Técnicas Imunológicas HIV; HCV; HBsAg; T. Cruzi

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UNIVERSIDADE POTIGUAR 
ESCOLA DA SAÚDE 
CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA 
TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS 
 
 
 
DÉHORAH RAISSA VIANA 
JOSÉ LUCAS ANDRADE 
KARINI KAROLAINY GOMES DE OLIVEIRA 
LILIANE GOMES DE OLIVEIRA 
MARCELL OLIVEIRA DA CRUZ 
RENATA FARRURE BEZERRA BARBOSA 
 
 
 
 
 
 
Natal/RN 
2017 
 
 
 
DÉHORAH RAISSA VIANA 
JOSÉ LUCAS ANDRADE 
KARINI KAROLAINY GOMES DE OLIVEIRA 
LILIANE GOMES DE OLIVEIRA 
MARCELL OLIVEIRA DA CRUZ 
RENATA FARRURE BEZERRA BARBOSA 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA 
TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS 
 
 
 
 
Relatório apresentado à disciplina de Análises Clínicas III do curso de Biomedicina 
da Universidade Potiguar - Escola da Saúde, como requisito necessário à obtenção 
de uma das notas para compor a pontuação da 1ª unidade. 
 
Orientadora: Nathalie Sena 
 
 
 
 
 
 
 
 
Natal/RN 
2017 
 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
1.1. TESTE DE AGLUTINAÇÃO PASSIVA OU INDIRETA 
 
A doença de chagas é causada pelo Trypanosoma cruzi que se desenvolvem no tubo 
digestivo de vetores e são transmitidos na forma de tripomastigotas metaciclicos pelo contato direto 
com as fezes do vetor. São encontrados em diversas espécies de animais e atingindo a espécies e 
humana através de vetores insetos. Nas áreas urbanas a transmissão é ocasionada por transfusão de 
sangue e derivados, migração de população endêmica para centros industrializados. De acordo com 
a literatura, se dá também por uma transmissão congênita, vertical, acidental, oral, ingestão de 
alimentos contaminados com vetores parasitados. Em relação ao diagnóstico inicial, uma das 
formas utilizadas é o teste rápido que se baseia na aglutinação de hemácias sensibilizadas com o 
antígeno T.cruzi em contato com o soro que contenha anticorpos contra esse protozoário. Nessa 
reação as hemácias se destacam e funcionam como um sistema indicador na confirmação de 
anticorpos. 
 
1.2. TESTE PARA HBsAg 
 
A hepatite B é caracterizada por uma inflamação hepática ocasionada pelo contato com o 
vírus da hepatite B (HBV- família Hepadnaviridae), causando uma infecção no fígado. A forma de 
transmissão se dá principalmente através do contato sexual, parenteral, oral, uso compartilhado de 
seringas e agulhas. De acordo com estudos, estima-se que cerca de 5% da população mundial sejam 
portadores dessa virose, sendo que a cura evolui em 90 a 95% dos casos. Em casos de portadores 
crônicos onde a infecção persiste, o quadro pode se agravar para uma cirrose, insuficiência hepática 
ou carcinoma hepatocelular. O diagnóstico se dá através de técnicas sorológicas. Os marcadores 
mais utilizados são: o antígeno de superfície (HBsAg), os anticorpos específicos contra o mesmo 
(anti-HBs), anticorpos específicos contra o antígeno de centro (anti-HBc) e seus anticorpos 
específicos (anti-HBe). O primeiro marcador sorológico a ser detectado no sangue é o HBsAg pela 
sua elevação na fase aguda da doença, podendo está presente também no portador crônico. 
 
