Crescimento microbiano

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Crescimento microbiano
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Introdução ao Crescimento Microbiano
Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de células e não ao aumento das dimensões celulares.
Crescimento Populacional: é definido como o aumento do número, ou da massa microbiana.
A taxa de crescimento é a variação no número ou massa por unidade de tempo.
O tempo de geração é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique. O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos até dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas. O tempo de geração não corresponde a um parâmetro absoluto, uma vez que é dependente de fatores genéticos e nutricionais, indicando o estado fisiológico da cultura. O tempo de geração pode ser calculado quando uma cultura encontra-se em fase exponencial, pela fórmula abaixo:
N=No.2n, onde N= número final de células, No= número inicial de células, n= número de gerações.
n= log(N) - log(No)/0.301
g = t/n , onde g= tmpo de geração, t= tempo de crescimento e n= determinado acima.
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Medidas do crescimento microbiano
O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes técnicas, tais como pelo acompanhamento da variação no número ou peso de células, por exemplo. Dentre as diferentes técnicas utilizadas, descreveremos alguns exemplos.
Contagem total de células: esta metodologia envolve a contagem direta das células em um microscópio, seja de amostras fixadas (e coradas) ou analisadas a fresco, (sendo aplicados cerca de 10 µl da suspensão, na maioria dos casos), utilizando-se câmaras de contagem. A contagem direta é uma técnica rápida, mas tem como principais limitações a impossibilidade de distinção entre células vivas e mortas (o que pode ser contornado pelo uso de corantes vitais, para leveduras) e contagens errôneas, devido às pequenas dimensões de algumas células, ou pela formação de agregados celulares.
Em preparações não coradas, deve-se utilizar microscópio de contraste de fase, o qual deve ser empregado apenas quando as células não estão muito diluídas (<106 células/ml).
Exemplo ilustrando o procedimento de contagem direta
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)
Há também os contadores eletrônicos (do tipo Coulter) usados em hematologia, que podem ser empregados na contagem de células microbianas. Em determinadas situações, por exemplo quando se requer apenas uma estimativa da quantidade de microrganismos, pode-se empregar a contagem proporcional, que corresponde a uma análise comparativa das culturas com suspensões padrão. Como exemplo de uma suspensão padrão podemos citar a escala de MacFarland, que corresponde a uma série de tubos contendo uma solução de BaSO4 em diferentes concentrações, apresentando assim, graus de turvação distintos. Desta forma, comparando-se a turvação da cultura em estudo com os tubos de MacFarland, pode-se obter uma estimativa do número de células presentes na amostra.
Contagem de viáveis: Procedimento também conhecido como contagem em placa, que estima o número de células viáveis (isto é, capazes de se reproduzir) em uma amostra. Esta metodologia envolve a coleta de alíquotas de uma cultura microbiana em diferentes tempos de crescimento, as quais são então inoculadas em meio sólido. Após a incubação dos meios, geralmente por uma noite, o número de colônias é contado. Como uma colônia normalmente é originada a partir de um organismo, o total de colônias que se desenvolvem no meio corresponde ao número de células viáveis presentes na alíquota analisada. Esta técnica deve sempre realizada empregando-se várias diluções (100 a 104 células) das amostras. A contagem de viáveis pode ser feita pela semeadura em superfície ou em profundidade ("pour plate"). Geralmente o volume a ser inoculado não deve ultrapassar 0,1 ml, para evitar a confluência das colônias. Se a técnica de semeadura em profundidade for utilizada, pode-se inocular de 0,1 a 1,0 ml de células. Esta técnica é precisa quando o número de colônias (ou placas de lise, no caso de partículas virais ) contadas situa-se entre 30 e 300 e quando as condições culturais e ambientais estão adequadas para os microrganismos analisados. Este tipo de contagem está sujeito a grandes erros (agregados, duas células próximas, originando uma colônia), que podem ser minimizados pela realização de triplicatas para cada diluição. Esta metodologia é amplamente utilizada, exibindo elevada sensibilidade, detectando baixos números de células e permitindo também a contagem de diferentes tipos de microrganismos, pelo emprego de meios seletivos (meios que favorecem o crescimento de um determinado tipo ou grupo de organismo) e/ou seletivos e diferenciais (meios que além de favorecerem o desenvolvimento de um tipo ou grupo de organismo, também permite sua distinção, a partir de alguma característica fenotípica).
