhecimento, 
produzem fragmentos de DNA discretos, que formam padrões de bandas 
característicos, e são as únicas usadas no laboratório para análise de DNA e clonagem. 
Não necessitam de ATP para a hidrólise, apenas Mg++. 
 
Tipo III – são também enzimas com actividade de restrição e modificação. Cortam fora 
da sequência de reconhecimento e necessitam de duas dessas sequência em 
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orientações opostas, numa mesma molécula de DNA, para executar a clivagem. 
Raramente produzem digestões completas, e também consomem ATP. 
 
Características das enzimas dos Sistemas de Modificação-Restrição de tipo I, II, III 
 
 
 
Enzimas de tipo I ligam-se à sequencia alvo, metilando-a, ou clivando o DNA, 
consoante o estado de metilação deste 
 
 
 
 
Tipo I 
 
Para clonagem de sequências de DNA desconhecido na E.coli, a mais importante é o 
sistema tipo I, codificado por hsdR, hsdM e hsdS, o sistema de restrição EcoK. 
 
Os produtos dos três genes formam uma enzima multimérica capaz de clivar ou metilar 
um sequência alvo particular (5’-AAC[N6]GTGC-3’ na E.coli estirpe K-12). 
 
 O sistema de restrição EcoK do tipo I é codificado pelos genes hsdSMR. (hsd significa 
“especificidade para o DNA hospedeiro). O gene hsdS 
produz a subunidade de especificidade que reconhece a 
sequência de DNA: 
 
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Se a sequência alvo é hemimetilada (apenas uma cadeia é metilada e ocorre durante a 
replicação do DNA no cromossoma do hospedeiro), então a enzima actua como 
metilase e protege a sequência da clivagem. 
 
Se a sequência não é metilada em nenhuma cadeia, então a enzima actua como uma 
endonuclease de restrição e corta a sequência alvo. 
 
Normalmente, o DNA de outro organismo não será metilado na sua sequência alvo e 
será degradada quando introduzida na cadeia os tipos dos três genes. 
 
O sistema de restrição EcoK codifica proteínas que degradam DNA estranho que não 
é, propriamente, metilado na sequência 5’-AAC-(N)5-GTGC-3’ que irá ocorrer no DNA 
clonado. 
 
 
 
Quais são os efeitos do sistema de modificação-restrição do DNA bacteriano na 
clonagem e manipulação do DNA da E.coli? 
 
O gene hsdR é necessário apenas para a clivagem da sequência alvo pela 
endonuclease. 
Os genes hsdM e hsdS são necessários e suficientes para a metilação da sequência 
alvo. 
As estirpes de E.coli que são mutadas pelo gene hsdR são denominadas de minus 
restrição, modificação mais fenótipo (r-, m+). 
 
Genótipos e fenótipos de mutantes hsd no sistema EcoK 
 
 
 
A subunidade hsdM é indispensável à função de restrição por hsdR 
 
 
 
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O tipo II inclui as típicas enzimas de restrição utilizadas na biologia molecular. 
 
 
 
Sequências de reconhecimento das enzimas de restrição 
 
 
 
O segundo tipo do sistema modificação-restrição consiste das endonucleases que 
clivam, directamente, o DNA alvo que é metilado em certas sequências. 
Na E.coli existe dois tipos de sistema de restrição metil-citosina denominados de McrA 
e McrBC. 
 
Nenhum destes sistemas cliva DNA que foi metilado por enzimas do tipo I (codificadas 
pelos genes hsdRMS), sistemas Dcm ou Dam. 
 
Ambos os sistemas McrA e McrBC restringem DNA hemimetilado assim como DNA 
metilado nas duas cadeias. O DNA que foi metilado pela metilase Sss (metila as 
citosinas do dinucleótido CG) e pela metilase Hpa II (metila a segunda citosina da 
sequência 5’-CCGG-3’) são restringidas pelo sistema McrA (4,5). 
 
O segundo tipo de sistema de modificação é o complexo mcrA/mcrB/mrr que degrada 
o DNA estranho e que não é propriamente metilado, como o DNA metilado obtido de 
células do rato ou humanas que contêm CpG DNA metilado. 
 
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Quais os efeitos do sistema modificação-restrição do DNA bacteriano na clonagem e 
manipulação do DNA na E.coli? 
 
O DNA de mamíferos tende a metilar as citosinas nas sequências CG e DNA de plantas 
nas citosinas das sequências CNG. É recomendado em estirpes que são mutadas por 
esses sistemas (mcrA/mcrB/mrr) para aumentar a recuperação do DNA genómico 
propagado na E.coli durante as experiências de clonagem. 
 
E.coli K12 (MG1655) – sistemas de restrição 
 
Segundo a informação do Ecocyc e Escherichia coli e Salmonella, o seguinte sistema de 
restrição é encontrado na E.coli K12. 
Contém enzimas de restrição EcoK do tipo I codificadas pelo hsdR que cliva na 
sequência AAC(N6)GTCG, se o segundo A é não metilado. Contém também o sistema 
Mcr. Este sistema de restrição não parece ter uma sequência, apenas corta nos 
resíduos metilados. 
O sistema mrr, também contido nesta bactéria, que cliva resíduos de m6A e m5C. a 
sequência de especificidade é desconhecida. 
 
A presença do gene hsdR no MG1655 pode explicar porque é que plasmídeos (exemplo 
pSB4A3 e pCH1497-ASD1) que contêm sequência de reconhecimento para a função da 
EcoK incerta na MG1655. Pelo contraste, constrói o que não contém a sequência para 
a função da EcoK na MG1655. 
 
Metilação do DNA 
 
A maioria das estirpes de E.coli contém duas enzimas que metilam o DNA: 
 
1. dam metiltransferase (DNA Adenina Metilase) 
 Responsável por mais de 90% da metilação do DNA; 
 Introduz grupos metilo na posição N6 da adenina na sequência 5’ GATC 
3’ 
 As estirpes bacterianas mutantes nesta enzima designam-se por dam- 
 
19 
 
 
 
2. dcm metiltransferase (DNA Citosina Metilase) 
 Introduz grupos metilo na posição C5 da citosina 
mais interna da sequência 5’ CCAGG 3’; 
 As estirpes bacterianas mutantes nesta enzima 
designam-se por dcm- 
 
 
As estirpes bacterianas mais correntemente usadas em Biologia 
molecular são geralmente dam- e dcm-, em simultâneo, de 
modo a garantir que o DNA clonado não seja metilado e possa 
ser processado pela maioria das enzimas de restrição 
disponíveis. 
 
 
Ao pegar num plasmídeo e coloca-lo numa bactéria Rk- Mk-. Purifica-o e coloca-o 
numa estirpe Rk + o plasmídeo propaga-se ? 
Sim, o plasmídeo propaga-se porque está protegido pois foi metilado pela bactéria. 
 
Sequências de reconhecimento sobrepostas total ou parcialmente às sequências de 
metiltransferases são um indicador de que bases metiladas podem impedir a acção das 
enzimas de restrição. 
20 
 
 
 
Quadro resumo: 
 
 
 
Marcadores moleculares 
 
Os marcadores específicos serve para estudar as variações a nível das populações, 
espécie, ou seja, estudar os polimorfismos (variações fisiológicas). 
 
