Aula replicação

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Replicação do DNA
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Replicação do DNA
O mecanismo de replicação está baseado no pareamento das bases da dupla hélice do DNA.
A estrutura do DNA contém a informação necessária para perpetuar sua sequência de bases
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A replicação do DNA é semi-conservativa
Experimento realizado por Meselson & Stahl em 1958
Cultivo em meio
14NH4Cl
Cultivo em meio
15NH4Cl
Purificação do DNA seguida de centrifugação em gradiente de CsCl
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A replicação é bidirecional
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A replicação do cromossomo circular
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Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação
Replicon: 
Origem + Término
Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular
O genoma de uma célula procariótica constitue um único replicon
Cada cromossomo eucariótico constitue vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente
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A replicação é vista como um “olho” flanqueado por DNA não replicado
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O genoma bacteriano circular constitue um único replicon
 A velocidade da forquillha de replicação bacteriana é 50000pb/min
 Um única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)
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Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação
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O genoma eucariótico constitue vários replicons
 A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000pb/min
 Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes
 Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somática
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Forquilha de replicação: Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas
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Fita contínua (líder)
Fita descontínua
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Polimerases de DNA: As enzimas que sintetizam DNA
 A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos a extremidade 3´OH da cadeia em crescimento. O precursor da síntese é o desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato
 Sentido da síntese sempre é 5’  3’
 A replicação é um processo extremamente fiel. As DNA-polimerases tem atividade revisora
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Desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato (precursor)
Fita sendo polimerizada
Fita molde
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As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado
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Pareamento de bases
correto
incorreto
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Atividade revisora 3’  5’ garante a fidelidade da replicação
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Modelo da estrutura das DNA-polimerases
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Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas
			 Pol I	PolII		PolIII
Polimerização 5’  3’	 + +		 +
Exonuclease 3’  5’ +		 + +
Exonuclease 5’  3’ + - -
Número de subunidades 1 4 10
Tamanho em kDa 103 90	 ~900
Velocidade de 
Polimerização(nt/seg) 16-20 40 250-1000
Processividade	 3-200 1500		 500000
(nt adicionados antes
da dissociação do molde)
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DNA-polimerase III é uma holoenzima de mais de 10 cadeias de estrutura dimérica
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A subunidade Beta da DNA-polimerase III envolve o duplex das fitas-filhas
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Proteínas presentes na origem de Replicação de E.coli
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 Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua
 A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA
 A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas
 A DNA ligase sela as quebras
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Proteínas presentes na forquilha de Replicação de E.coli
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O complexo de replicação
 A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha 
 Cada core catalítico da DNA PolIII sintetiza uma das fitas-filhas
 O primossomo afasta uma das fitas molde
 Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas
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