 
 
 
 
1.3. TESTE PARA HIV 
 
O HIV é um retrovírus com genoma RNA, da Família Retroviridae (retrovírus). O contato 
com o retrovírus se adquire devido a alterações de hábitos sexuais, uso de drogas, transfusões de 
sangue, dentre outros. Na rotina inicial para o diagnóstico do HIV destaca-se o teste rápido, um 
método utilizado com antígenos recombinantes HIV 1 e HIV 2, que reagem com anticorpos 
presentes em amostras de soro, plasma e sangue total, com a finalidade de investigar o contato do 
ser humano com o vírus da imunodeficiência. De acordo com estudos, o período entre o contágio e 
o inicio da sintomatologia é em média de 10 anos, sendo que nesta fase as manifestações clínicas 
podem ser ausentes ou inespecíficas, porém são altamente transmissores. A introdução do 
tratamento, sendo ele terapêutico ou preventivo, varia de acordo com os marcadores virais e 
imunológicos. 
 
1.4. TESTE PARA HCV – WESTERN BLOT 
 
O vírus HCV possui genoma de RNA fita simples de polaridade positiva. A classificação 
concreta do HCV ainda não foi decretado devido a sequencia a sequencia possuir pouca semelhança 
com outros vírus conhecidos. As vias de transmissão se dão por via parenteral, transfusão de sangue 
e hemocomponentes, compartilhamento de agulhas e seringas contaminadas e transplante de órgãos, 
como também por contato sexual sendo pouco rotineiro. O teste rápido para identificação do vírus 
HCV é um método qualitativo, baseado na utilização de proteínas sintéticas e recombinantes do 
HCV, envolvidos em uma membrana para o reconhecimento do anticorpo anti-HCV nas amostras 
em análise. 
 
1.5. TESTE ELISA PARA DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DA DOENÇA DE CHAGAS 
 
O teste Elisa fundamenta-se em reações antígeno-anticorpo determinados por meio de 
reações enzimáticas, sendo a peroxidase a enzima mais utilizada para a realização desta prova. A 
enzima citada é responsável por catalisar a reação da água oxigenada (H2O2) em H2O mais O2. Uma 
das vantagens do teste é detectar uma quantidade relativamente pequena de antígenos anticorpos, 
sendo desenvolvida como uma alternativa ao radioimunoensaio. Exame imunoenzimático em fase 
sólida (propriedades podem variar de acordo com a composição) para a detecção qualitativa de 
 
 
 
anticorpos contra T. cruzi para fins diagnósticos da doença de chagas, ou seja, a imobilização de um 
dos reagentes em uma fase sólida, sendo que o outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com 
preservação tanto da atividade enzimática como da imunológica do anticorpo. O teste citado é 
responsável pela detecção de várias doenças infecciosas como HIV e doença de chagas, por 
exemplo. Uma vez que a maioria dos agentes patológicos leva a produção de imunoglobulinas, 
também podendo ser utilizado no diagnóstico de doenças auto-imunes ou alergias. 
 
2. OBJETIVO 
 
2.1. OBJETIVO GERAL 
 
Praticar o que foi visto teoricamente em sala de acordo com o principio de cada teste, HIV, HCV, 
HBsAg, HAI e ELISA para Doença de Chagas. 
 
 
3. METODOLOGIA 
 
3.1. TESTE DE AGLUTINAÇÃO PASSIVA OU INDIRETA 
 
Na aglutinação indireta utilizamos um protótipo e colocamos o antígeno adsorvido ao látex, 
em seguida introduzimos a amostra do paciente. Dessa forma, caso esta amostra contenha 
anticorpos específicos para o teste, ou seja, anticorpos contra o parasita T. cruzi, a reação antígeno-
anticorpo será visualizada através da aglutinação das hemácias. Caso contrário, as hemácias estarão 
soltas e irão se precipitar no fundo da placa, formando um botão que ocupa um espaço menor que 
50% do poço da placa. 
O presente exame utiliza pequenas quantidades de reagentes. Dessa forma, este teste é 
caracterizado como positivo através da formação de tapete cobrindo o fundo da cavidade da placa 
em “V”. Além disso, o teste será avaliado como negativo caso as hemácias sedimentem 
constituindo um “botão” compacto. 
 
