Prática 4, Tipos de Siembra-Laboratorio de Microbiología

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Práctica N° 4
TIPOS DE SIEMBRA
Introducción
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento (MADIGAN, 2004). 
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen: 
Que se efectúen asépticamente. 
Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados. 
Que se realicen solo los manipuleos indispensables. 
Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o bien Flujo laminar. 
(PELCZAR, 2000)
Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del microorganismo a estudiar:
Siembra en profundidad o vertido en placa 
Este tipo de siembra sirve para la obtención de un recuento total de bacterias (preferentemente) (PELCZAR, 2000).
Primero se añade un volumen conocido de suspensión de microorganismos en una placa estéril, después se añaden 10-15 ml de medio de cultivo fundido a 45°C, se mezcla el contenido de la placa con movimientos en forma de ocho por toda la placa y se deja solidificar (PELCZAR, 2000).
Figura 1
Siembra en profundidad o vertido en placa
Fuente: VOS 2009
Siembra en superficie
Permite en mayor medida el aislamiento de microorganismos, así como su recuento total en ciertas ocasiones. Se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie la cantidad de muestra necesaria. Con ayuda de una espátula de Drigalsky se extiende el inóculo hasta su absorción total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos (VOS, 2009).
Figura 1
Siembra de superficie en placa
Fuente: VOS 2009
Siembra en estría 
La técnica de siembra en estría es usada para aislar cepas puras en una placa Petri a partir de un inóculo o muestra con diferentes especies.  La técnica consiste en, mediante un asa de siembra previamente esterilizada, rayar la superficie de cultivo solidificado de una placa Petri de forma que en cada pasada sea menor el número de  células depositado, las últimas pasadas deberán depositar un número tan bajo de células que, una vez incubadas, se formen colonias puras (STANIER, 1996).
Existen distintas técnicas para la siembra en estrías:
Recuento
Con el asa previamente esterilizada, tomar una azada de una muestra y trazar una cruz en la caja con el medio de cultivo a utilizar, posteriormente esterilizar el asa y estriar en toda la caja procurando que las estrías sean lo más cercanas una de otra en toda la caja (SASSON, 1984).
Figura 1
Técnica de estría en estera
Fuente: SASSON 1984
Aislamiento
Se tomará con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) una cantidad adecuada de muestra depositando el inoculo en uno de los extremos superiores de la placa, a partir de aquí se hacen 3 o 4 estrías (movimientos en zig-zag de un extremo a otro de la placa), se quema el ansa, se hacen 3 o 4 estrías perpendiculares a las anteriores, se quema el ansa y se repite el procedimiento hasta agotar la superficie de la placa. Finalmente se incuba la caja Petri a 37ºC durante 24hrs (THATCHER, 1993).
Figura 1
Técnica en estría 
Fuente: FACULTAD REGIONAL ROSARIO 2009
Re aislamiento
Con el asa de inoculación (previamente esterilizado por flameado) se inocula una cantidad de colonia previamente aislada en uno de los extremos superiores de la placa, a partir de aquí se realiza el estiramiento usando cualquiera de las técnicas disponibles sobre la superficie de la placa. Finalmente se incuba la caja Petri a 37ºC durante 24hrs (FACULTAD REGIONAL ROSARIO, 2009).
Figura 1
Técnicas de estriamiento
Fuente: SASSON 1984
Siembra en picada
Se colocan 5 ml de medio de cultivo (necesariamente puro) fundido y estéril, se inclina el tubo y se deja enfriar (FACULTAD REGIONAL ROSARIO, 2009).
Figura 1
Cultivo en medio sólido
Fuente: FACULTAD REGIONAL ROSARIO 2009
El inóculo se siembra, con ayuda de ansa Koclle, de la siguiente manera:
En profundidad con ansa de punta
Se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se introduce mediante punción en el medio contenido en la parte inferior del tubo (THATCHER, 1993).
