Aula Replicação Mutação e Reparo

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Replicação, Mutação e Reparo do DNA
Thais Ruegger Jarrouge Bouças
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Informação Genética
Cromossomos
DNA
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DNA é replicado a cada divisão celular
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Como Começa a Formar o Organismo?
 A célula ovo, que se formou pela fecundação de um óvulo por um espermatozóide, tem toda a informação genética para formar e manter o organismo inteiro.
 Para que essa informação se expresse, essa única célula deverá proliferar.
 Deverá percorrer o chamado CICLO CELULAR.
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Ciclo Celular
“O ciclo celular é um conjunto de processos ordenados através dos quais uma célula cresce e se divide em duas células filhas.” 
A. Murray & T. Hunt, The Cell Cycle, an Introduction, 1993.
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Ciclo Celular dos Eucariotos
O ciclo de divisão da maioria das células consiste em quatro processos coordenados:
1 - Crescimento celular;
2 - Replicação do DNA;
3 - Distribuição dos cromossomos duplicados às células-filhas;
4 - Divisão Celular.
Estes processos ocorrem em 2 fases:
INTÉRFASE
Maior parte do ciclo (24 horas)
DNA difuso no núcleo.
Processos contínuos: síntese de membranas, ribossomos, mitocôndrias, lisossomos, ER, Golgi e macromoléculas.
Processos intermitentes (1 só vez no ciclo): síntese de DNA (fase S).
MITOSE:
Divisão celular (30 minutos)
filmes\ciclo celular.MOV
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Como o DNA se autoduplica na fase S????
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Replicação do DNA
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Replicação: modelo - semiconservativa
Fita parenteral serve como molde para a síntese de uma nova fita
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Fita nova
Fita nova
Replicação: modelo - semiconservativa
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Origem e Direção da Replicação
 Origem de replicação é um local específico para a ligação de proteínas que iniciam o processo de replicação.
 A replicação de eucariotos inicia em múltiplas origens;
 Cada origem produz duas forquilhas de replicação.
 Em E. coli é uma seqüência única com 245pb
 Eucariotos têm muitas origens de replicação espaçadas a intervalos de 50 a 300kb
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Início da Replicação
Como ocorre o início da replicação???
 Desenrolamento do DNA: Helicases;
 Proteínas de ligação ao DNA de fita simples (Proteínas SBBP), se ligam ao DNA e estabilizam a fita molde, mantendo-a como fita simples e permitindo que possa ser copiada.
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DNA Polimerase
Depois de ocorrer o desenrolamento do DNA pela ação da helicase, entra em ação uma outra enzima denominada DNA POLIMERASE. 
 Função: polimerizar a nova fita de DNA
 Propriedades: 
1- Polimerizam o DNA apenas na direção 5` para 3`, adicionando desoxirribonucleotídeos trifosto (dNTP) à hidroxila 3` da cadeia nascente;
2- Só adicionam nucleotídeos a uma fita já iniciada, ou seja, as DNA polimerases só irão adicionar um novo dNTP a uma fita de DNA (primers) que esteja ligada por pontes de hidrogênio a uma fita-molde complementar.
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DNA Polimerase
PRINCIPAIS TIPOS DE DNA POLIMERASE EM MAMÍFEROS: existem 5 tipos (a, b, g, d e e)
 Polimerase g: está localizada nas mitocôndrias, catalisando a replicação do DNA mitocondrial;
 Polimerase a, d e e: estão localizadas no núcleo, catalisando a replicação do DNA nuclear;
 Polimerase b: está localizada no núcleo, porém ela está relacionada com os mecanismos de reparo de DNA.
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Principais enzimas replicativas
Polimerase III em E. coli
Polimerase I remove fragmentos de Okazaki
Polimerase δ em eucariotos
Polimerase α auxilia na síntese do primer de RNA
Polimerase γ é mitocondrial
Polimerases β e ε estariam envolvidas em reparo
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DNA polimerases de mamíferos
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Propriedades das DNA Polimerases
1 - Estrutura do nucleotídeo.
Açúcar
Precisamos relembrar!!!!!
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2 - Os nucleotídeos ligam-se, através de ligações fosfodiéster. 
Propriedades das DNA Polimerases
Precisamos relembrar!!!!!
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Como ocorre a polimerização dos nucleotídeos?
 Os nucleotídeos ligam-se, através de ligações fosfodiéster. 
 A ligação é formada entre o grupo 3` hidroxil de um nucleotídeo e o grupo 5` fosfato de outro.
 A cadeia polinucleotídica formada possui orientação, ou seja, uma extremidade terminada em um grupo 5` fosfato (a extremidade 5`) e a outra, em um grupo 3` hidroxil (a extremidade 3`)
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Ligação Fosfodiéster
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Propriedade das DNA Polimerases
1- Polimerizam o DNA apenas na direção 5` para 3`, adicionando desoxirribonucleotídeos trifosto (dNTP) à hidroxila 3` da cadeia nascente;
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Propriedade das DNA Polimerases
2- Só adicionam nucleotídeos a uma fita já iniciada, ou seja, as DNA polimerases só irão adicionar um novo dNTP a uma fita de DNA ou RNA (primers) que esteja ligada por pontes de hidrogênio a uma fita-molde complementar.
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Propriedade das DNA Polimerases
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Replicação do DNA
 A síntese de ambas fitas de DNA complementares impõe algumas dificuldades ao entendimento da biologia molecular da replicação do DNA. Como as duas fitas do DNA são antiparalelas, a síntese contínua de duas fitas na forquilha de replicação exigiria que uma fita fosse sintetizada no sentido 5`- 3` e a outra no sentido 3`- 5`.
 Mas todas as DNA polimerases sintetizam 5`- 3`.