Usando polimorfismos visíveis 
 
Vantagens Desvantagens 
Pouco dispendioso para contar Polimorfismos visíveis raros 
Passíveis de experimentar nas populações 
naturais 
Maioria das variações genéticas difíceis 
de visualizar 
 Base da variação genética pode ser 
complexa e não é necessariamente fácil 
de determinar 
 Espécies secretas 
 
Porque é que nos preocupamos com as variações? 
 
Estudamos as variações para estudar: 
 As diferenças fenótipicas subjacentes; 
 O que causa doenças hereditárias; 
 Para permitir o historial humano (antigo e moderno) 
21 
 
Polimorfismos bioquímicos 
 
Marcadores bioquímicos 
 
Proteínas aloenzimas 
 
Variâncias electroforéticas das proteínas produzidas por diferentes alelos dos genes 
codificantes de proteínas. 
 
Método: 
1. Homogenizar o tecido; 
2. Separar o extracto por electroforese num gel de 
amido. Coloca-se o gel numa solução com 
reagentes que necessitam de actividade 
enzimática da enzima que estamos a monitorizar. 
3. Mancha-se o gel com um corante que a enzima pode catalisar num reagente 
com cor que mancha a proteína. 
 
Usando polimorfismos proteicos 
 
Vantagens Desvantagens 
Pouco dispendioso Apenas revela uma pequena proporção 
da variação de DNA 
Marcadores são co-dominantes 
(marcadoresco-dominantes analisa um 
locus 
Muitas variâncias de DNA não resultam 
em mudanças na sequência de 
aminoácidos (e.x. substituições 
sinónimas) 
 Algumas mudanças na sequência de 
aminoácidos não resultam em mudanças 
na mobilidade no gel. 
 
Polimorfismos moleculares 
 
Marcadores moleculares 
 
Marcadores moleculares são baseados em polimorfismos que ocorrem naturalmente 
na sequência de DNA (e.x. delecções de par de bases, substituições, inversões, adições 
e repetições). 
Existe vários métodos para detectar e amplificar estes polimorfismos: 
 RFLP 
 RAPD 
 AFLP 
 
Existe cinco condições que caracterizam um marcador molecular adequado: 
 Tem que ser polimórfico; 
 De preferência co-dominante; 
 Distribuído pelo genoma frequentemente e aleatoriamente; 
22 
 
 Fácil e barato de detectar; 
 Reprodutível 
 
Um primer amplificando um marcador dominante pode amplificar vários loci na 
mesma amostra de DNA com uma única reacção de PCR. Um marcador co-dominante 
analisa um apenas um locus. Um primer que amplifica um marcador co-dominante 
produziria o produto pretendido. 
 
Os marcadores moleculares podem ser utilizados em diferentes aplicações: 
 
 Caracterização do germplasma (colecção de recursos genéticos de um 
organismo); 
 Diagnóstico genético (doenças, etc.); 
 Caracterização de transformantes (e.x. análise e detecção GMO); 
 Estudos de paternidade e forenses; 
 Estudos do presente e do passado sobre a distribuição e ecologia das 
populações; 
 Genética da população e fluxo de genes; 
 Estudo do genoma; 
 Delimitação de espécies e análise filogénica. 
 
Técnicas usadas para a análise de marcadores moleculares 
 
As técnicas utilizadas para a análise de marcadores moleculares são: 
 Digestão por enzimas de restrição; 
 Electroforese; 
 PCR; 
 Por vezes a combinação de todas (RFLP-PCR) 
 
Técnicas de marcadores moleculares 
 
Restriction fragment length polymorphism (RFLP) 
 
 Esta técnica envolve a digestão do DNA genómico por enzimas de restrição. 
 As enzimas de restrição são isoladas de bactérias e consistem em cortar o DNA 
em locais específicos na sequência de par de bases, em que são denominados 
de locais de restrição. 
 Os locais de restrição não estão associados a nenhum tipo de gene e 
encontram-se distribuídos aleatoriamente pelo genoma. 
 Quando o DNA genómico é digerido por uma ou mais enzimas de restrição, 
uma série de fragmentos são produzidos em vários comprimentos. 
 Os fragmentos são separados por electroforese em gel de agarose ou em gel de 
poliacrilamida (PAGE) produzem certas características. 
 As variações das características da digestão de RFLP pode ser causados por: 
o Delecções de par de bases; 
o Substituições; 
23 
 
o Inversões; 
o Translocações e transposições 
 Os resultados são perda ou ganho de locais de reconhecimento, resultando 
num fragmento de diferente tamanho e polimorfismo. 
 Os locais de restrição são, muitas vezes, palindrómicos 
 
 
 
Usando RFPL polimorfismos 
 
Vantagens Desvantagens 
Variantes são co-dominantes Trabalho intensivo 
Variações das medidas ao nível da 
sequência de DNA, não na sequência da 
proteína 
Requere grandes quantidades de DNA 
 
PCR baseado nos marcadores moleculares 
 
Randomly amplified polymorphormic DNA markers (RAPD) 
 
 RAPD foram os primeiros PCR baseados em marcadores moleculares 
desenvolvidos e os mais simples; 
 Pequenos primers de PCR (aproximadamente de 10 bases) são aleatoriamente 
e arbitrariamente seleccionados para amplificarem segmentos de DNA do 
genoma; 
 Os produtos da amplificação são criados na região que flanqueia os locais dos 
10 bp na orientação apropriada; 
 RADP, muitas vezes mostram relações dominantes devido ao primer ser 
incapaz de ligar-se a alelos recessivos; 
 Os produtos de RAPD são, normalmente, visualizados em gel de agarose corado 
com brometo de etídio, SYBR Safe, Gel Red ou outros corantes de DNA. 
 
 
 
 
 
 
24 
 
Vantagens Desvantagens 
Rápido Marcadores são dominantes 
Pouco dispendioso Presença de uma banda pode significar 
que o indivíduo é ou heterozigótico ou 
homozigótico para a sequência 
Grande variedade Análise da informação mais complicada 
 
Simple sequence repeats / microssatélites 
 
São repetições de pequenas sequências do genoma de todos os eucariontes e consiste 
em várias a centenas de repetições de 1 a 4 motivos nucleóticos. 
 
 
Amplified fragment lenght polymorphism (AFLP) 
 
 AFLP é um método altamente sensível baseado na combinação dos conceitos 
RFLP e RAPD; 
 Esta técnica é aplicada a todas as espécies, dando resultados reprodutíveis; 
 A base do AFLP é o amplificação por PCR com corte dos fragmentos do DNA 
genómico com enzimas de restrição. 
 
Fragmentos restritos produzidos por um cortar 
frequente (MseI) e um cortador raro (EcoRI). 
 
Os adaptadores consistem na sequência núcleo mais 
enzimas específicas para a sequência. A sequencia 
núcleo é um segmento de DNA conhecida (20 
nucleótidos) que vai ser utilizado como primer no 
próximo PCR. 
 
 
Adaptadores usados como primers. Para uma primeira selecção dos fragmentos 
apenas amplificamos DNA que tenha um adaptador ligado em ambas as extremidades. 
Em adição, os primers têm uma base adicional permitindo a amplificação de um quarto 
com o adaptador em ambas as extremidades. 
 
 
25 
 
Três mais nucleótidos são adicionados ao primer da amplificação anterior. A 
amplificação é mais selectiva e os fragmentos restritos diminuem. Um dos primers é 
marcado com fluorescentes para futura visualização. 
 