Figura 1
Siembra en picada en profundidad
Fuente: FACULTAD REGIONAL ROSARIO 2009
En superficie con ansa de aro 
Se pica con el ansa el cultivo a sembrar y se esparce el mismo sobre la superficie en bisel en forma de zigzag (STANIER, 1996).
Figura 1
Siembra en picada en superficie
Fuente: FACULTAD REGIONAL ROSARIO 2009
Siembra en emulsión 
Muestras sólidas
Con un asa estéril se inocula una colonia aislada, en el caldo verde bilis brillante. Se inclina el tubo y se deposita la carga en la parte superior del tubo, sin poner en contacto directo con el medio. Se emulsiona la muestra, primero con una gota del medio, luego con más cantidad hasta que se disuelva completamente la muestra de la colonia, homogeneizar el medio de cultivo e incubar a 37ºC (MADIGAN, 2004).
Figura 1
Siembra en emulsión a partir de muestras sólidas
Fuente: THATCHER 1993
Figura 2
Inoculación de muestra sólida en medio liquido
Fuente: THATCHER 1993
Muestras líquidas
En ciertas ocasiones utiliza una pipeta estéril y en algunos casos se utiliza las asas de siembra. Tomar una cantidad suficiente del inóculo e introducirlo directamente al tubo con medio líquido, sin tocar las paredes del mismo. Flamear la boca del tubo antes y después de sembrar para evitar contaminación. Rotular e incubar (STANIER, 1996).
Figura 1
Inoculación de muestra líquida en medio líquido
Fuente: STANIER 1996
Objetivos
Realizar el recuento de bacterias expresadas en UFC/ml para cada caso en la siembra de superficie, siembra de profundidad y siembra en estría respectivamente.
Identificar según sus características bioquímicas a los microorganismos de las muestras de leche pasteurizada y E. coli, en las siembras por emulsión y la siembra en picada respectivamente.
Determinar la efectividad de cada tipo de siembra según el tipo de muestra utilizado y la utilidad de cada una, comparando los resultados obtenidos.
Materiales
Aguja de inoculación
Asa de inoculación
Espátula Drigalsky
Pipeta estéril
Leche pasteurizada
Cajas petri
Agar Plate Count
Agar Potato Dextrosa
Hornilla
Mechero Bunsen
Tubos de cultivo
Tubos de ensayo
Procedimiento
 
 Siembra en profundidad
Se puso 0,1 ml de leche en la caja Petri esterilizada.
Se echaron de 10 a 15ml de agar Plate Count sobre la muestra de leche. 
Se homogenizo la muestra haciendo movimientos circulares en forma de ocho, evitando que el medio de cultivo toque las paredes del medio de cultivo.
Se dejó enfriar la caja Petri y se lo incubo a 37°c por 24 h
Después de las 24h transcurridas se contaron las colonias existentes para así expresar el número de colonias existentes por mililitro.
Siembra en superficie
Con agar Potato Dextrosa
Se puso 0,1 ml de leche en la caja Petri con contenido de Agar Potato Dextrosa previamente preparado.
Con la ayuda de la espátula de Drigalski previamente esterilizada con alcohol y fuego, se extendió la muestra extendiéndola por toda la caja Petri.
Se la incubo por 4 días, se contaron las colonias existentes y se expresó el resultado como número total de hongos por ml.
Con agar Plate Count
Con la ayuda de una pipeta previamente esterilizada se puso 0,1ml de leche en una caja Petri con el contenido de agar Plate Count.
Con una espátula de Drigalski previamente esterilizada con alcohol y fuego, se extendió la muestra extendiéndola por toda la caja Petri.
Se incubo la muestra a 37°C por 24h.
Fueron contadas todas las colonias para luego ser contadas como número de bacterias por ml de muestra.
Siembra en estría.
Recuento
Con unapipeta esterilizada se puso 0,1ml de leche en un borde de agar Plate Caunt de una caja Petri.
Con el asa se fue extiendo la muestra, realizando líneas horizontales, verticales y diagonales sobre el agar.
Se incubo la muestra a 37°C por 24h.
