RELATÓRIO SISTEMA ABO E FATOR REUMATÓIDE

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RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA
 TIPAGEM SANGUÍNEA E DOSAGEM DE FATOR REUMATÓIDE
1. INTRODUÇÃO 
	1.1. TIPAGEM SANGUÍNEA
		1.1.1.Sistema ABO:
	A aglutinação pode ser definida como uma agregação visível de partículas, resultante da interação entre anticorpos específicos e partículas insolúveis (microrganismos, células ou moléculas) que possuem epítopos em sua superfície. O método de aglutinação pode ser dividido em dois tipos: aglutinação direta e aglutinação indireta. 
	Na aglutinação direta, o epítopo, naturalmente, faz parte da partícula antigênica e a aglutinação será ocasionada por anticorpos contra este antígeno. A partir deste método direto é possível realizar alguns testes, como o de tipagem sanguínea. Isso ocorre porque na membrana da hemácia estão presentes estruturas denominadas de “globosídeos”, as quais conferem a especificidade dos diferentes tipos sanguíneos (sistema ABO). De modo didático, quem possui o globosídeo categorizado como “A” tem o sangue do tipo A; já quem tem o “globosídeo B” apresenta o tipo sanguíneo B; no caso de conter ambos os globosídeos (A e B), a pessoa terá o sangue AB; porém, indivíduos que não possuem nem um nem outro são do tipo “O”. Logo, na tipagem sanguínea as hemácias exercem o papel de antígeno, cujo determinante antigênico será o globosídeo. Como indivíduos com tipo sanguíneo distinto possuem globosídeos diferentes, é possível detectar o tipo de sangue a partir de anticorpos específicos. Se o sangue for do tipo A, irá interagir com anticorpos anti-A e a aglutinação será observada (assim sucessivamente), por exemplo. 
		1.1.1. Sistema Rh:
	Além do globosídeo, alguns Indivíduos possuem o “fator Rh” em suas hemácias – sangue Rh+ ou positivo – e apresentam aglutinação do sangue quando entram em contato com anticorpos anti-Rh. A ausência do fator Rh nas hemácias faz com que o contato com anticorpos anti-Rh não resulte numa reação de aglutinação, indicando que se trata de um sangue Rh- (ou negativo).
	O sistema Rh foi descoberto em 1940, pelos médicos Karl Landsteiner e Alex Wiener. Eles injetaram o sangue de macacos Rhesus em coelhos e observaram a formação de anticorpos específicos, levando a aglutinação das hemácias dos macacos. Para que a produção de anticorpos ocorresse, os antígenos deveriam estar presentes nas hemácias dos macacos. Logo, esse antígeno foi denominado de fator Rh, devido ao nome da espécie Rhesus dos macacos. Já o anticorpo produzido nos coelhos foi chamado de anti-Rh (também conhecido como anti-D). Após testes com amostras sanguíneas de humanos na presença do soro anti-Rh, observou-se que a maior parte sofria aglutinação (cerca de 85% das amostras), enquanto que o restante não demonstrava tal reação. A partir disso, determinou-se que alguns possuem o fator Rh e outros não. 
	Na prática de tipagem sanguínea será realiza tanto a análise do sistema ABO quanto do Rh. 
	1.2. DOSAGEM DE FATOR REUMATOIDE
	A produção de autoanticorpos é um processo que ocorre naturalmente, porém, existem os mecanismos de tolerância que evitam a ocorrência de doenças autoimunes, havendo baixa concentração desses anticorpos (insuficiente para gerar doença). Algumas células B autorreativas são específicas para a região constante da IgG (porção Fc), mas, em geral, não são ativadas, pelo fato da IgG ser monomérica, não estabelecendo ligação cruzada com o BCR. Quando complexos imunológicos são formados (após uma grave infecção ou imunização), quantidade suficiente de IgG multivalente pode se tornar disponível, estimulando tais células autorreativas (antes “ignorantes”), rompendo a tolerância imunológica. Isso leva a formação de autoanticorpos do tipo IgM ou IgG humanas em quantidade anormais, produzidos contra a porção Fc da IgG humana, sendo utilizada a dosagem do fator reumatóide para identificar tais valores anormais. 
	O método de aglutinação indireta é empregado na dosagem de fator reumatoide. Nessa metodologia é utilizado um suporte revestido com anticorpo, no caso IgG, a qual irá atuar como antígeno para identificar anticorpo anti-IgG no soro do paciente – o fator reumatóide. Na prática, o látex será o suporte utilizado.
 