 
 
Electroforese 
 
 Um capilar fino contendo um polímero substitui o usual gel de acrilamida. As 
condições da electroforese podem ser resolver a diferenciação de fragmentos 
de DNA apenas com um par de bases. 
 As amostras são carregadas numa faixa e correm uma atrás das outras através 
do capilar. Todos os fragmentos são separados pelo tamanho. 
 Depois de passarem o laser, um corante liga-se ao primer, que excita e emite 
um sinal fluorescente que é recolhido por computador. O resulta da 
fluorescência é visualizado no computador. 
 
 
Vantagens Desvantagens 
Rápido Marcador é dominante 
Barato A presença de uma banda significa que o 
individuo ou é heterozigótico ou 
homozigótico para a sequência 
Grande variedade 
 
Variable number tandem repeats (VNTR) 
 
 Regiões não codificantes; 
 Várias cópias da mesma sequência; 
 Grande quantidade de variações entre indivíduos no número de cópias; 
 Usado para DNA fingerprinting; 
 Microssatélites, minissatélites, short tandem repeats (STR), simple sequence 
repeats (SSR); 
 ISSR – inter-simple sequence repeats 
 
O desenho de primers para flanquear a região é necessário. 
 
 
 
 
26 
 
Microssatélites 
 
 VNTRs mais útil; 
 2, 3 ou 4 par de bases repetidas; 
 De algumas a 100 cópias tandem; 
 Grande variedade; 
 Vários microssatélites loci (1000s) diferentes em várias espécies. 
 
Vantagens Desvantagens 
Grande variedade Relativamente dispendioso e com 
consumo de tempo para desenvolver 
Grande evolução 
Co-dominante 
 
 Usado em estudos de populações; 
 Não muito entre estudos entre populações que evoluem muito; 
 Análise de paternidade ou outros estudos de parentesco 
 
Single nucleotide polymorphisms -SNP 
 
 Variação da sequência de DNA ocorre quando um único nucleótido, no genoma 
(ou outra sequência partilhada) difere entre membros da espécie ou 
emparelhados; 
 Exemplo: duas sequências de fragmentos de DNA de diferentes individuos. 
AAGCCTA para AAGCTTA, contém a diferença num único nucleótico. Neste caso 
são dois alelos : C e T. 
 Quase todosos SNPs têm apenas dois alelos. 
 
Conceitos chaves de SNP 
 
 Definição – mais do que uma base alternativa ocorre numa frequência 
apreciável; 
 Disponibilidade - mais de 10 milhões de SNPs têm sido identificados no genoma 
humano; 
 Função – maioria dos SNPs são neutros e menos de 1% presente em regiões 
codificantes de proteínas. 
 
Os SNP são os: 
 O polimorfismo genético mais comum 
 Distribuído pelo genoma com grande densidade 
 Grande causa da diversidade genética entre diferentes indivíduos, como por 
exemplo, resposta a drogas, susceptibilidade a doenças. 
 Facilita uma grande escala genética associado a estudos como marcadores 
genéticos. 
 Maioria dos SNPs não alteram a síntese proteica nem causam doenças 
directamente. Servem como marcadores, uma vez que podem ser fisicamente 
27 
 
semelhantes ao local da mutação no cromossoma. Por causa desta 
proximidade, os SNPs podem ser partilhados entre grupos de pessoas com 
características comuns. 
 Analisando o padrão de SNP entre diferentes grupos de pessoas podem 
esclarecer a evolução da raça humana e compreender grupos étnicos e raças. 
 
 
 
Locais SNP 
 
 SNPs ligado ou iSNPs não residem entre genes e não afectam o funcionamento 
da proteína. Contudo, eles correspondem a uma resposta a uma droga 
particular ou ao risco de apanhar uma certa doença. 
 
 SNPs causativos afecta a forma como uma proteína funciona, 
correlacionando a doenças ou influenciando a resposta de uma 
pessoa à medicação. SNPs causativos acontecem em duas 
formas: 
 
o Coding SNPs ou cSNPs localizados entre regiões 
codificantes de um gene, alterando a sequência de 
aminoácidos do produto do gene da proteína. 
o Non-coding SNPs or rSNPs, localizados entre a sequencia 
regulatória do gene, alterando o nível da expressão 
genica e, portanto, quanto RNA e proteína é produzida. 
 
 
pUC19 – um plasmídeo de engenharia genética 
 
 2,7KB (pequeno tamanho permite grande espaço para inserir DNA) 
 DNA não genómico circular 
o DNA do fago lambda é linear e muito maior (48,5kb) 
 Tem uma origem de replicação e um grande número de cópias (200/célula) 
 Gene resistente à ampicilina 
o Codifica uma enzima que liga e degrada a ampicilina 
 Gene Lac Z (parte do operão Lac) 
o Codifica a β-galactosidase 
o Uma enzima que degrada a lactose em glucose e galactose 
28 
 
o Local múltiplo de clonagem dentro do LacZ 
 Contém sequências de reconhecimento para várias enzimas de 
restrição 
 A ruptura deste local previne a produção de β-galactosidase 
 
 
 
Digestão restrita do plasmídeo pUC19 e fago lambda (λ) 
 
Usa a enzima de restrição Hind III para cortar tanto o plasmídeo pUC19 e o fago 
lambda. A sequência de restrição para o Hind III é A.AGCTT. esta sequência específica 
ocorre uma vez no pUC19 e sete vezes no fago lambda. 
Um local do pUC19 cria uma porção de DNA linear quando cortada. 
Sete locais do lambda origina oito fragmentos quando cortado. 
Os fragmentos de DNA serão separados e analisados em gel de agarose. 
 
Enzimas de restrição 
 
Na base das experiências clássicas de Berg e de Boyer-Cohen-Chang estão as enzimas 
de restrição. Os cientistas logo se aperceberam que as enzimas de restrição podiam 
constituir uma ferramenta notável para investigar a organização, função e expressão 
génicas. 
 
As enzimas de restrição clivam o DNA em locais específicos: 
 
1. Produzindo fragmentos de tamanho discreto que podem ser 
analisados por electroforese. 
 
 
 
 
2. Constituindo um auxiliar precioso na clonagem de 
DNA e permitindo a manipulação de fragmentos de 
DNA relativamente pequenos 
 
 
 
29 
 
As enzimas de restrição (ou endonucleases de restrição) foram descobertas em 1970 
durante investigações sobre o fenómeno de modificação e restrição de bacteriófagos 
pelo hospedeiro. A restrição à infecção resulta da acção de “enzimas de restrição” em 
combinação com DNA-metiltransferases. Estas metilam o DNA bacteriano próprio, 
tornando-o por sua vez resistente à acção das endonucleases, que assim actuam 
unicamente sobre o DNA viral. 
 
Endonuclease + metilase: 
sistema que protege o DNA 
do hospedeiro e digere o 
DNA viral 
 
 
 
 
 
 
Nomenclatura das enzimas de restrição 
 
 
 
Mais de 250 enzimas de restrição com diferentes especificidades de sequência foram 
já caracterizadas. A maioria reconhece sequências simétricas, palindrómicas (porque 
se ligam ao DNA como homodímeros), e portanto que se lêem de igual modo em 
ambas as cadeias. 
 
Taq I 
 
 Microrganismo: Thermusaquaticus 
 A sequência de reconhecimento é 
simétrica (palindrómica), composta 
por 4 pares de bases. A enzima 
produz extremidades coesivas (em 
cadeia simples), de 2 bases, 5’-
protuberantes. 
 
As duas extremidades deixadas pelo corte da enzima são iguais? 
 