Aislamiento
Con una pipeta esterilizada se puso 0,1ml de leche en un borde de agar Plate Caunt de una caja Petri.
Con el asa se fue extiendo la muestra, realizando líneas diagonales en zigzag sobre el agar.
Se incubo la muestra a 37°C por 24h
Reaislamiento
Con un asa estéril se recogió una colonia aislada de E. Coli y se la deposito en un borde de agar Plate Caunt de una caja Petri.
 Con el asa se fue extiendo la muestra, rayando suavemente el agar plate caunt de los bordes de la caja hacia el centro.
Se incubo la muestra a 37°C por 24h
Siembra en picada
Con E. Coli
Con un mechero se esterilizó la aguja de inoculación.
Se recogió una muestra de E. Coli.
Se agarró un tubo de ensayo que contenía agar Plate Count, se lo destapo y flameo la boca.
Se introdujo la aguja de inoculación en línea recta y tratando de no tocar las paredes del tubo hasta el fondo.
Se sacó la aguja también en línea recta a la supeficie y se realizó un extendido en zigzag.
Se flameo la boca del tubo y se lo cerró.
 Se incubo el tubo a 37°C por 24 h
Luego del tiempo transcurrido se regresó para ver las características de la prueba.
Con Leche
Con un mechero se esterilizó la aguja de inoculación.
Se recogió una muestra de leche.
Se agarró un tubo de ensayo que contenía agar Plate Count, se lo destapo y flameo la boca.
Se introdujo la aguja de inoculación en línea recta y tratando de no tocar las paredes del tubo hasta el fondo.
Se sacó la aguja también en línea recta a la supeficie y se realizó un extendido en zigzag.
Se flameo la boca del tubo y se lo cerró.
 Se incubo el tubo a 37°C por 24 h
Luego del tiempo transcurrido se regresó para ver las características de la prueba.
 Siembra en emulsión
Cuando la muestra es sólida
Con la ayuda un asa estéril, se inoculo una colonia de E. Coli, en el caldo Verde Bilis Brillante.
Se inclinó un poco el tubo y se depositó la carga en la pared superior del tubo, sin poner en contacto directo con el medio de cultivo
Se homogenizó el medio de cultivo e incubo a 37°c por 24 h
Para realizar el experimento con la leche con la ayuda un asa estéril, se inoculo la leche, en el caldo Verde Bilis Brillante.
Se inclinó un poco el tubo y se depositó la carga en la pared superior del tubo, sin poner en contacto directo con el medio de cultivo
Se homogenizó el medio de cultivo e incubo a 37°c por 24 h
Cuando la muestra es líquida
De la misma manera que se hizo con el caldo de Verde Vilis Brillante se procedió con el caldo EC en el caso de la E. Coli.
Para la muestra de leche en el caldo EC se pusieron directamente 0,1ml de leche.
En ambos casos se los incubo por 24h. 
Resultados
Siembra en profundidad
Tras la incubación, se observan las colonias bacterianas sobre la superficie del Agar Plate Count. Cada colonia representa a una unidad formadora de colonia (UFC). Usualmente una UFC se corresponde con una célula viable.
Agar Plate Count con muestra leche en siembra de profundidad
Fuente: OBANDO, 2014
Número UFC en la placa: 86 colonias.
Especificación:
Spidle: 27 colonias pequeñas 
Redondas: 2 amarillas redondas medianas; 19 redondas pequeñas de aspecto blanquecino y amarillento.
Filamentosas: 3 blancas filamentosas.
Irregulares: 35
Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la superficie. Es un método generalmente utilizado para el recuento de microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos. (CARRANZA, 2001)
Siembra en superficie
Agar Potato dextrosa con leche, siembra en superficie
Fuente: OBANDO, 2014
Número UFC en la placa: 37 colonias redondas.
	SIEMBRA EN SUPERFICIE
	Ventajas
	Desventajas
	Menor cantidad de muestra a procesar
	Mayor error en el recuento
	Facilidad para subcultivar colonias
	En aerobiosis pueden crecer aerobios estrictos y facultativos.
