ANTICORPOS MONOCLONAIS

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Imunologia Oral – Aulas Práticas
8. ANTICORPOS MONOCLONAIS
- Diferenças moleculares entre os vários tipos de Ac’s/Ig:
Isotípicas (divisão em classes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM): na região constante da cadeia pesada das Ig ver página 4 do resumo p.s.lyra.
Alotípicas (divisão em subclasses): pequenas na região constante das cadeias pesada e/ou leve.
Idiotípicas (atribuição de especificidade Ac-Ag): na região variável/de hipervariabilidade das cadeias pesada e leve, onde os paratopos, e onde se determina a especificidade das ligações aos epítopos.
	
	ACs POLICLONAIS
	ACs MONOCLONAIS (mAB)
	DESCRIÇÃO
	Mistura complexa de Ac /Ig heterogéneas
	Conjunto de Ac = /Ig homogéneas
	ORIGEM
	- Vários clones individuais de linfócitos B / linhagens de células B, em resposta à contaminação por 1 determinado Ag (processo fisiológico natural).
	- Numa única célula plasmática híbrida: hibridoma.
Célula imortal, laboratorialmente sintetizada em quantidades, através da fusão de 1 único clone de célula B e 1 mieloma (célula plasmática tumoral).
	ESPECIFICIDADE
	- Apresentam graus de afinidade e especificidade para cada tipo de Ag/de epítopos num mesmo Ag.
	 : 1 só tipo de epítopo, de 1 mesmo AG complexo.
- Clone: população celular derivada de 1 única célula progenitora.
Linfócitos naive (inativos): células B/T maduras provenientes dos órgãos linfóides que ainda não foram expostas a nenhum Ag.
Linfócitos efetores.
Linfócitos de memória.
- PREPARAÇÃO DE AC POLICLONAIS: podem ser laboratorialmente preparados a partir do soro de cobaias previamente imunizadas com 1 Ag com ≠ determinantes (epítopos).
- PRODUÇÃO DE AC MONOCLONAIS/MAB: são laboratorialmente produzidos por imortalização in vitro dos linfócitos B, através da tecnologia dos hibridomas.
Hibridação com células não produtora de Ac (mielomas), originando linhas celulares imortais que constituem fontes virtualmente inesgotáveis de 1 Ac, que mantém afinidade e especificidade constante.
Hibridoma: herda a imortalidade das células de mieloma e a capacidade de produzir Ac’s específicos das células B. 
Imunização das cobaias c/ Ag X (t2-3 semanas).
Remoção cirúrgica do baço, quando o teor de linfócitos B produzidos pela indução do Ag X é máximo. 
Objetivo: a inibição da produção + plasmócitos (células B maduras, produtoras de Ac).
Hibridação: fusão de células do baço (células B) c/ as células de mieloma (tumorais) na presença do agente fusogénio PEG.
PEG (polietileno glicol): agente diminuidor da tensão superfícial entre as membranas celulares, permitindo a sua fusão.! Células de mieloma estabelecidas numa linha celular em cultura, com mutações em enzimas envolvidas na síntese de nucleotídeos precursores de DNA).
Mitose: fusão do DNA.
Após a fusão populações celulares (resultantes de 1 conjugação).
Células B + Células B (não pretendido).
Células de Mieloma + Células de Mieloma (não pretendido).
Hibridoma: Células B + Células de Mieloma (pretendido).
Células não fundidas (não pretendido).
Colocação das células resultantes da fusão em meio HAT (hipoxantina, aminopteridina e timidina).
Células B: envelhecem e sofrem apoptose (morte natural).
Células de Mieloma: incapacidade de realizar o metabolismo no meio HAT, o que desencadeia sua morte.
Hibridoma: capacidade de se multiplicar indefinidamente. Sobrevivem no meio HAT.
Identificação dos hibridomas que produzem o Ac desejado, específico para o Ag: imunofluorescência, ELISA ou RIA.
Separação dos hibridomas com a especificidade pretendida, normalmente feita através de testes imunohistoquimicos utilizando técnicas como a imunofluorescência.
Clonagem e preservação dos hibridomas para garantir a monoclonalidade da cultura, e preserva-la nas melhores condições (para garantir a criação da linha celular: cultura primária após a 1º subcultura, que garante a produção do mesmo Ac durante 1 longo período de tempo).
Clonagem por diluição no limite: diluição e distribuição da cultura por microplacas, em concentrações inferiores a 1 célula por poço Expansão dos clones Teste para a produção de Ac de especificidade desejada no sobrenadantes da cultura.
- Vias de Síntese de Nucleótidos: 
A maioria das células animais possui a capacidade de sintetizar nucleótidos (purina e pirimidina) a partir de compostos simples de C e N.
A seleção celular no meio HAT depende da capacidade das células de sintetizarem nucleótidos através de 2 vias :
Via de novo: complexa e energeticamente dispendiosa.
A forma ativada do tetrahidrofolato transfere de 1 grupo metil/formil mecanismo bloqueado pela aminopterina (toxina potente, análoga do ácido fólico no meio HAT), que obriga as células a utilizarem a via de salvamento.
Via de salvamento: via de reciclagem.
Há conversão direta de purinas e pirimidinas em nucleótidos, para a síntese de DNA e RNA, desde que sejam fornecidos à célula os metabolitos intermediários: hipoxantina (purina) e timidina (base pirimídica timina + desoxirribose).
As enzimas que catalisam esta via, importantes na síntese de nucleótidos, são a HGPRT (fosforribosiltransferase hipoxantina-guanina) e a TK (timidina cinase).
Se alguma sofrer 1 mutação, a célula é impedida de utilizar a via de salvamento.
Células sem HGPRT ou TK morrem no meio HAT (células B e células do mieloma).
- APLICAÇÕES DOS MAB:
Análises qualitativas e/ou quantitativas: Ac’s monoclonais como instrumentos de pesquisa.
Reagentes químicos em vários testes de diagnóstico de deteção e quantificação de substâncias: macromoléculas biológicas (enzimas, hormonas, etc) e Ag (virais ou bacterianos).
Ex.: Identificação de vírus (ex.: HIV).
Ex.: Testes de gravidez.
Ex.: Doenças cardíacas.
Ex.: Tipagem de Ag de histocompatibilidade (avaliar a compatibilidade com os tecidos – transplantes).
Ex.: Deteção de Ag tumorais.
Caracterizam o fenótipo e função de diversas populações celulares.
Mediação/modulação:
Agentes terapêuticos: Ac monoclonais que se ligam a proteínas tóxicas secretadas por bactérias, inativando-as (ação neutralizante).
Purificação de substâncias:
Isolamento de proteínas (contra as quais o Ac é específicos) por cromatografia de afinidade.
Purificação de Ag/Ac através das suas afinidades específicas.
Preenchimento de colunas com beads, às quais estão ligados os Ac/Ag específicos para a proteína de interesse.
 apenas retenção para as proteínas que se ligam aos Ac’s/Ag, ligados às beads.
As restantes proteínas passam através da coluna sem se ligarem, independentemente da sua carga ou peso molecular.
Eluição das proteínas ligadas à coluna, pH: a pH ácido destruição da ligação Ac-Ag.
Ex.: Purificação de drogas utilizadas noutras terapêuticas.
- TIPOS DE ACS MONOCLONAIS, utilizados no diagnóstico de cancro:
mAb naked: não associados a qualquer droga/material radioativo.
mAb conjugados: associados a substâncias como toxinas e partículas radioativas, o que potencia a sua ação.
	