 
Palindrómica – molécula de DNA que dá para ler igualmente nos dois sentidos. Tem 
simetria 
30 
 
Hha I 
 
Microrganismo: Haemophilushaemolyticus 
A enzima produz extremidades coesivas 3’-
protuberantes. 
 
Sma I 
 
Microrganismo: Serratiamarcescens 
A sequência de reconhecimento é composta por 6 
pares de bases. 
A enzima produz extremidades não coesivas (em 
cadeia dupla). 
 
 
BbvCI 
 
Microrganismo: Bacillusbrevis 
A enzima tem uma sequência de reconhecimento 
assimétrica (não palindrómica). 
A forma activa da enzima é um heterodímero. 
 
DdeI 
 
Microrganismo: Desulfovibrio desulfuricans 
N pode ser qualquer base. 
Esta enzima reconhece em cada uma das cadeias 
qualquer das 4 sequências CTAAG, CTTAG, 
CTGAG, CTCAG (contudo, estas representam 
apenas 2 locais de ligação diferentes). 
 
MboII 
 
Microrganismo: Moraxellabovis 
A sequência de reconhecimento é contínua e 
assimétrica. A enzima corta o DNA fora da sequência 
de reconhecimento. Possui dois domínios, um de 
ligação ao DNA, outro de clivagem. 
Extremidade coesiva de uma base (N-3’). 
 
SfiI 
 
Microrganismo: Streptomycesfimbriatus 
A sequência de reconhecimento é descontínua. 
As metades da sequência de reconhecimento 
encontram-se separadas por 5 bases. 
 
31 
 
NotI 
 
Microrganismo: Nocardia otitidiscaviarum 
A enzima tem uma sequência de reconhecimento de 8 
pares de bases, e corta o DNA, em média, muito 
raramente. Extremidades coesivas de 4 bases. 
 
Isoesquizómeros são a mesma sequência de reconhecimento e mesmo local de corte. 
Por ex. EcoRIe FunII 
 
 
 
Neoesquizómeros são um subconjunto dos isoesquizómeros: a mesma sequência de 
reconhecimento mas local de corte diferente. Por ex. SacIe Ecl136II 
 
 
 
 
 Nos neoesquizómeros, a mesma sequência de reconhecimento mas local de corte 
diferente. Por ex. ApaI e Bsp120I 
 
 
 
As enzimas Bsp120I , EaeI e EagI têm sequências de reconhecimento diferentes da de 
NotI, e diferentes entre si, mas originam extremidades compatíveis(Y=Py=pirimidina; 
R=Pu=purina) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
32 
 
Nomenclatura para bases específicas incompletas nos ácidos nucleicos Sequences 
 
Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB), 1984 
 
 
A sequência de reconhecimento das enzimas de restrição representa-se normalmente 
em cadeia simples 
 
 
A sequência de reconhecimento da HindIII é 5’-aagctt e portanto não corta na 
sequência representada abaixo. 
 
 
A frequência de corte das enzimas de restrição depende essencialmente do número de 
bases da sequência de reconhecimento, mas é desviado fortemente pela composição 
de bases do DNA e da presença de bases metiladas 
 4 bp-> 256 bp em média (44) 
 6 bp-> 4096 bp em média (46) 
 8 bp-> 65 536 bp em média (48) 
 
Afectado por: 
 Composição de bases do DNA 
 Presença de bases metiladas 
 
 
 
 
 
 
33 
 
Star activity 
 
Staractivity é quando algumas enzimas apresentam relaxamento de especificidade sob 
certas condições experimentais in vitro. 
Por ex. BamHI, em condições de baixa força iónica, reconhece e cliva, para além de 
G/GATCC: 
o N/GATCC 
o G/RATCC 
o G/GNTCC 
 
Condições que contribuem para a actividade “star” de algumas enzimas de restrição 
 
 Concentração elevada de glicerol [>5% v/v] 
 Proporção Enzima/DNA elevada [Variável para diferentes enzimas, 
normalmente >100 U/μg] 
 Força iónica baixa [<25 mM] 
 pH alto [>pH 8.0] 
 Presença de solventes orgânico s[DMSO, etanol, etilenoglicol, 
dimetilacetamida, dimetilformamida] 
 Substituição de Mg++ por outros catiões divalentes [Mn++, Cu++, Co++, Zn++] 
 
 
Subtipos de enzimas de restrição de tipo II 
 
 
 
SalI e SacI originam extremidades compatíveis? 
 
SacI: GAGCTC 
SalI: GTCGAC 
 
BamHI, PsuIe BglII têm extremidades compatíveis? 
Depois de ligar dois fragmentos de DNA, um cortado com BamHI, o outro com PsuI, 
pode-se voltar a cortar com BamHI? 
Depois de ligar dois fragmentos de DNA, um cortado com BamHI, o outro com BglII, 
pode-se voltar a cortar com BamHI ? E com BglII? 
 
34 
 
 
 
Exemplo de um mapa de restrição 
 
 
 
Frequentemente as enzimas de restrição não são eficientes na reacção de hidrólise 
quando a sequência de reconhecimento se encontra demasiado perto da extremidade 
da molécula 
 
 
 A DNA ligase cataliza a formação de ligações fosfodiéster entre grupos terminais 5’-
fosfato e 3’-hidroxilo justapostos, em moléculas de DNA em cadeia dupla, com 
extremidades coesivas ou não. Não tem actividade sobre ácidos nucleicos de cadeia 
simples. 
35 
 
 
 
Reacção catalisada pela DNA ligase: 
 
ATP + (desoxirribonucleótido)n + (desoxirribonucleótido)m= AMP + PPi+ 
(desoxirribonucleótido)n+m 
 
 
 
 
Ligação 
 
 A ligação é a junção de fragmentos de DNA no vector molecular, 
como um plasmídeo ou um bacteriófago, que pode ser replicado 
pela célula hospedeira depois da transformação. A junção ou 
ligação dos fragmentos de DNA é realizado por uma enzima 
conhecida como DNA ligase. 
 
O papel natural da DNA ligase é reparar espaços numa cadeia no 
ligação açúcar – fosfato de uma cadeia dupla de DNA, tal como 
ocorre através de danos no ADN. 
 
A actividade catalítica da enzima necessita da presença de ATP e Mg++. DNAs em que 
falta os resíduos de fosfato, podem ser capazes da ligação por fosforilação da cinase 
polinucleótica T4. A enzima, também, cataliza uma reacção adicional de fosfato entre a 
pirofosfato e ATP. 
 
1. Ligação do DNA, por complementariedade, a terminações coesivas 
 
36 
 
 
2. Reacção de reparação 
 
 
 
 A acção de ligação necessita que o espaço (nick) exponha o 
grupo 3’OH e 5’-fosfato. A digestão com endonucleases de 
restrição corta o DNA dessa forma, por exemplo, deixa o fosfato 
na posição 5’ da desoxirribose. O emparelhamento instável dos 
dois fragmentos de restrição com extremidades compatíveis 
podem, portanto, ser consideradas como moléculas de DNA de 
cadeia dupla com espaços em cada cadeias e, por isso, um 
substrato para a acção da DNA ligase. 
 
 
A T4 DNA Ligase pode ligar extremidades “blunt” mas com 
menor eficiência. 
Algumas DNA ligases, como a T4 DNA ligase (codificada 
pelo bacteriófago T4), é, também, capaz de ligar 
extremidades “blunt”, embora com menos eficiência, 
enquanto outras (a E.coli ligase) não são capazes. Apenas 
se considera a acção da T4 DNA ligase, que é, de longe, a 
mais extensível de se usar. 
Referimos-nos à enzima como T4 ligase (ou só ligase) 
embora é também T4 RNA ligase. 
 