	Fácil visualización
	Bajo aprovechamiento de nutrientes por parte de los microorganismos
	
No se afectan las células termosencibles
	Se corre el riesgo que otros microorganismos entren en el medio de cultivo y contaminen la muestra
Fuente: CARRANZA, 2001
En este método todas las colonias crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta técnica para el recuento de bacterias aerobias.
Siembra en estría
Recuento: Realizado en Agar Plate Count con leche.
Aislamiento Agar Plate Count con leche
Fuente: OBANDO, 2014
Número UFC en la placa: 11 colonias.
Especificación:
Redondas: 1 amarillas semiredonda y 2 blanca redonda.
Puntiformes: 7
Irregulares: 1
El éxito del aislamiento, de la separación sobre el medio de cultivo, depende de la superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el mayor número de estrías posible. En las primeras estrías aparecerán colonias confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estrías finales deberán aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un reducido inóculo de partida. La sucesiva disminución del tamaño de la población sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de cultivo, debe asegurar que finalmente algunas células queden suficientemente separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie (CONTRERAS, 2013). 
Se puede inferir que a pesar de que el número de colonias obtenidas es muy pequeño, este tipo de siembra se realizó con éxito debido a que se cumplió el objetivo de aislar colonias y que estas crecieran separadas.
Reaislamiento Agar Plate Count con E. coli
Fuente: OBANDO, 2014
Se presentó el crecimiento de colonias de E. coli en toda la placa, pero se puede notar que el crecimiento de estas no fue favorable para el cumplimiento del tipo de siembra que se realizó, que como se mencionó antes, busca el crecimiento de colonias aisladas y separadas entre sí. La forma de crecimiento de las colonias indica que hubo errores en la preparación, al distribuir la muestra en estrías que se tocan entre sí o no están lo suficientemente separadas.
En general, la mayoría de los hongos necesitan por lo menos 1-2% de oxígeno y suelen crecer a temperaturas entre 20 y 30°C. 
Siembra en picada
Realizada en tubos con Agar Plate Count.
Muestra leche: no se presentó ninguna colonia visible.
Siembra en picada, muestra leche
Fuente: OBANDO, 2014
La ausencia de colonias o la no visibilidad de las mismas puede ser causada por varias razones probables como el uso de una cantidad demasiado pequeña de muestra.
Muestra E. coli: sí se presentó crecimiento de colonias, distribuidas en la trayectoria de inoculación.
Siembra en picada, muestra E. coli
Fuente: OBANDO, 2014
En medio semisólido se podrá comprobar si el microorganismo es o no móvil, ya que en el primer caso se observará que el crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura (CRUZ , 2000).
Por lo tanto se sabe que nos encontramos ante un microorganismo inmóvil que no se pudo haber desplazado lejos de la zona de la picadura, y que por esto es probable que no tenga mecanismos de movimiento como los flagelos a pesar de que, según (MACNAB, 2003) este tipo de bacterias son un ejemplo de microorganismos flagelados con flagelos perítricos. Lo cual indica que pudo haber existido un factor que inhiba esta capacidad en la bacteria.
 Siembra en emulsión
Caldo Verde Bilis Brillante con leche
Fuente: OBANDO, 2014
No se observó turbidez ni desprendimiento de gas, lo cual indica que no crecieron microorganismos.
Caldo Verde Bilis Brillante con E. coli
Fuente: OBANDO, 2014
Se observó turbidez y desprendimiento de gas, que según la guía de laboratorio indica la presencia de microorganismos.
Caldo EC con leche
Fuente: OBANDO, 2014
No se observó turbidez ni desprendimientode gas, lo cual indica que no crecieron microorganismos.