2. OBJETIVOS
	2.1. TIPAGEM SANGUÍNEA
Aplicar o conhecimento sobre aglutinação direta;
Determinar o tipo sanguíneo. 
	2.2. DOSAGEM DE FATOR REUMATÓIDE
Aplicar o conhecimento a respeito da aglutinação indireta;
Determinar qualitativamente e semi-quantitativamente o fator reumatoide.
3. MATERIAIS USADOS
	3.1. TIPAGEM SISTEMAS ABO E Rh:
		3.1.1. MATERIAL:
Lâminas de vidro;
Pipetas semiautomáticas de 20 µl, 50 µl e 1 mL;
Estantes/grades;
Bastão de plástico;
Caneta para marcar as lâminas.
		3.1.2. AMOSTRA:
Sangue humano com anticoagulante EDTA.
		3.1.3. REAGENTES:
Kits de soros Anti-A, Anti-B e Anti- D;
Solução de salina (0,9%).
 
 
	3.2. DOSAGEM DE FATOR REUMATOIDE
		3.2.1. MATERIAL:
Cartão de aglutinação com fundo escuro;
Pipetas semiautomáticas de 20 µl, 50 µl e 1 mL;
Tubo de Eppendorf;
Estantes/grades;
Bastão de plástico.
Caneta para marcar tubos;
		3.2.2. AMOSTRA:
Soro do paciente.
		3.2.3. REAGENTES:
Suspensão de látex revestida de IgG humana;
4. METODOLOGIA
	4.1. TIPAGEM SANGUÍNEA
		4.1.1. Limpeza das lâminas
	Na prática, as lâminas nas quais as reações de aglutinação da amostra de sangue foram realizadas já estavam limpas com álcool 70% e secas. 	
 	 
		4.1.2. Marcação das lâminas
	Duas lâminas de vidros foram utilizadas como suporte para a observação da reação. Antes de colocar os reagentes (antígeno, no caso o sangue, e anticorpo) sobre as lâminas, foram escritas nelas as indicações para os anticorpos anti-A, anti-B e anti-D, a fim de conferir segurança quanto ao registro final do resultado do teste (caso não fosse demarcado onde cada reagente seria colocado, ao final poderia ocorrer esquecimento, de modo que não se saberia qual anticorpo promoveu a aglutinação). A identificação foi feita próximo à borda e com espaçamento entre cada anotação, no intuito de facilitar a visualização e a distinção. Em uma das lâminas foi realizada duas reação de aglutinação, sendo necessária duas marcações: a letra “A” na borda superior esquerda, simbolizando que a reação do sangue com o anticorpo anti-A foi realizada à esquerda; a letra “B” na borda superior direita, apontando que o teste com o anticorpo anti-B foi feito a direita. Na segunda lâmina, na qual o teste de aglutinação para o fator Rh sucedeu-se, foi escrito “D” na borda superior esquerda.
j Figura 1: Lâminas contendo sangue após reação com os anticorpos.
 
