Técnicas Moleculares para Diagnóstico e Caracterização do Vírus da Tristeza dos Citros

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MELHORAMENTO E BIOTECNOLOGIA
ARTIGO TÉCNICO
TÉCNICAS MOLECULARES
PARA DIAGNÓSTICO
E CARACTERIZAÇÃO DO VÍRUS
DA TRISTEZA DOS CITROS
ALESSANDRA A. DE SOUZA (1); MARIA LUISA P. N. TARGON (1);
 FRANCISCA A. DOS SANTOS (1); GERD W. MÜLLER (1) e MARCOS ANTÔNIO MACHADO (1)
RESUMO
O vírus da tristeza dos citros (CTV) é o patógeno viral
de maior importância econômica na cultura. Infecta, prati-
camente, todas as espécies e variedades de citros. O CTV
apresenta diferentes isolados relacionados imunologica-
mente, podendo ou não expressar sintomas, em função da
combinação copa/porta-enxerto. O procedimento mais co-
mum para caracterização de seus isolados é a indexação bio-
lógica. Todavia, esse processo, além de caro e demorado,
nem sempre permite uma identificação correta das estirpes.
Atualmente, várias técnicas moleculares estão sendo utili-
zadas para identificação das estirpes do CTV. Nesta revi-
são, serão abordadas as técnicas moleculares de RT-PCR,
RFLP e SSCP do gene da capa protéica rotineiramente utili-
zadas no laboratório de Biotecnologia do Centro de
Citricultura "Sylvio Moreira"-IAC no diagnóstico e carac-
terização de isolados do CTV.
Termos de indexação: viroses, testes diagnósticos, CTV,
RT-PCR, RFLP, SSCP.
(1) Centro de Citricultura “Sylvio Moreira”-IAC, Caixa Postal 4, 13490-970 Cordeirópolis
(SP).
ALESSANDRA A. DE SOUZA et al.5 0 4
LARANJA, Cordeirópolis, v.22, n.2, p. 503-516, 2001
SUMMARY
MOLECULAR TECHNIQUES FOR DIAGNOSTIC AND
CHARACTERIZATION OF CITRUS TRISTEZA VIRUS
Citrus tristeza virus (CTV) is economically the most
important citrus virus in the world, which infects all citrus
species and varieties. The CTV is present in citrus trees as a
mixture of strains, expressing or not symptoms, according
with the scion and rootstock variety. Usually, the properties
of CTV isolates are determinate by biological indexing.
However, this process is expensive and time consuming.
Nowadays, several molecular techniques have been utilized
to identify CTV strains. In this review, we describe
techniques, such as RT-PCR, RFLP and SSCP, based on
analysis of the coat protein gene and used for diagnostic
and characterization of CTV isolates.
Index terms: Viruses, diagnostic tests, CTV, RT-PCR,
RFLP, SSCP.
1. INTRODUÇÃO
O vírus da tristeza dos citros (CTV) é o patógeno viral de maior
importância econômica na cultura. Infecta praticamente todas as espé-
cies, cultivares e híbridos de citros (MÜLLER e COSTA, 1993). O CTV
é limitado ao floema, pertence ao grupo dos closterovírus, com partícu-
las longas e filamentosas de 10-12 nm de diâmetro por 2.000 nm de com-
primento (BAR-JOSEPH et al., 1979). Suas partículas possuem capa
protéica de 25 KDa e RNA fita simples (ssRNA) de, aproximadamente,
19.300 bases. Na forma replicativa do vírus, ocorre a formação de RNA
dupla fita (dsRNA) e vários RNAs subgenômicos (LEE et al., 1988;
VALVERDE et al., 1990).