Caldo EC con E. coli
Fuente: OBANDO, 2014
Se observó turbidez y desprendimiento de gas, que según la guía de laboratorio indica la presencia de microorganismos
Según el laboratorio de Argentina (Britania, 2010), el Caldo Verde Bilis Brillante y el Caldo EC están recomendados para la identificación de coliformes totales y fecales. Por lo cual era de esperar que la muestra de E. coli saliera positiva en cuanto a presencia de microorganismos, mientras que la muestra de leche, al ser leche pasteurizada fue negativa en ambos casos.
Comparación de la efectividad de los tipos de siembra
Para el recuento de bacterias: en este caso el tipo de siembra más efectivo es la siembra de profundidad porque en ella se encontraron más unidades formadoras de colonia, debido a que su característica principal es que no restringe el crecimiento de microorganismos aerobios como en el caso de las siembras en estrías y de superficie, sino que permite el crecimiento tanto de microorganismos aerobios como anaerobios.
Para la identificación bioquímica: en este caso el tipo de siembra más útil sería la siembra por emulsión pues nos permite la determinación directa de la presencia o no presencia de microorganismos de cierta clase, que en este caso debido al tipo de cultivo serían los coliformes totales y fecales. 
Cabe destacar que según nuestro propósito cada tipo de siembra tiene características que los hacen más útiles y efectivos pero para casos más específicos, y los anteriores son los parámetros que el grupo consideró más relevantes.
Conclusiones
Se realizó el recuento de bacterias expresadas en UFC/ml par cada caso en la siembra de superficie: 86, siembra de profundidad: 11 y siembra en estría: aislamiento (11), re aislamiento (incontable).
Se identificó las características bioquímicas de los microorganismos de las muestras de leche pasteurizada y E. coli, en las siembras por emulsión como positivo con la muestra de E.coli en ambos cultivos y como negativo en la muestra de leche en ambos agares; y para la siembra en picada identificando al mcroorganismo E. coli como un organismo inmóvil por posibles factores inhibidores o errores en la práctica. 
Se determinó la efectividad de cada tipo de siembra según el tipo de muestra utilizado, considerando la siembra en superficie como la más efectiva para el recuento de la cantidad de bacterias; y a la siembra por emulsión como la más útil para determinar la presencia de un tipo de microorganismos identificable dependiendo de las características del medio de cultivo a utilizarse.
Bibliografía
BRITANIA (2010). “E. C. Medio”. En: http://www.britanialab.com/productos/379_hoja_tecnica_es.pdf, (fecha de consulta: 30/09/14)
BRITANIA (2010). “Verde Brillante Bilis 2% Caldo”. En: http://www.britanialab.com/productos/379_hoja_tecnica_es.pdf,(fecha de consulta: 30/09/2014)
CONTRERAS (2013), “Siembra en estrías”. En: http://seramix.blogs.uv.es/2013/05/02/metodo-de-siembra-en-estria/#sthash.jVd0ni1I.dpuf, (fecha de consulta: 30/09/2014)
FACULTAD REGIONAL ROSARIO (2009). “Siembra y recuento de microorganismos”. En: <http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practicoIII.pdf>, (fecha de consulta 01/10/2014).
CARRANZA, Jhan (2001) En: <http://es.slideshare.net/JhanCarranzaCabrera/informes-de-microbiologia-primera-unidad-1-7> (fecha de consulta 30/09/2014)
MADIGAN, Michael. (2004) Biología de los microorganismos 10° Edición. España: Editorial Pearson
PELCZAR, Michael J. y otros (2000). Microbiología 4° Edición. En: ANONIMO. Métodos de siembra. México: Editorial Mc Graw-Hill
SASSON, Albert (1984). Las biotecnologías. En: ANONIMO. Investigaciones Biológicas. Cuba: Editorial La Habana 
STANIER, R.Y. y otros (1996). Microbiología. 4ª ed. En: ANONIMO. Siembras. España: Editorial Reverté
THATCHER, F. S. y D. S., Clark (1993) Análisis Microbiológico de los Alimentos. España: Editorial Acribia. Zaragoza.
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VOS, P. y otros (2009). Manual de Bacteriología Sistemática. USA: Editorial Springer Verlag