A T4 ligase necessita de ATP como co-substrato. No primeiro passo, a ligase reage com 
o ATP para formar uma enzima covalente, o AMP complexo, que por sua vez reage 
com 5’-fosfato no local do espaço (nick), transferindo o AMP para o grupo fosfato. O 
ultimo passo é o ataque pelo grupo 3’OH, formando uma nova ligação fosfodiéster 
covalente (que restaura a integridade do açúcar-fosfato) e liberta o AMP. A absoluta 
exigência para o 5’-fosfato é extremamente importante; pela remoção do 5’-fosfato, 
consegue-se a prevenção da ocorrência de ligações indesejadas. 
 
 
 
37 
 
Exemplo de remoção do fosfato para impedir ligação 
(religação de vectores) 
Qual a enzima utilizada para remoção do fosfato? 
 
Desde a reacção, que se que quer, normalmente, envolver duas moléculas diferentes 
de DNA (ligação intermolecular), que se espera ser extremamente sensível para a 
concentração de DNA. Portanto, é importante usar altas concentrações de DNA, mas 
que componente de DNA? 
 
Temos dois componentes, o vector e o insert (ignorando por momento, o facto do 
insert pode ser, ele próprio, uma mistura de fragmentos). Existe, portanto, uma 
variedade de possibilidades de reacções que podem ocorrer, assim como, a 
concentração global de DNA, que se pode influenciar a probabilidade destas diferentes 
reacções. 
 
Qual a probabilidade de qualquer destes produtos de reacção ocorrer 
preferencialmente? 
Podemos influenciar o tipo de produto preferencialmente obtido manipulando a 
quantidade e a concentração do DNA? (que DNA?) 
 
A baixas concentrações de DNA, é mais provável ter a junção (por reacção 
intramolecular) de duas extremidades da mesma molécula, desde que a taxa da 
reacção que envolve uma reacção será linearmente relacionado com a concentração, 
assim como, a taxa com dois componentes diferentes, será proporcional ao produto 
das duas concentrações. (ou a reacção que envolve duas moléculas do mesmo 
substrato, a taxa será proporcional ao quadrado da concentração). Portanto, 
aumentando a concentração, será dado um maior aumento da taxa da reacção 
intermolecular (entre duas moléculas) do que numa reacção intramolecular. 
 
 
 
Se aumentar-mos a concentração do vector mas não do insert, teremos um maior 
aumento da ligação entre dois vectores (que não pretendemos) do que na produção 
38 
 
de vector-insert recombinante. Reciprocamente, aumentando a concentração do 
insert, teremos um aumento dos níveis de dímeros insert-insert (que, também, não 
pretendemos, apesar de serem de menor problema como não vão dar origem a 
transformados. 
Assim, não só precisamos de manter a concentração de DNA alta, mas também criar 
um óptima relação vector:insert. Não é fácil prever que relação deve ser, mas 
tipicamente será no intervalo de 3:1 a 1:3. De notar que são as relações molares e tem 
que se ter em conta o tamanho relativo do vector e do insert. Por exemplo, se o vector 
tem 5kb e o insert tem 500 bases, então uma relação molar de 1:1 envolveria 10 vezes 
mais vector, por peso, do que insert (e.x. 500ng de vector e 50 ng de insert). 
Reciprocamente, para o mesmo vector mas um vector com tamanho de 50kb, se 
usarmos 500ng de vector, precisaríamos de 5µg de insert para alcançar a relação molar 
de 1:1. No geral, para converter a quantidade de DNA por peso num valor que pode 
ser usado para calcular a relação molar, dividimos a quantidade usada (por peso) pelo 
tamanho do DNA. Assim, se Wv e Wt são os pesos usados para o vector e para o insert 
de DNA, respectivamente, e Sv e St para o tamanho do vector e do insert (e.x. em 
kilobases (kb)), então, a relação vector:insert é (Wv/Sv):(Wt/St). 
 
Exercício 
 
Qual a massa de vector e insert respectivamente com 5 kb e 500 bp, para obter uma 
ligação na proporção molecular de 1:1 (partindo de uma massa de 500 ng de vector)? 
 
Estimada a concentração do vector e do insert pelo gel de agarose ou por 
manuseamento OD. 
Testa-se várias relações vector:insert para descobrir a melhor relação. Na maioria dos 
casos, as melhores relações são de 1:1 ou 1:3. 
 
Formula: 
 
((ng vector) X (tamanho do insert em kb)) / ((tamanho do vector em kb) X (relaçãomolar do vector:insert) = (ng do insert) 
 
Exemplo: 500bp de insert vão ser ligados com 100ng de um vector com 3,0kb numa 
relação de 3:1 
 
((100ng vector) X (0,5kb de insert) / (3,0 kb de vector) X (3/1)) = (50ng insert) 
 
 
 
 
 
 
39 
 
Algumas reacções de ligação possíveis 
 
 
Recombinante Sem insert Fragmentos Sem ligação 
 
Clonagem de fragmentos de DNA 
1. Extremidades protuberantes 
Compromisso - usar concentrações equimolares de plasmídeo e de insert na reacção 
de ligação. 
Não respeitando esta relação: 
 Maior quantidade de plasmídeo religados; 
 Maior quantidade de insert – maior quantidade de plasmídeos contendo 
repetições do insert (insert em tandem) 
 
Verificar que resultados foram obtidos: 
 Análise do DNA recombinante com enzimas de restrição; 
 Sequenciação do DNA recombinante 
 PCR 
 
Necessidade de verificar a orientação do insert inserido 
 
Uma equação para calcular as relações volumétricas necessárias na reacção de ligação 
 
A reacção de ligação é fundamente importante para a Biologia Molecular, activando a 
junção do vector e dos fragmentos do insert de DNA para criar um novo plasmídeo de 
moléculas de DNA. É importante obter a relação correcta de vector:insert para uma 
óptimo geração de plasmídeos recombinantes e para reduzir a formação de ligações 
entre fragmentos, vectores religados, dímeros de plasmídeos e plasmídeos contendo 
múltiplos inserts. 
A ligação de reacção é, normalmente, realizada num volume total de 10-20µL a 4-37ºC 
(muitas vezes em temperatura ambiente) usando a enzima T4 DNA ligase, e um 
tampão que contém Mg2+ e ATP ( tipicamente de uma concentração stock 10 vezes 
maior com a que vamos trabalhar). A T4 DNA ligase cataliza a junção de terminações 
de DNA adjacentes por formação de ligações fosfodiéster usando ATP como cofactor e 
consegue ligar extremidades “blunt” ou coesivas compatíveis. Numa óptima reacção 
de ligação, o objectivo é inserir um único insert num vector, e as concentrações de 
40 
 
insert e vector que devemos utilizar que desfavorecem a formação de um anel 
monomolecular ou concamerico. 
Existentes equações de ligação apenas permite calcular uma relação molar 
vector:insert. Como o tamanho da molécula de DNA é directamente proporcional ao 
seu peso molecular, como equações que não oferecem nenhuma desvantagem sobre a 
simples determinação da relação do tamanho dos fragmentos. As equações descritas 
permite calcular facilmente o volume dos componentes dados na concentração do 
DNA e no tamanho dos fragmentos, tal como a relação molar vector:insert dada é 
alcançada e a reacção consiste nas soluções de DNA ligase, tampão, insert e vector 
DNA se forem necessárias. 
 