O vírus da tristeza apresenta diferentes isolados relacionados
imunologicamente, podendo ou não expressar sintomas, em função da
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combinação copa / porta-enxerto (POWELL, 1992). Em pomares comer-
ciais, tem-se observado que, na presença do vírus, nem todas as variedades-
-copa desenvolvem-se satisfatoriamente, mesmo sobre porta-enxertos
tolerantes. Isso tem sido associado à ocorrência de complexos severos do
CTV. Para variedades mais suscetíveis, o problema tem sido parcial-
mente resolvido com a pré-imunização (MÜLLER e COSTA, 1993), na
qual plantas sistematicamente infectadas com estirpes fracas do vírus
impedem a manifestação de estirpes severas do mesmo vírus. Contudo,
têm sido observados casos de plantas pré-imunizadas apresentando sin-
tomas de CTV severo (SOUZA et al., 2000). Entre os complexos virais, o
Capão Bonito é considerado um dos mais severos, afetando, com maior
ou menor intensidade, todas as variedades de laranja-doce (Citrus sinensis
L. Osbeck) enxertadas sobre limão 'Cravo' (Citrus limonia Osbeck). O
complexo viral utilizado em programas de pré-imunização também não
tem tido êxito diante do complexo Capão Bonito (MÜLLER e COSTA,
1993).
O procedimento mais comum para caracterização de isolados do
CTV é a indexação biológica, na qual se utilizam plantas indicadoras
sensíveis ao patógeno. Entretanto, esse processo, além de ser caro e demo-
rado, nem sempre permite uma identificação correta das estirpes
(BALLESTER-OLMOS et al., 1993). Atualmente, várias técnicas
moleculares estão sendo usadas para identificação das estirpes do CTV,
entre elas: análise do dsRNA de plantas infectadas (DODDS et al., 1987),
hibridação com sondas de cDNA (ROSNER et al., 1986), comparação de
seqüências de RNA do vírus (PAPPU et al., 1993), RT-PCR (transcrição
reversa seguida de reação da polimerase em cadeia) (TARGON et al.,
2000), análise do polimorfismo do comprimento de fragmentos de restri-
ção (RFLP) do gene da capa protéica (GCP) do vírus (GILLINGS et al.,
1993; VALLE et al., 2000), e análise do polimorfismo da conformação
de fita simples (SSCP) do GCP (RUBIO et al., 1996). Entre as técnicas
moleculares citadas, a comparação de seqüências do RNA é a mais precisa;
entretanto, é a mais cara e consome muito tempo em trabalhos rotineiros.
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Nesta revisão, serão abordadas as técnicas moleculares de RT-PCR,
RFLP e SSCP rotineiramente utilizadas no Laboratório de Biotecnologia
do Centro de Citricultura "Sylvio Moreira"-IAC para o diagnóstico e
caracterização de isolados do CTV.
2. APLICAÇÃO DOS TESTES
Os procedimentos necessários à utilização das técnicas de RT-PCR,
RFLP ou SSCP estão esquematizados na Figura 1.
Coleta do material
vegetal
Extração do dsRNA do
vírus
Síntese da primeira
fita de cDNA
RT-PCR
RFLP SSCP
Ð
Ð
Ð
Ó Ô
Figura 1. Esquema representativo da seqüência de etapas na análise
molecular do vírus da tristeza dos citros
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2.1. Coleta do material vegetal
Geralmente, o material a ser diagnosticado é coletado, em campo,
de plantas apresentando ou não sintomas de CTV severo. Colocam-se os
ramos coletados em sacos plásticos e acondicionam-nos no gelo. No labo-
ratório, efetua-se a lavagem do material e a posterior separação das cascas
dos ramos (local com maior concentração do vírus). Posteriormente, o
material é seco e armazenado a -20ºC até processamento.
2.2. Extração do dsRNA e síntese do cDNA
Como todas as análises se baseiam no gene que codifica a capa
protéica, a primeira etapa dos procedimentos de laboratório consiste em
extrair o material genético do vírus, ou seja, o RNA. Como mencionado
na introdução, o CTV apresenta RNA fita simples (ssRNA); entretanto,
na sua forma replicativa, também apresenta RNA dupla fita (dsRNA). O
dsRNA é menos suscetível a degradações que o ssRNA e, por esse moti-
vo, mais fácil de ser isolado por métodos laboratoriais. Os procedimentos
mais utilizados para sua extração são os descritos por MORRIS et al.