	
ACs POLICLONAIS
> heterogeneidade (mistura de Ac c/ especificidades ): tanto pode ser 1 vantagem como 1 desvantagem.
	
ACs MONOCLONAIS (mAB)
> homogeneidade (Ac’s específicos p/ 1 único epítopo): tanto pode ser 1 vantagem como 1 desvantagem.
Caso o epítopo esteja destruído (ex.: por fixação), mesmo que a molécula total de Ag esteja intacta não haverá reconhecimento.
	VANTAGENS
	Produção + rápida, barata e c/ - exigências técnicas.
Produção limitada pelas dimensões e tempo de vida do animal.
> estabilidade p/ 1 gama + vasta de pH e concentração salina.
Facilidade/possibilidade de o local de ligação (não problemático).
	 especificidade e afinidade.
> reprodutibilidade ( variabilidade de lote para lote).
Produção ilimitada: fonte constante e renovável (hibridoma imortal).
> concentração e pureza.
 nº de animais imunizados/sacrificados.
> facilidade de caracterização.
	 DESVANTAGENS
	< reprodutibilidade ( biológicas entre Ac policlonais gerados contra o mesmo Ag em animais ).
< concentração e pureza.
	Produção + lenta,cara e c/ + exigências técnicas.
> susceptibilidade a pH e concentração salina.
Ligação a outra molécula (ex.: fluorocromo) problemática: pode o local de ligação específico do Ag.
Não indicados para ensaios cross-linking (reações secundárias de precipitação e aglutinação).
Caso vários Ag com o epítopo específico do mAb, a especificidade torna-se inútil.
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Patrícia Lyra