Na relação óptima, teórica, insert:vector que se deve-se ter em conta da relação da 
concentração em toda a reacção (i) com a concentração de uma extremidade de uma 
molécula de DNA num volume ocupado por outra extremidade da mesma molécula (j). 
o valor de j é inversamente proporcional ao tamanho do fragmento de DNA e 
independente da concentração do DNA, então, só será fixada para uma ligação dada. 
As variáveis são o total da concentração de DNA e a relação inser:vector. Para 
extremidades coesivas recomenda-se que j:i seja entre 1:1 e 1:3 (20-60ng/µL para 
clonar um vector do tamanho do pUC18) e a relação insert:vector seja 2:1 para o 
máximo rendimento de recombinantes úteis. 
 
Exemplo: 
 
Quanto insert de DNA 0,5kb deve ser adicionado para uma ligação em que 100ng de 
3kb de vector deve ser usado? A relação vector:insert desejada será 1:3 
 
 
 
 
 
 
 
 
Ligações de DNA podem ser frustantes 
 
A ligação de reacção tem dois passos básicos: 
1. Primeiro as extremidades de DNA têm de colidir por acaso e estarem juntas 
tempo suficiente para que a ligase as ligue. Este é a parte mais ineficiente da 
reacção. 
2. O segundo passo é a reacção enzimática, onde a DNA ligase cataliza a ligação 
de 3’OH com 5’-fosfato. 
 
Primeiro, os nucleótidos da AMP, que estão ligados aos resíduos de lisina na zona 
activa da enzima, são transferidos para o 5’-fosfato. 
41 
 
Depois, a ligação AMP-fosfato é ligado pela 3’OH, formando uma ligação covalente e 
libertando AMP. 
 
 
DNA ligase 
 
A ligação ocorre entre extremidades “blunt” ou extremidades pegajosas (sticky). As 
ligações das extremidades blunt não são eficientes. A ligase espera por um encontro. 
As ligações das extremidades “blunt” são, usualmente, feitas a altas concentrações. 
A ligação das extremidades “sticky” é mais eficiente. Pontes de hidrogénio forma um 
estado estável. 
 
 
Adicionando extremidades “sticky” (linkers) 
 
Linkers – são fragmentos de DNA pequenos de cadeia dupla e com extremidades 
“blunt”. Contém local de restrição de extremidades “sticky”. 
Linkers são, facilmente, adicionados no fim de uma extremidade “blunt” da molécula 
porque conseguem adicionar grandes quantidades. 
 
 Clivagem resulta em extremidades “sticky na molécula. 
 Potencial problema com os linkers 
 Adição de uma cauda homopolímera 
 
42 
 
 
 
O terminal da enzima desoxinucleótidos transferase (ou terminal transferase) adiciona 
nucleótidos na extremidade 3’ do DNA sem necessidade 
de um padrão. 
 
 
 
Desfosforilação 
 
Quando o DNA é tratado com a enzima alcalina fosfatase, os grupos 5’-fosfato são 
removidos. 
 
 
Se um vector linearlizado é desfosforilado, ele não consegue religar-se porque a 
enzima T4 DNA ligase necessita do grupo 5’-
fosfato presente. O fragmento de DNA em que o 
grupo 5’-fosfato encontra-se presente consegue 
formar uma ponte entre a extremidade 
desfosforilada e a inserção é favorecida. 
43 
 
Quando se tenta combinar duas moléculas, o grupo 5’-fosfato retirado não permite 
religar-se e estraga a construção. 
 
O que temos no fim: existe dois grandes espaços (nick) no produto final, porque duas 
das quatro ligações são prevenidas pela falta de 5’fosfato. A bactéria irá fixar os 
espaços depois do DNA ser transformado. 
 
DNA circular fechado covalentemente e DNA supercoiled 
 
O DNA de cadeia dupla circular fechado covalentemente é mostrado 
esquematicamente. A não ser uma das duas cadeias de DNA que fica com espaços, a 
torção da cadeia da hélice dupla não pode relaxar e a tensão induz uma formação 
espontânea de uma estrutura super enrolada mostrada à direita. 
O espaçamento de outra cadeia de DNA, alivia a tensão permitindo a rotação na 
extremidade livre. 
 
 
Clonagem de vectores plasmídicos 
 
Clonagem 
 
É a inserção de DNA de interesse num vector de clonagem capaz de replicação 
independente, e da respectiva propagação em células hospedeiro. Há muitos tipos de 
vectores de clonagem mas os mais usados são os plasmídeos. 
 
Os plasmídeos mais usados são aqueles que se 
multiplicam em Escherichia coli 
 Moléculas circulares de dsDNA 
 1,2–3kbp (máx.20kbp) 
 Capacidade de duplicação independente 
 
 
 
 
 
44 
 
Recombinação de plasmídeos 
 
1. Plasmídeo e DNA a clonar são cortados com a(s) mesma(s 
)enzima(s) de restrição 
 
2. Plasmídeo pode ser tratado com fosfatasealcalina que 
remove os grupos fosfato das extremidades 5’ do DNA, 
gerando grupos hidroxilo, impedindo assim a religação das 
duas extremidades do plasmídeo na presença da ligase. 
 
3. Incuba-se o DNA e o plasmídeo, na presença de ligase. 
 
 
Transformação 
 
É incubação de uma suspensão de E. coli competentes (células tratadas de modo a 
incorporarem mais facilmente DNA) com a reacçãode ligação. 
 
 
 
Selecção de células transformadas com gene de resistência a um antibiótico 
 
 
45 
 
Características básicas dos plasmídeos 
 
Origem de replicação (ORI) – permite a replicação do 
plasmídeo independentemente do DNA genómico. 
Local múltiplo de clonagem (MCS) – permite a inserção do 
fragmento a clonar–grande número de locais únicos de 
restrição. 
Marcador de selecção – permite seleccionar os hospedeiros 
que incorporaram o DNA “estranho” (ex: gene que confere 
resistência a um antibiótico, como a ampicilina) 
 
O controlo do número de cópias de plasmídeo/célula é feito pela origem de replicação: 
1 a mais de 100 cópias/célula. 
De um modo geral, os plasmídeos contêm uma só ORI, à qual estão associados 
elementos reguladores, que constituem uma “unidade genética” designada por 
Replicão. 
 
A maioria dos plasmídeos em uso possui um replicão derivado do pMB1 ou do ColE1, e 
que permite a manutenção de mais de 15 plasmídeos/célula – plasmídeos de controlo 
relaxado (ou “High-copyplasmids”) 
 
 
 
Plasmídeos de controlo restrito ou “Low-copy plasmids” 
 1 a 5 cópias/célula 
 São menos utilizados na biologia molecular, mas são úteis quando a presença 
de um número elevado de plasmídeos ou dos seus produtos é deletéria para o 
hospedeiro. 
 