(1983) e VALVERDE et al. (1990). Após extração, a próxima etapa é
a síntese do DNA complementar (cDNA) ao dsRNA, que vai servir de
molde na etapa posterior, que é a amplificação do GCP por PCR. Para
que tal ampli-ficação ocorra, é necessária a presença de uma enzima (Taq
DNA polimerase) que reconhece apenas molde de DNA; por esse moti-
vo, deve ser sintetizado o cDNA. Para sua síntese, o dsRNA é colocado
em uma mistura de componentes contendo a enzima transcriptase reversa
(RT), que tem a propriedade de sintetizar DNA a partir de RNA.
2.3. RT-PCR (Transcrição reversa seguida de reação da polimerase em
cadeia)
Após a sua síntese, o cDNA é usado como molde para amplifica-
ção do GCP utilizando "primers"específicos para o gene. Esses "primers"
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são pequenas seqüências de nucleotídeos (~ 20 pares de bases - pb) que
pareiam especificamente com as seqüências do GCP, sendo também
chamados de iniciadores da reação. Após reação, observam-se fragmentos
de, aproximadamente, 670 pb, tamanho correspondente ao GCP (Figura 2).
Figura 2. Análise eletroforética em gel de agarose (1%) do gene da capa
protéica do CTV amplificado por PCR de 12 amostras. M: Marcador
molecular de 1Kb (Gibco).
Depois dessa reação, já se pode concluir se a planta em questão
está infectada ou não com o CTV. Emprega-se esse tipo de diagnóstico
principalmente em mudas microenxertadas, pois, em plantas de campo, o
CTV é endêmico em quase todas as espécies de citros.
Recentemente, desenvolveram-se "primers" específicos para am-
plificar o GCP das estirpes presentes no complexo severo Capão Bonito
(estirpe CB-22 e CB-104) (TARGON et al., 2000). Com esse desenvolvi-
mento desses "primers", hoje é possível diagnosticar por RT-PCR a pre-
sença de tais estirpes nas plantas. O diagnóstico é feito da seguinte for-
ma: primeiramente, o GCP do CTV presente nas plantas a avaliar é am-
plificado com um par de "primers" que amplificam qualquer estirpe do
CTV (Figura 2). Após constatação que o cDNA utilizado está amplifi-
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cando o GCP, este é utilizado para amplificação com "primers" específi-
cos para um dos componentes do complexo Capão Bonito (estirpe CB-
22), que gera um fragmento de 285 pb (Figura 3A), e específicos para
outro componente (estirpe CB-104), gerando um fragmento de 295 pb
(Figura 3B).
A
B
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
- 1018pb
- ~ 285pb
- 1018pb
~ 295pbÎ
Î
Figura 3. Análise eletroforética em gel de agarose (1% ) do gene da capa
protéica do CTV amplificado por PCR, utilizando "primers" especí-
ficos para o complexo Capão Bonito. As setas indicam as bandas
relacionadas às estirpes CB-22 (A) e CB 104 (B). M: Marcador
molecular de 1Kb (Gibco).
Como a presença do complexo Capão Bonito está relacionada à
presença dos dois fragmentos na mesma planta, na Figura 3 são conside-
radas positivas, para o complexo Capão Bonito, as plantas 5, 6, 11 e 12.
A
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2.4. RFLP (Polimorfismo do tamanho de fragmentos de restrição)
A técnica de RFLP é mais utilizada em avaliações de campo, quando
há suspeita de CTV severo em algumas plantas, ou, ainda, para avaliar a
estabilidade do isolado protetivo em plantas pré-imunizadas. A técnica
de RFLP, utilizada para caracterização dos isolados do CTV, consiste em
cortar o GCP das estirpes a serem avaliadas com enzimas de restrição.
Essas enzimas têm a propriedade de clivar o DNA quando encontram
seqüências específicas de nucleotídeos. Dessa forma, se houver alguma
diferença no conteúdo de nucleotídeos do sítio de reconhecimento da
enzima, não haverá clivagem do DNA naquela região. Quando o DNA é
então submetido à corrida eletroforética, aquele que apresenta o sítio de
restrição revelará um fragmento a mais que o que não apresenta o sítio, e
assim se constata a diferença entre ambos (Figura 4).