Também podem ser usadas membranas filtrantes, onde os líquidos são filtrados e as membranas colocadas diretamente sobre os meios de cultura.
Técnica de contagem de viáveis
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) 
Massa de células: pode ser determinada a partir da estimativa do peso seco ou do peso úmido de uma cultura. Este tipo de procedimento é realizado quando não é necessário determinar o número preciso de microrganismos presentes.
Peso seco: Muito utilizado na quantificação de fungos, onde o micélio é retirado da cultura, lavado e transferido para um frasco e submetido à secagem. Realizam-se então sucessivas pesagens, até o momento onde não observa-se mais variações. Este procedimento pode também ser realizado centrifugando-se a cultura e pesando o sedimento, ou então secando-o (100 - 150°C/16 horas) e depois pesando-o.
Turbidimetria: quantificação em espectrofotômetro ou colorímetro a 660 nm, uma vez que neste comprimento de onda, a cor geralmente parda dos meios de cultura não interfere com os resultados. Nestes comprimentos, a absorção de luz por componentes celulares corados é desprezível mas, se necessário, outros comprimentos de onda podem ser usados. Tal metodologia requer a confecção de uma curva padrão. Embora a análise turbidimétrica seja menos sensível, é de rápida e fácil execução, não destruindo a amostra. Entretanto, não permite a determinação de células viáveis.
Análises químicas: A partir da quantificação de proteínas ou de nitrogênio, ou por meio da análise de diferentes atividades metabólicas.
Número Mais Provável (NMP): Amplamente utilizado em laboratórios de microbiologia de alimentos ou ambiental, na quantificação de microrganismos em água, leite e outros produtos. Esta metodologia é basicamente utilizada para a pesquisa de coliformes totais e coliformes fecais, que são microrganismos indicadores de poluição fecal, o que pode ter como consequência a presença de outros organismos, tais como protozoários e vírus. Esta técnica foi desenvolvida após análises estatísticas complexas. A determinação do NMP é realizada inoculando-se 3 séries de 5 tubos, com 10, 1 e 0,1 ml da água ou do produto homogeneizado em solução salina, em meios seletivos para coliformes totais contendo tubos de Durham invertidos em seu interior. Estes são incubados por 48 hs/37°C sendo então analisados quanto ao crescimento e à presença de gás no interior dos tubos de Durham. Tal resultado é considerado como positivo para a presença de coliformes totais. Amostras dos tubos positivos são então repicados para caldos seletivos para coliforme fecais, também contendo tubos de Durham, os quais são incubados por mais 24 ou 48 hs a 42°C. De todos os tubos positivos faz-se uma semeadura em placa com meio seletivo e posterior identificação bioquímica. De acordo com o número de tubos que apresentam gás determina-se o NMP, pela consulta de uma tabela desenvolvida por Hoskins (1934). Este é um teste apenas presuntivo para a presença de coliformes.
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Curva de crescimento (cultura descontínua)
Quando uma cultura microbianadesenvolve-se em um sistema fechado, pode-se confeccionar uma curva de crescimento. Esta pode ser dividida em diferentes etapas: lag, log, estacionária e de declínio.
Curva de Crescimento Padrão, em um sistema fechado
Lag: período variável, onde ainda não há um aumento significativo da população. Ao contrário, é um período onde o número de organismos permanece praticamente inalterado. Esta fase é apenas observada quando o inóculo inicial é proveniente de culturas mais antigas. A fase lag ocorre porque as células de fase estacionária encontram-se depletadas de várias coenzimas essenciais e/ou outros constituintes celulares necessários à absorção dos nutrientes presentes no meio.
A fase lag também é observada quando as células sofrem traumas físicos (choque térmico, radiações) ou químicos (produtos tóxicos), ou quando são transferidas de um meio rico para outro de composição mais pobre, devido a necessidade de síntese de várias enzimas. Assim, durante este período observa-se um aumento na quantidade de proteínas, no peso seco e no tamanho celular.
