Relatório QUANTIFICAÇÃO BACTERIANA

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO 
Instituto de Ciência e Tecnologia 
 
 
 
RODRIGO LIRA FABIANO - 104784 
 
 
 
 
 
 
 
 
QUANTIFICAÇÃO DA COMUNIDADE BACTERIANA EM SOLO 
COMPOSTADO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
São José dos Campos-SP 
2018 
RODRIGO LIRA FABIANO - 104784 
 
 
 
 
 
 
QUANTIFICAÇÃO DA COMUNIDADE BACTERIANA EM SOLO 
COMPOSTADO 
 
 
 
 
 
 
Relatório apresentado junto à disciplina de 
Laboratório de Microbiologia Geral, 
ministrada pela Prof.ª. Dra. Elisa Esposito. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
São José dos Campos-SP 
2018 
1 INTRODUÇÃO 
 
Os métodos de contagem microbiana em alimentos podem ser agrupados em 
métodos diretos e indireto. Os métodos diretos são definidos como aqueles em que 
as contagens são feitas diretamente do micro-organismos. Dentre eles estão a 
contagem em placas (superfície, profundidade e micro gota), contagem e câmara de 
Neubauer. Dentre os métodos indiretos, estão a contagem em tubos múltiplos. 
Métodos espectotométricos, métodos baseados na quantificação de ATP e RNA 
mensageiro [1]. 
Dos diversos métodos empregados para se avaliar o número de bactérias do 
solo, o mais utilizado baseia-se na contagem de colônias em placas de Petri, no qual 
se verifica uma significativa variação das condições utilizadas, basicamente o meio de 
cultura, a diluição do inóculo, a temperatura e o tempo de incubação [2]. 
O composto orgânico é o produto final de um processo de compostagem 
utilizado como forma de reciclagem da matéria orgânica presente em resíduos sólidos 
urbanos. O processo de decomposição da matéria orgânica, por agentes microbianos 
naturalmente presentes, ocorre através de fermentação controlada em condições 
aeróbicas ou anaeróbicas, nas chamadas unidades ou usinas de compostagem. O 
composto orgânico (húmus) obtido contém macro e micronutrientes essenciais às 
plantas e, quando utilizado em solos, ajuda a melhorar as propriedades físico-
químicas dos mesmos, favorecendo a produtividade vegetal, sendo indicado para 
aplicações e usos em horticultura, fruticultura, produção de grãos, reflorestamento, 
controle de erosão, entre outros [3]. 
Pelo que se observa, as diferentes condições de cultivo empregadas para 
quantificar o número de bactérias do solo devem-se ao fato de haver uma diversidade 
microbiana, sendo praticamente impossível permitir que todos os microrganismos 
cresçam em uma única situação de cultivo [4]. 
 
 
 
 
 
 
2 MATERIAIS E MÉTODOS 
 
2.1 MATERIAIS 
Os materiais utilizados para o procedimento: 
• Água Destilada 
• Água Milli-Q 
• Alça de Drigalski 
• Beker 
• Centrífuga 
• Erlenmeyer 
• Frasco reagente com rosca, contendo meios TSA, Complexo e Sabouraud 
• Glicerol 15% 
• Incubadora com agitação 
• Lamparina de vidro 
• Luva térmica 
• Manta de aquecimento 
• Micropipeta 
• Placa de Petri 
• Tubo falcon 
 