Um exemplo prático do uso dessa técnica é mostrado no trabalho
de SOUZA et al. (2000), em que o objetivo foi determinar se houve mu-
dança no isolado protetivo em plantas pré-imunizadas há mais de vinte
anos. Pôde-se verificar que, entre dez plantas avaliadas, apenas uma apre-
sentava o padrão similar ao do complexo protetivo original, enquanto as
demais continham alterações significativas do vírus. Isso sugere que ou-
tras estirpes se estabeleceram nas plantas ao longo do tempo.
2.5. SSCP (Polimorfismo da conformação da fita simples)
O emprego da técnica de SSCP é o mesmo que o de RFLP. Entre-
tanto, o SSCP é, atualmente, um dos mais utilizados na detecção e carac-
terização de vírus (KOENIG et al., 1995; SHI et al., 1996; PALACIO e
DURAN-VILA, 1999). A técnica baseia-se no fato de que o DNA dupla
fita (forma em que se encontra o GCP após PCR), quando parcialmente
desnaturado, migra como dois fragmentos de DNA fita simples em
eletroforese com gel de poliacrilamida. A migração das duas fitas
depende da seqüência de nucleotídeos e da conformação adquirida nas
condições de eletroforese. Pequenas mudanças na seqüência podem alte-
rar a conformação das fitas e, conseqüentemente, o padrão eletroforético.
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300pb Ö
Amostra 1
 300pb
Amostra 2
Amostra 1 Amostra 2
Eletroforese
 �
� �
Õ 500pb
Õ 170pb
200pb Ö
170pb Ö
��
� �
� �
200pb 170pb
500pb 170pb
�
Figura 4. Esquema da técnica de RFLP. Amostra 1 apresenta dois sítios
de restrição, gerando três fragmentos que, somados, equivalem ao
tamanho do GCP. Amostra 2 difere da 1 pela ausência de um sítio de
restrição, originando, dessa forma, dois fragmentos.
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Dessa forma, a técnica de SSCP é mais precisa que a de RFLP, pois neste
são detectadas somente diferenças se houver mutação no sítio de restri-
ção da enzima utilizada, enquanto no SSCP a variação de apenas um
nucleotídeo em qualquer parte do gene é suficiente para mudar a confor-
mação da fita simples e, conseqüentemente, sua migração em gel de
eletroforese (Figura 5).
A
CDNA
A GFita
Simples
G
Diferentes
conformações
�
�Diferença naMobilidade
Eletroforese
Í
Î
Figura 5. Esquema da técnica de SSCP. A fita de DNA, que contém uma
adenina (A), apresenta conformação linear e, por isso, migra mais
lentamente no gel. A fita de DNA que contém uma guanina (G) reve-
la conformação mais compacta, migrando mais rápido no gel.
A
Desnaturação
simples
mobilidade
G
G
T
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A técnica de SSCP é também utilizada para diagnosticar a presen-
ça do complexo Capão Bonito. Na Figura 6, encontra-se um gel de SSCP
contendo, separadamente, o padrão do CB-22, CB-104 e a mistura de
ambos. Se as plantas diagnosticadas apresentarem padrão igual à mistura,
infere-se que, provavelmente, estejam hospedando as estirpes do com-
ple-xo Capão Bonito.
Outro exemplo prático da técnica de SSCP é a caracterização de
isolados fracos e severos em campo, pois, como já constatado em alguns
trabalhos (CORAZZA-NUNES et al., 2001), a diferença de sintoma,
geralmente, está associada à diferença do padrão do GCP.
CB-22 CB-104 CB22 +104
Figura 6. Polimorfismo de conformação de fita simples do gene da capa
protéica das estirpes presentes no complexo Capão Bonito.
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3. COMENTÁRIOS FINAIS
O gene da capa protéica representa apenas 3,5% do genoma do
CTV. Dessa forma, pesquisas que visem estudar a variabilidade entre os
isolados devem avaliar também outros genes do vírus. Contudo, as téc-
nicas apresentadas neste trabalho, utilizando o GCP, mostram-se
satisfatórias para detecção do complexo Capão Bonito, para o
monitoramento do isolado protetivo em plantas pré-imunizadas e para a
caracterização dos padrões moleculares presentes em isolados fracos e
severos do vírus.
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