		4.1.3. Reação de aglutinação direta
	Após os procedimentos acima descritos, pingou-se uma gota do soro contendo os anticorpos (anti-A, anti-B e anti-D) nos respectivos locais indicados nas lâminas. Em seguida, adicionou-se 20 ul de sangue sobre cada soro e a mistura foi bem homogeneizada com um bastão de plástico. Devido a limitação de recursos, utilizou-se uma ponta do bastão para cada tipo de soro. Aguardou-se 2 minutos e a partir do resultado do teste, ou seja, da presença ou ausência de aglutinação, concluiu-se qual seria o tipo sanguíneo para os sistemas ABO e Rh da amostra analisada.
	4.2. DOSAGEM DE FATOR REUMATÓIDE
		4.2.1. Prova qualitativa
	Inicialmente, pipetou-se 20 µl do soro do paciente em uma área retangular escura do cartão, com uso da pipeta semiautomática. Posteriormente, homogeneizou-se a suspensão de látex. Feito isso, uma gota do látex foi acrescentada na mesma área do soro e se procedeu uma nova homogeneização (com o auxílio de uma espátula de plástico), porém, agora do látex e da amostra do paciente. Movimentos circulares foram executados por 2 minutos, até poder registrar o resultado do teste (presença ou ausência de aglutinação).
		4.2.2. Prova semi-quantitativa
	Depois da prova qualitativa, o soro teste foi diluído com solução salina 0,9% de forma seriada (1:2; 1:4; 1:8; 1:16). Na diluição seriada, uma quantidade fixa de 30µl da solução salina foi colocada em 4 tubos de ensaio numerado de de 1 a 4. No primeiro tubo, 30 µl do soro do paciente foi introduzida, havendo uma diluição deste soro de 1:2. Logo após homogeneizar a solução, 30 µl dessa mistura foi pipetada para o tubo 2, gerando uma proporção de 1:4 do soro em diluição. Na sequência, outros 30 µl foi pipetado, agora do tubo 2 para o tubo 3, resultando numa proporção 1:8. Depois de pipetar-se 30 µl do tubo 3 para o 4, obteve-se a última diluição, resultando na razão de 1:16 do soro. 
 
	Finalizada a diluição seriada, 20 µl da solução de cada tubo com diferentes proporções do soro (1:2; 1:4; 1:8; 1:16) foi coletado com a pipeta semiautomática e transferida para áreas retangulares escuras distintas do cartão de aglutinação. Por fim, colocou-se uma gota do látex em cada área e foi observado se houve aglutinação e até qual proporção foi identificada, sendo depois feito o cálculo semi-quantitativo. 
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Figura 2: Látex homogeneizado com o soro do paciente sobre o cartão de aglutinação.
5. RESULTADOS 
	5.1. TIPAGEM SANGUÍNEA
	A tipagem sanguínea indicou que a amostra analisada tratava-se de um sangue do tipo B negativo (Rh-).
	5.2. DOSAGEM DE FATOR REUMATÓIDE
	O resultado do teste de fator reumatoide foi negativo, pois não houve aglutinação, nem mesmo após o teste com o soro em diferentes níveis de diluição. 
	
	
	
6. CONCLUSÃO
	A partir dos testes realizados, foi possível constatar que o sangue analisado era do tipo B negativo (Rh-), pois houve aglutinação deste ao reagir com o soro anti-B, enquanto que na presença dos demais soros (anti-A e anti-D) não aglutinou.
 
	Com relação ao teste de fator reumatoide, que deu negativo, pode-se deduzir que a concentração do fator reumatoide no soro do paciente está abaixo de 8 Ul/ml (valor igual ou superior a este é indicativo de anormalidade, havendo aglutinação). Portanto, não há anormalidade na quantidade de autoanticorpos do tipo IgM ou IgG humanas produzidos contra a porção Fc da IgG humana.
7. BIBLIOGRAFIA
PORTAL EDUCAÇÃO. Fator Rh. Disponível em: <https://www.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/biologia/fator-rh/17891>. Acesso em: 12 Ago. 2017.
PORTAL EDUCAÇÃO. Imunoensaios: Ensaios de aglutinação. Disponível em:<https://www.portaleducacao.com.br/conteudo/artigos/farmacia/imunoensaios-ensaios-de-aglutinacao/54437>. Acesso em: 12 Ago. 2017.
BIOMEDICINA PADRÃO. Aglutinação indireta. Disponível em: <http://www.biomedicinapadrao.com.br/2012/10/aglutinacao-indireta.html>. Acesso em: 12 Ago. 2017.
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO – SP. Fator reumatoide (Látex). Disponível em: <http://fcfrp.usp.br/setor-de-imunologia/#.WZFgR1GGPIU>. Acesso em: 12 Ago. 2017.