PCR 2017 Medicina Veterinaria Unisa

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Técnica de PCR 
Desenvolvida por Kary Banks Mullis, em 1983: Síntese enzimática de cópias de ácidos nucléicos em laboratório. 
Quantidades mínimas de material genético podem ser amplificadas milhões de vezes em poucas horas.
Métodos
Três etapas básicas por ciclo
1- Desnaturação da fita molde de ADN 
2 - Hibridização ou Annealing 
3 - Amplificação
Desnaturação da fita molde de ADN
Etapa com duração entre 30s a 1min à temperatura entre 92 a 96ºC. 
A temperatura elevada separa a cadeia dupla de ADN, sendo este processo conhecido como “desnaturação”.
Desnaturação da fita molde de ADN
Hibridização ou Annealing 
Etapa com duração de 30s a 1min à temperatura entre 55 e 65ºC.
 Pareamento de dois iniciadores sintéticos (primers) que se ligam à região complementar da fita de ADN alvo que sofrerá a duplicação. 
Hibridização ou Annealing 
Objetivo da PCR: replicar apenas a sequência de interesse (tamanhos entre 100 e 600 pb). 

Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequência alvo.
Iniciadores são curtas sequências sintéticas de nucleotídeos, entre 20 e 30 bases. 
Hibridização ou Annealing 
Hibridização ou Annealing 
Amplificação
Etapa com duração entre 45s e1min à 72ºC.
Após a ligação dos primers ou iniciadores às sequências complementares de ADN, a Taq polimerase replica a cadeia de ADN. 
A amplificação inicia-se sempre no extremo 3’ do primer. 
Amplificação
Amplificação
O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida. 
Geralmente um padrão de peso molecular é adicionado em uma das fileiras do gel, assim poderá se avaliar o tamanho do fragmento amplificado.
Resultado
Vantagens
O segredo do sucesso da PCR está na capacidade que ela tem de amplificar uma sequência precisa de ADN aliada à sua simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e especificidade. 
Não é necessário isolar o ADN que se pretende amplificar.
Vantagens
A PCR consegue diagnosticar doenças de forma mais precoce, aumentando as possibilidades de sucesso no tratamento.
Limitações 
Necessidade de conhecer a sequência de ADN a amplificar para que possam ser sintetizados primers específicos. 
Limitações 
Relativa facilidade com que ocorre contaminação da amostra por ADN estranho e limitada extensão da sequência que é possível amplificar (é difícil aplicar a PCR a sequências maiores do que 5000pb). 
Pode também ocorrer incorporação errônea de bases durante a replicação.
APLICAÇÕES DA PCR
Aplicações
Diagnóstico de agentes infecciosos
Detecção de doenças hereditárias
Testes de paternidade
Estudos evolutivos
Clonagem de genes
Doenças
Brucella sp;
 Cinomose;
 Toxoplasmose;
 Raiva.
Brucella abortus
 Bactéria que causa infertilidade em animais e artrite em humanos
Detecção da toxoplasmose em grávidas
 (primers para Toxoplasma gondii, protozoário)
Sequenciamento do produto de PCR
Sequenciamento do produto de PCR
Detecção de doenças hereditárias
Alinhamento comparativo de sequências
Permite a descoberta de possíveis mutações e construção de árvores filogenética.