Marcadores de selecção 
 
São genes, localizados no plasmídeo, que codificam proteínas relacionadas com a 
selecção das células transformadas. 
O mais comum é a resistência a antibióticos – quando as células são crescidas em 
meios de cultura, contendo um determinado antibiótico, apenas as que contêm o 
plasmídeo que confere resistência a esse antibiótico é que sobrevivem. 
46 
 
Os antibióticos não podem ser autoclavados. Habitualmente as soluções de 
antibióticos são esterilizadas por filtração (tamanho de poro 0,22 μm) e guardadas em 
alíquotas a -20 °C. 
São adicionados aos meios de cultura a temperaturas inferiores a 65 °C 
 
Antibióticos e genes resistentes a antibióticos 
 
 
 
Clonagem de fragmentos de DNA 
 
1. Extremidades protuberantes 
São os mais fáceis de clonar, uma vez que as 
extremidades foram criadas pela mesma enzima de 
restrição, deixando 1 a 6 nucleótidos em cadeia simples, que 
emparelharão com outros existentes no outro fragmento de 
DNA 
 
 
a) Usando uma enzima de restrição 
 
O DNA alvo pode ser introduzido no plasmídeo numa 
determinada orientação ou na orientação oposta. 
As moléculas de DNA recombinantes formadas correspondem a 
inúmeros produtos formados durante a reacção de ligação, entre 
os quais: plasmídeo vazio, produtos lineares ou circulares de 
plasmídeo/insert; plasmídeo/plasmídeo; insert/insert; 
plasmídeo/insert/insert; entre outros... 
Nos plasmídeos recombinantes o local de restrição usado deixa 
de ser único. 
47 
 
Compromisso – usar concentrações equimolares de plasmídeo e de insert na reacção 
de ligação. 
 
Não respeitando esta relação: maior quantidade de plasmídeo 
 Maior quantidade de plasmídeos religados 
 maior quantidade de insert - maior quantidade de plasmídeos contendo 
repetições do insert (inser tem tandem). 
 
Verificar que resultados foram obtidos: 
 Análise do DNA recombinante com enzimas de restrição 
 Sequenciação do DNA recombinante 
 PCR 
 
Necessário verificar a orientação do DNA inserido. 
 
b) Usando duas enzimas de restrição com extremidade incompatíveis (clonagem 
direccional) 
 
Permite aumentar o rendimento de moléculas recombinantes com inserção de um só 
fragmento 
 
 
 
Clonagem direccional usando enzimas de restrição com extremidades compatíveis 
Qualquer DNA alvo cortado com BamHI e com BglII pode entrar no 
plasmídeo em qualquer direcção, se este também tiver sido cortado 
com ambas as enzimas. 
Contudo, se uma das enzimas de restrição for incluída na reacção de 
ligação (ou se a enzima for usada para digerir o plasmideo 
recombinante antes da transformação) só as ligações BamHI/BglII (e 
vice-versa) darão origem a produtos recombinantes em E. coli 
 
 
 
48 
 
Extremidades 3’-A protuberantes de produtos de PCR obtidos com Taq DNA 
polimerase (TA cloning) 
 
A Taq DNA polimerase adiciona extremidades protuberantes 3’-A a cada extremidade 
dos produtos formados. Estes podem ser usados para inserirem vectores TA os quais 
possuem extremidades protuberantes 3’-T 
 
 
2. Extremidades em cadeia dupla (blunt-end cloning) 
 Comparativamente às anteriores é bastante menos eficiente. 
 Se razão molar plasmídeo/DNA alvo muito alta >> plasmídeos vazios 
 Se plasmídeo/DNA alvo >> muito baixa >> homo- e heteropolímeros de 
composição e orientação várias. 
 (A orientação e número de inserts em cada plasmideo recombinante 
têm sempre que ser validados por análise de restrição ou por qualquer 
outro processo) 
 Melhores resultados podem ser obtidos com quantidades equimolares 
de plasmídeo e de DNA alvo, com concentração total de DNA < 
100μg/ml 
 
 
 
 
 O pBR322 foi o primeiro plasmídeo a ser largamente usado pela comunidade 
científica: uma origem de replicação, um local de clonagem (BamHI), e dois genes de 
resistência a antibióticos. Permitiu identificar recombinantes por selecção negativa. 
 
49 
 
 
 
 
 Os plasmídeos de clonagem pUC constituíram um novo 
grande avanço nos métodos de clonagem. São derivados do 
pBR322 pela substituição do gene de resistência à 
tetraciclina por um segmento génico que codifica para 
parte da enzima beta-galactosidase. Podem ser usados em 
estirpes de E. coli que expressem a região carboxi-terminal 
da beta-galactosidase 
 
Regulação negativa do operão lac 
 
 
Indutores do operão lac, tais como o IPTG, 
inactivam a proteína repressora, 
resultando numa des-repressão 
transcricional do operão. 
 
 
A função enzimática da beta-galactosidase 
pode ser reconstituída a partir de dois 
fragmentos polipeptídicos artificiais. Estes 
fragmentos não são funcionais por si só. A 
reconstituição é conhecida por alfa-complementação. Este sistema de 
complementação tem sido usado para monitorizar a clonagem de fragmentos de DNA 
em plasmídeos que contêm locais de restrição na sequência codificante do segmento 
alfa (lac Z’). 
 
Estrutura de uma única sub-unidadeda beta-galactosidase 
evidenciando a região alfa N-terminal (azul) e a região ómega C-
terminal (amarelo). A enzima funcional é um tetrâmero (à 
direita). 
50 
 
 
X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido), um substrato cromogénico da β-
galactosidase. 
 
 
Desenvolvimento de vectores plasmídicos 
 
Três fases do deseenvolvimento de plasmídeos vectores de clonagem 
 
1. Na primeira fase, os vectores que se encontravam disponíveis em 1973-1976 
incluíam pSC101, Co1E1 e pCR1, e todos eles sofriam com dos seguintes 
inconvenientes: 
i. Replicação pobre; 
ii. Realizavam uma selecção inadequada de marcadores; 
iii. Transportavam não mais que dois locais de restrição para a clonagem 
 Esses inconvenientes forma tomados em conta no pBR313, mas era 
desnecessariamente grande, sendo metade do DNA não essencial. 
 O tamanho foi reduzido, dando origem ao pBR322 (4,362kB; ambos pBR313 e 
pBR322 foram produzidos em 1977), que se tornaram populares durante vários 
anos. 
 
2. Na segunda fase, o tamanho do plasmídeo for grandemente reduzido, porque a 
eficiência da transformação é inversamente relacionado com o tamanho do 
vector, e, também, porque grandes plasmídeos replicam um menor número de 
cópias. 
 Um número de derivados do pBR322 foram lançados, que incluía pA 
TI53, pXf3, pBR327, etc. 
 Fizeram uso em resistência a antibióticos para a selecção de clones 
recombinantes.3. A terceira fase do desenvolvimento de vectores incluía: 
i. Incorporação do fragmento de HindI do gene da β-galactosidase para 
permitir a selecção de colónias azuis/branas devido à α-
complementação. (e.x. vectores pUC); 
51 
 
ii. Incorporação de sequências de DNA de uma cadeia simples do fago M 
13, para geração de modelos de DNA de cadeia simples para 
sequenciação. 
iii. Incorporaçao do promotor de sequências de DNA para transcrição in 
vitro (e.x. vectores pGEM); 
iv. Incorporação de promotores de alta expressão para expressão de 
grandes quantidades de proteínas estranhas (e.x. variedade de vectores 
de expressão) 
 
Alfa- complementação 
 
Representação - pUC8 
 
 
 
Os plasmídeos da serie pUC foram construídos por Jeffrey Vieira e Joachim Messing e 
sao derivadosdo pBR322. A região do gene de resistência a tetraciclina foi substituído 
por um segmento de um gene que codifica parte da enzima , dentro do qual foi 
inserida uma série de locais únicos de restrição (The multiple cloning site, MCS). 
 