 
 
 
 
3.2. TESTE PARA HBsAg 
 
O teste Imuno-Rápido HBsAg é um teste para determinação qualitativa da presença de 
HBsAg em soro, que utiliza uma combinação de anticorpos monoclonais e policlonais para 
detecção seletiva de níveis elevados de HBsAg. 
Este teste utiliza uma matriz de membrana de nitrocelulose ligada a uma tira de acetato 
transparente. Dessa forma, utiliza-se no teste um anticorpo de captura de antígeno que está ligado à 
matriz de um anticorpo marcado com o antígeno que o teste irá pesquisar. Logo, afim de detectar o 
anticorpo, utilizamos um antígeno específico ligado à matriz e um anticorpo anti-imunoglobulina 
marcado. 
Nessa instância, para poder detectar o antígeno, o teste utiliza anticorpos fixado na linha de 
captura e como conjugado um segundo anticorpo conjugado com o corante. Grande parte dos testes 
imunocromatográficos emprega corante insolúvel, como por exemplo, o ouro coloidal (com 
coloração roseada) ou prata coloidal (azul marinho), a fim de revelar a interação antígeno-anticorpo. 
Desse modo, quando há formação de duas linhas coloridas, uma na área teste e na outra o 
controle, conclui-se que o resultado foi reagente. Quando houver a formação de uma linha colorida 
apenas na área controle, o resultado não foi reagente. Quando não há formação de linha na área 
controle, o exame foi inválido. 
 
3.3. TESTE PARA HIV 
 
O teste para HIV é utilizado para investigarmos a infecção pelo vírus da imunodeficiência 
humana, que baseia-se na tecnologia de imunocromatografia bem como em imunoensaio 
enzimático. Sendo o primeiro, um teste que permite a detecção dos anticorpos das classes IgG, IgM 
e IgA específicos para HIV- 1 e HIV- 2 em sangue total, soro ou plasma e o segundo que envolve o 
uso de tiras de membranas nitrocelulose com proteínas recombinantes ou peptídeos sintéticos 
impregnados diretamente nas membranas nitrocelulose da tira e detectam apenas anticorpos da 
classe IgG. 
O método do teste, realizado na prática, ocorre por meio da incubação das tiras com amostra 
de soro ou plasma. Os anticorpos presentes na amostra se ligam especificamente as proteínas das 
tiras da membrana nitrocelulose e esses anticorpos anti-HIV específicos são ligados as proteínas e 
 
 
 
são detectados por anticorpos secundários, conjugados com uma enzima, seguido por um substrato 
que gera um produto colorido. 
Com isso, os resultados podem aparecer na tira como: controle reativo fraco, controle 
reativo forte e controle não reativo. As bandas das tiras para o teste reativo aparecerão de fácil 
visualização, enquanto que as bandas das tiras para o teste não reativo não aparecerão na amostra. 
 
3.4. TESTE PARA HCV – WESTERN BLOT 
 
O teste rápido complementar para HCV é um teste qualitativo, baseado na utilização de 
proteínas sintéticas e recombinantes do HCV, que são imobilizados em uma membrana para 
identificação seletiva de anticorpo anti-HCV, em amostras de soro ou plasma humano. 
O método para o teste baseia-se em imergir na amostra a tira da membrana nitrocelulose que 
contém proteínas recombinantes do HC. Após mergulhar a tira de membrana nitrocelulose na 
amostra de soro ou plasma, os anticorpos presentes na amostra se ligam especificamente a proteínas 
da tira, que são expressadas como GST fusão proteínas, contendo também uma banda de controle 
IgG e a banda anti-IgG. Logo, uma GST banda controle é incluída para indicar reatividade para 
nativa GST. 
Com isso, os anticorpos específicos do HCV, se presentes na amostra irão se ligar as 
proteínas de HCV existentes na tira, o anticorpo conjugado irá se ligar a qualquer 
antígeno/anticorpo apresentado na tira, seguido por um substrato que gera um produto colorido e 
com isso os resultados aparecerão na tira indicando como reagente ou não reagente , sendo de fácil 
visualização. 
 