 Como, então, é sintetizada a outra fita de DNA?
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Replicação do DNA
Como este enigma foi resolvido????
 Apenas uma fita é sintetizada de modo contínuo, no sentido da replicação do DNA.
 A outra fita é formada a partir de pequenos segmentos, pedaços descontínuos, que são sintetizados de trás para frente em relação ao sentido do movimento da forquilha de replicação. Estes segmentos formados são denominados de Fragmentos de Okasaki.
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Fragmentos de Okazaki
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Replicação do DNA
Como ocorre este processo????
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Replicação do DNA
Como os fragmentos de Okazaki são unidos????
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ou/ em eucariotos DNA polimerase d
Síntese da fita descontínua
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Replicação do DNA
Resumindo
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Telômero
Seqüências não-codificantes repetidas em tandem
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Telomerase
Transcriptase reversa
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Telomerase não é ativa em tecidos humanos adultos
Senescência celular
85% de linhagens celulares tumorais expressam altos níveis de telomerase
Inibição da telomerase como tratamento para câncer
Superexpressão como tratamento anti-idade
Mechanism of Ageing and Development. 129 (2008) 3-10.
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Royal Museum of Scotland
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Fidelidade da Replicação
Conformação da DNA polimerase
Atividade de revisão (proofreading)
Ação de exonuclease no sentido 3´-5´
DNA polimerases I e II de E. coli e δ e ε em eucariotos
1 erro a cada 109 nucleotídeos incorporados
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MUTAÇÕES E REPARO DO DNA
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Mutações
DEFINIÇÃO: São modificações súbitas e hereditárias que ocorrem no material genético.
MUTANTE é o chamado organismo que apresenta forma ou função alterada, como resultado da ocorrência de uma mutação.
 O DNA, assim como qualquer outra molécula, pode sofrer uma variedade de reações químicas.
 Uma vez que o DNA serve à função peculiar de cópia permanente do genoma celular, mudanças em sua estrutura podem ter conseqüências dramáticas.
 Para manter a integridade de seus genomas, as células desenvolveram mecanismos para reparo de lesões no DNA.
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LESÕES E REPARO NO DNA
Também pode ocorrer modificações ou perda espontânea.
Quando a lesão não é reparada, uma mutação permanente é introduzida, podendo causar efeitos diversos.
Agente lesivos: radiação ou substâncias químicas.
DNA apresenta mecanismos que permitem reconhecer a lesão, e corrigir a seção danificada da fita de DNA.
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Lesões no DNA
Espontâneas
Agentes físicos, químicos ou biológicos.
Lesões não corrigidas transformam-se
em mutações
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Ponto de checagem da replicação do DNA
Ponto de checagem da integridade do DNA
Verificam se DNA está danificado
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Lesões espontâneas no DNA
a) Deaminação
Citosina
Uracil
Adenina
Hipoxantina
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Lesões induzidas no DNA
b) Agentes químicos - Alquilação
CH3
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O
O6-metilguanina
Guanina
NH2
NH2
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Reparo da O6-metilguanina
CH3
 |
O
O6-metilguanina
NH2
O6-metilguanina metiltransferase
Reversão direta da lesão
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Lesões espontâneas no DNA
b) Depurinação
NH2
dAMP
P
P
Sítio AP
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Agentes carcinogênicos
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Lesões induzidas no DNA
c) Agentes químicos – Adição de grupo volumoso
Guanina
NH
Benzo(a)pireno
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Lesões induzidas no DNA
a) Radiação UV - Formação de dímeros de timina
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Fotorreativação
Este mecanismo existe em E.coli, levedura e plantas, mas não existe em outras espécies, incluindo a humana
Reversão direta da lesão
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Dímero de timina
Provoca distorção no DNA que bloqueia a transcrição
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Reparo do DNA
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Reparo do DNA
Reversão direta da lesão
Fotoreativação – reparo direto dos dímeros de timina
Reparo da O6-metilguanina (O6-metilguanina metiltransferase)
Reparo por excisão
Reparo por excisão de base
Reparo por excisão de nucleotídeos
Reparo após a replicação
Recombinação
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Reparo por excisão de base
U formada por deaminação de C
DNA glicosilase
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Reparo por excisão de base
 AP endonuclease
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Reparo por excisão de base
Desoxirribose fosfodiesterase
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Reparo por excisão de base
DNA polimerase
DNA ligase
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Reparo por excisão de nucleotídeos
T
T
Identificação da lesão e 
clivagem por nuclease
Helicase
Remoção do oligonucleotídeo
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Reparo por excisão de nucleotídeos
DNA polimerase
Ligase
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Xeroderma pigmentoso
Sensibilidade à luz UV desenvolvendo cânceres de pele múltiplos de regiões da pele expostas à luz solar
Células de pacientes com xeroderma pigmentoso não tinham a capacidade de reparação do DNA mutado por excisão de nucleotídeos
Identificação de genes humanos envolvidos com a reparação do DNA mutado
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Câncer de Cólon
Deficiência do gene que codifica para a enzima responsável pelo reparo do DNA mutado por excisão de nucleotídeos
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Reparo após a replicação
Replicação bloqueada pelo dímero de pirimidina
Recombinação deixa falha na fita original intacta
 Fita parental intacta 
 recombina com a região 
 da falha
 Falha preenchida pela
 polimerase e ligase
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Câncer de mama
Genes relacionados com a reparação do DNA acoplada `a transcrição BRCA1
Vimos até aqui, que a informação genética de um organismo está contida nos cromossomos e, mais ainda, na molécula de DNA
Formada por um açúcar, uma base nitrogenada e grupamento fosfato, sendo que o nucleotídeo pode estar mono, di ou trifosfatado.