Log ou exponencial: nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Deve ser levado em conta também que neste momento, a quantidade de produtos finais de metabolismo ainda é pequena. A taxa de crescimento exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do organismo em questão. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos. Nesta fase são realizadas as medidas de tempo de geração. Geralmente, ao final da fase log, as bactérias passam a apresentar fenótipos novos, decorrentes do processo de comunicação denominado "quorum sensing".
Estacionária: Nesta fase, os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão tornando-se mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento líquido da população, ou seja, o número de células que se divide é equivalente ao número de células que morrem. Na fase estacionária que são sintetizados vários metabólitos secundários, que incluem antibióticos e algumas enzimas. Nesta etapa ocorre também a esporulação das bactérias.
Foram detectados alguns genes (sur) que são necessários à sobrevivência das células na fase estacionária. Além destes, existem outros genes (fatores  alternativos da RNA polimerase, proteínas protetoras contra dano oxidativo).
Declínio: A maioria das células está em processo de morte, embora outras ainda estejam se dividindo. A contagem total permanece relativamente constante, enquanto a de viáveis cai lentamente. Em alguns casos há a lise celular.
Culturas descontínuas tendem a sofrer mutações que podem repercutir na população como um todo. As próprias condições ambientais tendem a promover variações de caráter fenotípico (reversível) nas culturas.
Crescimento em culturas contínuas: técnica muito usada nos processos industriais de obtenção de produtos microbiológicos. Nestes casos, tem-se o interesse em manter as células em fase log ou estacionária. Utilizam-se fermentadores ou quimiostatos, que permitem um crescimento em equilíbrio dinâminco, havendo assim um controle da densidade populacional e da taxa de crescimento. Estes são respectivamente controlados pela concetração do nutriente limitante (fonte de C ou N) e pela taxa de fluxo (taxa de diluição). Em baixas concentrações do nutriente limitante, a taxa de crescimento é proporcional à concentração do nutriente (que é virtualmente zero).
Crescimento sincronizado: inicialmente obtido por processos que retardavam a síntese de DNA. Atualmente, utiliza-se métodos de separação mecânica das células menores, recém-divididas. Pode ser feita pela filtração em vários papéis de filtro, que retém células maiores, em fase de divisão.
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Efeito dos fatores ambientais no crescimento
O crescimento dos microrganismos é grandemente afetado pelas condições físicas e químicas do ambiente onde se encontram, sendo que estas podem influir positivamente ou negativamente de acordo com o microrganismo em questão.
Temperatura: Corresponde a um dos principais fatores ambientais que influenciam o desenvolvimento bacteriano. A medida que há um aumento da temperatura, as reações químicas e enzimáticas na célula tendem a tornar-se mais rápidas, acelerando a taxa de crescimento. Entretanto, em determinadas temperaturas inicia-se o processo de desnaturação de proteínas e ácidos nucléicos, inviabilizando a sobrevivência celular.
Assim, todos os microrganismos apresentam uma faixa de temperatura onde desenvolvem-se plenamente. Nesta faixa de temperatura podemos determinar as temperaturas mínima, ótima e máxima (temperaturas cardeais), para cada microrganismo. A temperatura máxima provavelmente reflete os processos de desnaturação mencionados acima, enquanto os fatores que determinam a temperatura mínima ainda não são bem conhecidos, embora certamente a fluidez da membrana seja um dos fatores determinantes destes níveis térmicos baixos.
Temperaturas cardeais dos microrganismos
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)
Dentre os diferentes microrganismos observa-se uma ampla variedade de faixas de temperatura, onde para alguns o ótimo encontra-se entre 5 e 10°C, enquanto para outros é de 90 a 100°C. Assim, os microrganismos podem ser classificados em quatro grupos, de acordo com os ótimos de temperatura: psicrófilos (0 a 20°C, ótimo de ≈ 15°C - Flavobacterium), mesófilos (12 a 45°C, 37°C - E. coli), termófilos (42 a 68°C, 62°C - Thermococcus), e hipertermófilos (80 a 113°C, 105°C - Pyrodictium brockii).