3.5. TESTE ELISA PARA DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DA DOENÇA DE CHAGAS 
 
O método deste teste consiste na sensibilização das placas com o antígeno procurado, neste 
caso frações isoladas do parasita T. Cruzi, que, após o bloqueio, reage com os anticorpos da 
amostra. As cavidades das placas são lavadas em duas etapas – nas duas primeiras encubações de 
30 minutos – para a remoção do material não ligado a fase sólida, onde cada etapa de lavagem é 
repetida cinco vezes. O conjugado anti-anticorpo reage com anticorpo capturado pelo antígeno e a 
reação é revelada com a solução cromógena, por meio do revelador A e B. Dessa forma, a reação é 
interrompida por meio do reagente Stopper e a intensidade é analisada fotometricamente, a partir da 
 
 
 
absorbância da cor revelada, uma vez que a intensidade da cor da solução é diretamente 
proporcional a concentração de anticorpos presentes na reação. 
 
 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
4.1. TESTE DE AGLUTINAÇÃO PASSIVA OU INDIRETA 
 
Quanto ao resultado do teste, não foi possível imprimir um resultado conclusivo, devido a 
não finalização do tempo de reação, uma vez que a aula foi finalizada. Contudo, foi perceptível a 
formação de uma malha, devido a aglutinação das hemácias, mas, o tempo incompleto da reação 
não permitiu um teste fidedigno, sendo necessário aguardar mais um período, a fim da amostra se 
diluir mais. Os poços responsáveis pelo grupo controle encontravam-se com a malha formada, 
sendo possível realizar a comparação explicitada acima. 
 
4.2. TESTE PARA HBsAg 
 
O resultado para HBsAg foi negativo, uma vez que recebemos uma amostra negativa para o 
teste HBsAg. 
 
4.3. TESTE PARA HIV 
 
O resultado para o teste HIV foi negativo, uma vez que recebemos uma amostra negativa 
para o teste. 
 
4.4. TESTE PARA HCV – WESTERN BLOT 
 
O resultado para o teste HCV foi negativo, uma vez que recebemos uma amostra negativa 
para o teste. 
 
 
 
 
 
 
 4.5. TESTE ELISA PARA DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DA DOENÇA DE CHAGAS 
 
O resultado do teste foi positivo, para isto foi procurado o valor do Cut Off calculado através 
da média dos valores das absorbâncias dos controles negativos somados ao valor 0, 300, conforme 
explicitado abaixo: 
 
 
Dessa forma, os cálculos realizados permite inferir que o teste foi reagente, tendo em vista 
que o valor do Cut Off foi inferior aos valores do controle positivo que foram de 1, 893; 1,593. 
 
 
5. CONCLUSÃO 
 
 Os dados relatados permitem inferir que os valores negativos para os testes de HIV, HBsAg 
e HCV foram observados devido os alunos terem recebido amostras de soro não reagentes 
para o teste, tendo em vista a falta de experiência com as práticas realizadas e a alta 
complexidade do manuseio das amostras. 
 Em relação aos métodos diagnósticos laboratoriais para a detecção da Doença de Chagas, 
tanto o método de aglutinação indireta, como o Elisa foram reagentes ao antígeno T. Cruzi. 
O que levanta a ideia de que o paciente possui a doença, contudo, para corroborar esta 
hipótese diagnóstica seria necessário realizar o teste confirmatório Western-Blot. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
FERREIRA, Antonio Walter. ÁVILA, Sandra Lago Morais. Diagnóstico laboratorial. Ed, 
Guanabara Koogan. Rio de Janeiro, 1996. Páginas 37 a 49, 50 a 55, 144 a 149. 
 
LUQUETTI, Alejandro. MOREIRA, Eliana Furtado et al. Doença de Chagas - triagem e 
diagnóstico sorológico em unidades hemoterápicas e laboratórios de saúde pública. Brasília. 
Ministério da Saúde, Coordenação Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e Aids. 1998. 
Páginas 9, 11, 17 a 22.