RELATÓRIO - Dosagem de anticorpos anti estreptolisina O (ASLO) e anticorpos anti cardiolipina

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RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA
 Dosagem de anticorpos anti-estreptolisina O (ASLO) e anticorpos anti-cardiolipina 
1 – INTRODUÇÃO
	O gênero de bactérias streptococus possui diversas espécies. Elas são separadas em grupos de acordo com a semelhança. As do grupo A, por exemplo, costumam causar faringite, febre reumática ou febre pós-parto. As espécies potencialmente patogênicas ou não patogênicas estão presentes na pele e mucosas do trato digestivo, genital e respiratório, podendo em determinadas condições, causar doença.
	As amostras de estreptococos são classificadas, conforme o tipo de hemólise: α (alfa), hemólise parcial de cor esverdeada; β (beta), uma zona descorada devido à hemólise total e; γ (gama), esta hemólise não é detectável.
Essas bactérias fazem parte da flora bucal, logo a transmissão é larga. Através do beijo, de um talher, da saliva enfim, por contato direto. E também estão no intestino, trato respiratório e na pele.
	O ASLO significa anticorpo antiestreptolisina O, o qual é um anticorpo que identifica a presença de proteína presente em uma bactéria Estreptococo beta hemolítico do grupo A. O ASLO pode ficar positivo após 7 dias do contato com a bactéria, podem alcançar o pico máximo em 2 a 4 semanas e normalizarem em 6 até 12 meses após o contato. 
	A concentração de anticorpos antiestreptolisina O aumenta no final da primeira semana após a infecção estreptocócica e atinge seu valor máximo entre a 3ª e 5ª semanas, retornando, na maioria dos casos, ao nível normal do segundo ao quarto mês. A se realizar o teste de ASLO, partículas de látex revestidas com estreptolisina O, purificadas e estabilizadas mostram nítida aglutinação quando misturadas, em uma área do cartão-teste, com um soro contendo níveis elevados de anticorpos antiestreptolisina.
	A Aglutinação tênue ou nítida, indica uma concentração igual ou superior a 200Ul/ml, constatando positividade no teste. Entretanto, a total ausência de aglutinação, indica concentração inferior a 200Ul/ml, ou seja, resultado negativo.
	A sífilis é uma doença infecciosa e sexualmente transmissível causada pela bactéria chamada de Treponema Pallidum, popularmente conhecida como cranco duro. É uma infecção altamente contagiosa podendo também ser transmitida via transfusão sanguínea se não forem tomadas todas as precauções no momento da triagem de doadores de sangue. 
	A sífilis apresenta-se em diferentes estágios: o primeiro, denominado sífilis primária, ocorre em torno de algumas semanas depois do contágio por meio de contato sexual sem camisinha, podendo ser assintomática ou com sintomas brandos; O segundo estágio denominado sífilis secundária, ocorre até oito semanas depois da formação de feridas, a saber, quando os organismos em que o sistema imunológico não teve força o suficiente para eliminar os riscos da bactéria. Neste estágio, o infectado pode sofrer com os sintomas semelhantes aos de um resfriado ou dengue e; após o desaparecimento da sífilis secundária, o paciente entra na fase latente da doença. Não há sintomas, mas os testes laboratoriais para sífilis são positivos. A fase latente é dividida em latente precoce, quando a contaminação pelo Treponema pallidum ocorreu há menos de 1 ano, ou latente tardia, nos casos de infecção há mais de um ano. o estágio terciário pode se manifestar muitos anos após a infecção. Nesse estágio, a doença pode causar danos a diversos órgãos, como o cérebro, coração, fígado, nervos, ossos, vasos sanguíneos e articulações.
	O VDRL é o exame mais simples e é usado como rastreio. Quando a suspensão antigênica do VDRL é misturada com o soro, plasma ou líquido céfalo-raquidiano (LCR) que contenham anticorpos (reaginas), as partículas de antígeno floculam e o resultado da reação é observado ao microscópio. A ausência de floculação indica resultado negativo. O VDRL costuma ficar positivo entre 4 e 6 semanas após a contaminação. O resultado é dado em formas de diluição, ou seja, um resultado 1/8 significa que o anticorpo foi identificado até 8 diluições; um resultado 1/64 mostra que podemos detectar anticorpos mesmo após diluirmos o sangue 64 vezes. Quanto maior for a diluição em que ainda se detecta o anticorpo, mais positivo é o resultado. Geralmente seus valores começam a subir uma a duas semanas após o aparecimento do cancro duro. Portanto, se o teste for feito um ou dois dias após o aparecimento da lesão da sífilis, o VDRL pode dar falso-negativo.
2 – OBJETIVOS
Detectar a presença de anticorpos anti-estreptolisina (ASLO) no soro;
 
Pesquisar a presença de anticorpos anti-cardiolipina na amostra (teste VDRL);
 
Realizar diluição seriada do soro e obter o título de anticorpos do soro;
 
Observar a possível formação da floculação ou ausência desta através do microscópio.
3 – MATERIAIS USADOS
	3.1. TESTE DE ASLO:
		3.1.1. MATERIAIS E AMOSTRAS:
 Soro teste;
Suspensão de látex revestida com estreptolisina O;
Pipetas semiautomáticas sorológicas;
 Varetas plásticas;
 Cartão-teste;
 Tubos de ensaio 13X75 mm para diluição e titulação;
 Salina a 0,9%;
 Estantes para tubos e rack de ponteiras;
 Recipiente para descarte de materiais.
 