Tipos de bactérias em relação à temperatura
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) 
Psicrófilos: os ambientes frios são predominantes na Terra (oceanos, polos, solos) entretanto este grupo (bactérias, fungos e algas) é muito pouco estudado. Destes, os mais conhecidos são as algas que crescem sob o gelo ou em geleiras (Chlamydomonas nivalis), dando coloração vermelha.
Há os microrganismos psicrotolerantes que são aqueles cujo ótimo encontra-se entre 20 e 40°C e que sobrevivem a 0°C. São um grupo amplo (bactérias, fungos, algas e protozoários) que podem contaminar alimentos e outros substratos refrigerados.
Mesófilos: crescem numa faixa de 20 a 40°C, com um ótimo em torno de 37°C, sendo os principais microrganismos encontrados em animais de sangue quente.
Termófilos e Hipertermófilos: ótimos de 45 e ≥ 80°C, respectivamente. São encontrados nos solos, silagem, fontes termais e no fundo oceânico, em fontes. Geralmente são procariotos, sendo as Archaea as mais resistentes, apresentando enzimas e proteínas termoestáveis, provavelmente devido à substituição de aminoácidos, conferindo um novo folding. Têm também uma maior concentração de ácidos graxos saturados na MC. As Archaea não tem ácidos graxos na MC, mas sim hidrocarbonetos de cadeias com diferentes comprimentos, compostas por unidades repetitivas de 5 C (fitano), ligadas a glicerol fosfato, por ligação éter.
Os termófilos e hipertermófilos tem grande interesse biotecnológico porque tendem a fazer os processo mais rapidamente, com menor contaminação por outros microrganismos e possuem enzimas mais termoestáveis.
pH: Os ambientes naturais tem uma faixa de pH de 5 a 9, o que comporta o crescimento de diferentes tipos de microrganismos. 
Bactérias - faixa entre 7, com algumas acidófilas (Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com ótimo entre 2 e 3,5) e outras alcalifílicas (Bacillus e Archaea).
Fungos - tendem a ser mais acidófilos que as bactérias (pH <5).
Distribuição de alguns microrgansmos, de acordo com o pH
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) 
Tensão de O2: Extremamente importante no desenvolvimento, uma vez que os microrganismos comportam-se de forma bastante distinta, sendo classificados como aeróbios, anaeróbios facultativos, anaeróbios estritos, anaeróbios aerotolerantes e microaerófilos (requerem concentrações baixas de O2).
As condições de anaerobiose podem ser conseguidaspelo uso de agentes redutores nos meios de cultura, tais como o tioglicolato de sódio, que reage com o oxigênio, formando água; pela remoção mecânica do oxigênio, sendo substituído por nitrogênio e CO2; pelo uso de sistemas comerciais do tipo "GasPak", que gera hidrogênio e CO2 com um catalisador de paládio. Adiciona-se água ao sistema, a qual gera hidrogênio, que reage com o oxigênio na superfície do catalisador, formando água; ou ainda pelo uso de "glove box" anaeróbias ou a mesa inoculadora desenvolvida pelo VPI.
Classes de organismos, em relação à tensão de oxigênio
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) 
Água: Essencial a qualquer microrganismo, embora as necessidades sejam variadas. É o solvente universal, mas sua disponibilidade é variável (soluções com açúcares ou sais têm menos água disponível).
Aw: pressão do vapor em equilíbrio com a solução/ pv da água, variando de 0 a 1.
Os organismos que vivem em ambientes onde a disponibilidade de água é baixa desenvolvem mecanismos para extrair água do ambiente, pelo aumento da concentração de solutos internos, seja bombeando íons para o interior ou sintetizando ou concentrando solutos orgânicos (solutos compatíveis), que podem ser açucares, álcoois ou aminoácidos (prolina, betaine, glicerol).
Pressão osmótica: Fator extremamente importante, principalmente a partir do maior conhecimento sobre as Archaea, visto que vários membros deste domínio requerem altas concentrações de sais para seu desenvolvimento.
Classes de organismos, em relação à salinidade
(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) 
Fatores adicionais:
Fonte luminosa para fototróficos autotróficos.
Pressão atmosférica, para aqueles que vivem em profundidades.