A β- galactosidase é uma enzima tetramérica que contém quatro cadeias idênticas 
com uma sequência conhecida, cada uma com 1021 aminoácidos. 
 
Descobriu-se que um extracto de uma mutante de escherichia coli com delecção na 
região proximal (a região que codifica para a extremidade N-terminal da β-
galactosidase) do gene lacZ, produz β-galactosidase inactiva. Mas, extractos da espécie 
de Escherichia coli com pontos de mutação fora do segmento restauram a actividade. 
 
Um pequeno péptido LacZ a é codificado pelo 
plasmídeo enquanto o grande LacZ é 
codificado em trans pelo cromossoma bacterial. 
 
O processo de α-complementação é uma 
restauração da actividade que ocorre quando os 
extractos de mutantes do operador proximal 
52 
 
LacZ tal como lacZM15 e lacZM122 (aceptores) são misturados com extractos de 
mutantes de terminação LacZ (dadores) que têm uma região operador proximal 
intacta. 
 
Quando os fragmentos de DNA são inseridos no vector, a produção de LacZ é activada 
e as células exibem acrtividade de β-galactosidase. 
 
IPTG é o indutor do operão Lac que inactiva o repressor 
X- gal e o substrato análogo a galactose e quando desdobrado 
produz cor azul 
Monómeros N- terminal e C-terminal quando unidos, 
codificam β- galactosidase, x-gal e desdobrado (actividade 
enzimática). 
 
 
 
 
O resultado final é 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Vectores de expressão 
 
Promotores bacterianos são sequências de DNA às quais se ligam as RNA polimerases. 
Os promotores determinam a polaridade duma sequência determinando qual das duas 
cadeias deve ser transcrita, e são em regra reguláveis, de tal forma que afectam 
fortemente a capacidade de expressar proteínas. As proteínas podem ser produzidas 
em grandes quantidades através da utilização de vectores de expressão: uma 
sequência promotora e uma sequência de ligação aos ribossomas são inseridas no 
vector a montante do MCS. 
 
Agar+ampicilina+X-gal 
 
53 
 
 
 
Os primeiros vectores de expressão desenvolvidos para E. coli usavam o promotor 
regulável lacP 
 
Simples expressão do vector em E.coli. utilizando o promotor lac. 
a) O vector de expressão (plasmídeo) contém um 
fragmento do cromossoma de E.coli, que 
contém o promotor Lac e o gene vizinho LacZ. 
Na presença do análogo de lactose IPTG, a 
RNA polimerase, normalmente, transcreve o 
gene LacZ, produzindo LacZ mRNA, que é 
traduzido para proteína, a β-galactosidase. 
b) O gene LacZ pode ser cortado do vector de 
expressão com enzimas de restrição e 
substituído pelo G-CSF cDNA. Quando o 
plasmídeo resultante é transformado na E.coli, 
a adição de IPTG e a subsequente transcrição 
do promotor Lac produz G-CSF mRNA, que 
traduz a proteína G-CSF. 
 
 
Sistema de expressão procariótico baseado na RNA polimerase do fagoT7 e no 
promotor tardio T7 
 
O cromossoma de uma E.coli (engenharia genética) contém uma cópia do gene da T7 
RNA polimerase debaixo do controlo transcricional do promotor lac. Quando a 
transcrição do promotor lac é induzido pela adição de IPTG, o gene da T7 RNA 
polimerase é transcrito e o mRNA traduzido em enzima. As moléculas da T7 RNA 
polimerase produzidas, iniciam, então, a transcrição, numa grande taxa, do promotor 
tardio T7 no vector de expressão. Cópias múltiplas do vector de expressão estão 
presentes nas células, apesar de que apenas uma cópia encontra-se esquematizado 
aqui. A grande quantidade de mRNA transcrito do cDNA clonado próximo do promtor 
tardio T7 é traduzida, em abundância, em produto proteico. 
 
Vectores de expressão eucarióticos precisam conter sequências regulatórias que sejam 
reconhecidas pelas células de destino. Abaixo, o vector pVKH18En6 contém vários 
elementos regulatórios: melhorador de transcriçãox6, promotor 35S do vírus do 
54 
 
mosaico da couve-flor, sequência líder do vírus do mosaico do tabaco (a montante do 
MCS) e o terminador do gene da nopalina sintase (a jusante do MCS). 
 
 
 
Vectores de expressão frequentemente incluem um sistema repórter. Os genes 
repórter podem ser usados para estudar a actividade de um promotor ou para 
monitorizar a expressão de um gene em estudo. 
 
 
O sinal das proteínas fluorescentes é detectável à escala subcelular. 
 
Beta-Glucoronidase (GUS) 
 
GUS é um gene repórter, particularmente usado em plantas na biologia molecular. Vários 
ensaios do gene repórter encontram-se disponíveis, dependendo do substrato que se utiliza. O 
termo GUS refere-se á mais comum técnica histoquímica. 
O susbstrato mais comum da β-glucoronidase é 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide 
(X-Gluc) e o produto de reacção tem uma cor azul clara. 
 
 
 “Tags” são pequenas sequências de 
aminoácidos que se fundem a uma 
proteína de interesse através de técnicas 
de DNA recombinante. (Fusão: 
justaposição de duas sequências 
codificantes “in frame” com o codão de 
iniciação único, e sem codão de 
terminação intermédio). Vantagem dos 
“tags”: mais anticorpos disponíveis. 
 
55 
 
Proteínas de fusão 
 
São as proteínas criadas com a junção de dois ou mais genes do qual codificou 
originalmente para proteínas separadas 
A inserção de DNA alvo no MCS provoca a respectiva 
fusão com a sequência codificante do gene lacZ. O IPTG 
induz o promotor lacP, resultando na produção de uma 
proteína híbrida. 
 
 
 
 
As proteínas de fusão têm vantagens e desvantagens relativamente ao uso de tags. 
 
Desvantagens Vantagens 
Perda de actividade biológica/função da 
proteína (e/ou do repórter) 
Não são necessários anticorpos 
Alteração da localização subcelular nativa 
Processamento da proteína defeituoso 
Toxicidade 
 
Sobre-expressão 
 
Sobre-expressão - Experimentalmente, uma proteína pode ser expressa em 
quantidades elevadas. Isto pode ser atingido aumentando o número de cópias de um 
gene, ou colocando o gene sob a acção de um promotor constitutivo forte. 
 
1. Estudar a função de uma proteína (normalmente endógena) 
2. Produção de uma dada proteína em quantidades acrescidas para purificação 
(proteína endógena ou não, normalmente se eucariótica usam-se sistemas de 
expressão eucarióticos: leveduras, plantas). 
 
Reacção em cadeia de polimerase (PCR) 
 
A reacção em cadeia de polimerase é: 
 
 Um processo para multiplicar selectivamente um determinado segmento de 
DNA; 
 Esse segmento pode representar uma pequena parte de uma mistura complexa 
de DNAs (por ex. um determinado exão numa preparação de DNA genómico 
total), 
 Através da PCR podemos obter uma quantidade abundante de DNA em cerca 
de 2 horas, 
 A preparação de DNA alvo não precisa ser pura, 
 Pode amplificar-se uma única cópia de DNA alvo (por ex. uma sequência 
específica em uma única célula haplóide). 
56 
 
 
A reacção de