	3.2. TESTE DE VDRL
		3.2.1. MATERIAIS E AMOSTRAS:
 Suspensão antigênica;
 
 Soro teste;
 Pipetas semiautomáticas sorológicas;
 Rack de ponteiras;
 Placa escavada ou lamina de vidro para o teste;
 Recipiente para descarte do material.
4. METODOLOGIA 
	4.1. TESTE DE ASLO
		4.1.1. ENSAIO QUALITATIVO
	A primeira parte da prática consistiu na pesquisa de anticorpos antiestreptolisina O na amostra sorológica, tratando-se apenas de um ensaio qualitativo. Para tal, 20µL do soro do paciente foi pipetado e colocado na primeira área do cartão-teste. O cartão-teste utilizado possuía 6 áreas pretas, distribuídos em duas fileiras de 3. Em seguida, homogeneizou-se a suspenção de látex e foi pipetado 20µL da mesma na área ocupada pela amostra. Com o auxílio de uma vareta plástica, a solução foi espalhada cuidadosamente (respeitando o limite do campo do cartão-teste) e bem misturada. Posteriormente, realizou-se movimentos suaves de rotação durante 4 minutos, a fim de obter-se uma melhor mistura das substâncias e assegurar que haja a interação antígeno-anticorpo (caso os anticorpos antiestreptolisina estivessem presentes). Após esse período, foi observado se ocorrem aglutinação. A visualização da aglutinação indicaria a presença de anticorpos (resultado positivo). Porém, independente da formação de aglomerados ser detectada ou não, deveria ser realizada a prova sem-quantitativa, por meio da diluição seriada da amostra. Esse procedimento é importante, pois, em alguns casos, pode haver excesso de anticorpos – efeito pro-zona – ou excesso de antígeno – efeito pós-zona, gerando um resultado falso-negativo.
		4.1.2. ENSAIO QUANTITATIVO (TITULAÇÃO)
	Para diluir o soro do paciente, foi colocado um volume fixo de 30 µL de solução salina (NaCl a 0,9 %) em 4 tubos numerados de 1 à 4 (1, 2, 3 e 4). No tubo 1, foi colocado 30 µL do soro, obtendo-se uma proporção de 1;2 da amostra em relação a solução salina. Logo após, foi pipetado 30 µL da solução do tubo 1 e transferida para o tubo dois, gerando uma proporção 1;4. Outros 30 µL foi retirado do tubo 2 e adicionado ao tubo 3, resultando numa proporção 1;8. Por fim, 30 µL foi transferido do tubo 3 para o tubo 4 (proporção 1;16). 20 µL de cada tubo usado na diluição foi colocado em áreas distintas do cartão-teste e homogeneizada com a suspensão de látex. A amostra do tubo 1 foi colocado no espaço 2 do cartão teste; a do tubo 2 na área 3; a do tubo 3 na quarta área; e a do tubo 4 no quinto espaço. Essa distribuição pode ser observada na “figura 1”. Com ajuda de uma vareta de plástico, misturou-se bem o soro com látex das soluções (nos seus devidos espaços definidos, sem invadir as áreas ocupadas pelos demais). Foram fetos movimentos rotatórios por 2 minutos e, na sequência foi observado se ocorreu aglutinação.Figura 1: Cartão-teste contendo a amostra do paciente em diferentes proporções misturada com o látex em espaços distintos. Na área “1” está a amostra pura. Na área “2” preta está a solução 1/2. Na “3” encontra-se a amostra teste 1/4. O quarto e quinto espaço possuem a amostra com proporção 1/8 e 1/16, respectivamente. É possível observar a ausência de aglutinação em todas áreas.
	4. 2. TESTE DE VDRL
		4.2.1. TESTE QUALITATIVO
	Na segunda parte da prática, fez-se a busca de anticorpos anti-cardiolipinas na amostra teste. Para isso, pipetou-se 50 µL da amostra e 20 µL da suspensão antigênica (cardiolipina). A placa foi levada a um aparelho agitador, onde foi agitada durante 4 minutos. Após esse tempo, foi feita a observação da placa ao microscópio, visando confirmar a presença ou ausência da floculação. A positividade apontaria a floculação das partículas antigênicas e o resultado da reação seria observado ao microscópio. A ausência de floculação indicaria resultado negativo.
5 – RESULTADOS
	Ambos os teste, VDRL e ASLO, apresentaram reação negativa. Esse resultado foi determinada a partir da ausência de agregados no teste ASLO, tanto utilizando a amostra pura quanto após dilui-la, o que descartou a possibilidade de efeitos pro-zona – excesso de anticorpo – ou efeito pós-zona – excesso de antígeno. O aspecto da solução formada pelo soro e a suspensão de látex revestida com estreptolisina O nas áreas do cartão-teste era homogêneo, sem formação de aglomerados. O teste confirmatório específico para anticorpos anti-cardiolipina – VDRL – também demonstrou resultado negativo, haja vista que não foi observada a formação de flocos (floculação) quando a solução da placa escavada foi visualizada ao microscópio.
6 – CONCLUSÃO
	Com base nos resultados expostos, pode-se deduzir que o paciente cujo soro foi analisado não está imunizado pela proteína estreptolisina O (já que nem mesmo após a diluição foi possível observar a aglutinação), bem como não apresenta antígenos cardiolipinas.
7 – REFERÊNCIAS 
GOMES, M. J. P. Gênero Streptococcus spp, FAVET-UFRGS, 2013. 
MDSAÚDE. Sífilis: sintomas, vdrl e tratamento. Disponível em: <https://www.mdsaude.com/2009/01/dst-sifilis.html>. Acesso em: 24 set. 2017.