2.2 MÉTODOS 
 Em uma manta de aquecimento, foi colocada com o auxílio de uma luva térmica 
as três soluções preparadas durante a aula prática um de “Elaboração de Meio de 
Cultura Sólido”, os meios TSA, Complexo e Sabouraud, já que as soluções haviam 
sido congeladas, e após elas ficarem em estado líquido, foram colocados cada um em 
duas Placas de Petri, procedimento realizado com assistência da Técnica de 
Laboratório Ticiane. 
 Numa balança analítica foi pesado 10,0089g de amostra de solo, oriunda de 
compostagem (amostragem trazida pela Prof.ª. Dra. Elisa Esposito), e disposto em 
Erlenmeyer contendo 90mL de água destilada, seguindo-se posteriormente para a 
incubadora com agitação, no primeiro momento a 160 rpm por um período de 7,5 
minutos e 37ºC, no segundo momento a 120 rpm em 7,5 minutos. 
 Com uma micropipeta foi dado início a diluição seriada, sendo colocado 1mL 
da solução de amostra de solo em tudo falcon com volume de 10mL com água 
destilada (diluição de 10x), em seguida foi retirada 1mL dessa solução e passada para 
um novo tubo falcon, igualmente ao anterior, com volume de 10mL e água destilada 
(diluição de 100x), e o procedimento se repete mais uma vez, 1mL da última diluição 
é transferido para um tubo falcon de 10mL contendo água destilada (diluição de 
1000x). 
 Tendo a solidificação dos meios de cultura, foi preparada a inoculação, sendo 
separada uma placa de cada meio para dividir as duas diluições de menor 
concentração (100x e 1000x) e uma inteira para a de maior concentração (10x), 
próximo ao fogo com o auxílio de uma Alça de Brigalski, foi realizado o espalhamento 
das gotas de cada meio, com o fim da inoculação, as placas de Petri ficaram na 
incubadora por um período de 24 horas em 24,2ºC. 
 Após uma semana, foi identificado que a maioria das amostras cresceram muito 
nos meios de cultura, impossibilitando a contagem, deste modo foi realizado 
novamente a diluição e inoculação das amostras que não era possível a contagem e 
mantidas as que era possível, assim foi pesado 2,5g de terra compostado e 
adicionadas em 10mL de água Milli-Q (água ultrapura). Em dois falcon’s foram 
colocados 10mL de água Milli-Q para diluir em fatores de 1000x e 10000x em duas 
placas de cada meio, Sabouraud, TSA e PDA, sendo que em outra placa com 
Sabouraud foi purificado o micro-organismo da diluição de 100x. 
 Após a purificação, foi realizada a raspagem dos meios que não foi possível 
realizar a contagem, próximo ao fogo foram abertas as placas, uma de cada vez, com 
o auxílio de uma Alça de Drigalski raspou-se os micro-organismos e os colocou em 
um tubo falcon com 20mL de água destilada, sendo posteriormente descartados. 
 Foi adicionado uma gota de cada solução da diluição de 1000x e 10000x, em 
uma placa de Petri, nos meios TSA, Complexo e Sabouraud, totalizando 6 novas 
placas, um meio para cada diluição, e com a Alça de Brigalski próximo ao fogo foi feito 
o espalhamento pelo método de esgotamento, com Parafilm foi lacrado as placas e 
guardadas na geladeira por 12 horas. 
 Após uma semana foi realizada a contagem da placa que havia sido purificada, 
a diluição 10000x em meio Sabouraud, onde foi necessário dividi-la em quatro 
quadrantes para facilitar a contagem, no entanto apenas foi usado os dois quadrantes 
da esquerda, já que os da direita estavam ruins para a realização da contagem. A 
solução de diluição de 100x também foi purificada e posteriormente conservada com 
glicerol 15%. 
 
3 RESULTADOS 
Para a contagem a placa foi dividida em 4 quadrantes, mas apenas os da direita 
foram usados, os dados obtidos foram: 
 
• 1º Quadrante: 76 UFC 
• 2º Quadrante: 80 UFC 
 
Totalizando 156 UFC na área esquerda da placa, com a impossibilidade de 
contagem da área direita, foi deduzido que poderia haver a mesma quantidade de 
UFC que na esquerda, gerando assim uma média/estimativa de 350 UFC presente na 
amostra. 
Por meio de uma regra de três foi calculada a UFC/g de solução: 
1mL (solução) ----0,0001g (amostra) 
0,1 ml (alíquota) ----- x g 
 
x = 0,00001 g ou mL 
 
 
350 UFC’s (UFC da amostra) ------ 0,00001 g ou mL 
x UFC’s ------ 1 g 
 
x = 35.106 UFC/g ou mL ou 35.000.000 UFC/g ou mL 
 
 
 
 
 
 
 
4 DISCUSSÃO 
 As placas de Petri com menores diluições tiveram um grande crescimento 
microbiano, evidenciando que a amostra de solo compostado utilizada no protocolo 
detinha bastante matéria orgânica e nutrientes necessários para o crescimento de 
bactérias e fungos, desta maneira foi necessário repetir o procedimento com maiores 
diluições,no entanto, com a maior diluição, 10000x, ainda assim em metade da placa 
não era possível realizar a contagem, sendo necessário realizar uma estimativa em 
relação a outra metade que possibilitava a contagem, desta maneira pode se concluir 
que o solo compostado detém um potencial de aplicação em plantas, podendo ser 
utilizados como bioinoculantes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 REFERÊNCIAS 
 
[1] Métodos de contagem microbiana. Valença, 1ª Edição, 2016, 28p. Disponível em: 
<http://ww1.microbiologia-de-alimentos.com>. Acesso em: 30 novembro 2018. 
 
[2] Vieira, Francisco Cleber Sousa; Nahas, Ely. Quantificação de bactérias totais e 
esporuladas no solo. Scientia Agricola. São Paulo - Escola Superior de Agricultura 
Luiz de Queiroz, v. 57, n. 3, p. 539-545, 2000. Disponível em: 
<http://hdl.handle.net/11449/29621>. Acesso em: 30 novembro 2018. 
 
[3] Neto, J. T. P. - Manual de Compostagem, Unicef, Belo Horizonte, p. 17-22, (1996). 
 
[4] KENNEDY, A.C.; GEWIN, V.L. Soil microbial diversity: present and future 
considerations. Soil Science, v.162, p.607-617, 1997.