Biologia Molecular -parte 2

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PCR - Reação em Cadeia da Polimerase
Definição básica: Faz cópias de DNA “in vitro”, utilizando os elementos do processo de replicação da molécula DNA “in vivo”. A extração de DNA pode ser feita a partir de: sangue, plantas, bulbo capilar, sêmen, saliva, medula óssea, etc.
IMPORTANTE: Devem-se conhecer as sequências de DNA que flanqueiam as duas extremidades da região de interesse (gene ou qualquer outra sequência). Quando não se tem informação disponível na espécie faz-se genômica comparativa.
Existem protocolos diferentes, que passam basicamente por 2 etapas:
Lise – rompimento da membrana das células
Purificação – retirada de proteínas de membrana e outras presentes na amostra.
Kits de extração: Uso de colunas de purificação – na coluna de purificação são utilizadas soluções que levam as “impurezas” e deixam o DNA na coluna.
Princípio: Usa os princípios da replicação para fazer cópias de uma sequência de DNA in vitro.
Utiliza a DNA polimerase e iniciadores para formar novas cópias. A reação ocorre em ciclos que se repetem 30-35 vezes, a cada ciclo a quantidade de DNA é duplicada.
 
Etapas do processo: 1) Extração de DNA; 2) Purificação; 3) Preparação do MIX; 4) Incubação em termociclador.
Etapas dos ciclos: Cada ciclo compreende três etapas - 1) Desnaturação; 2) Anelamento dos primers; 3) Síntese ou Extensão
Há temperaturas diferentes para cada etapa.
Desnaturação:
- Aquecimento (94-96ºC) para romper as pontes de hidrogênio entre as bases.
- Depende do tamanho da sequência e da composição das bases = quanto mais C e G, maior a temperatura ou o tempo.
- Se as fitas de DNA estiverem juntas a técnica não funciona, por isso a necessidade da desnaturação.
Anelamento dos Primers:
Primers são oligonucleotídeos iniciadores. Têm uma sequência de 10-30 bases, de sentido 5’→3’. Extremidade 3’ - DNA polimerase adiciona nucleotídeos. Existem dois primers diferentes, um para cada fita:
Primer Forward (sense) (fita 3’–5’) = TTGGACCAGAGGTTC
Primer Reverse (anti-sense) (fita 5’–3’) = ATGTCAAATCTTAC – complementar e reverso
Os primers são sintetizados especificamente para cada sequência de DNA. A temperatura de anelamento depende do primer. A temperatura ideal está entre a temperatura dos dois primers.
No anelamento, a temperatura é reduzida e depende do tamanho da sequência do primer e da sequência de bases. 
Tm = 2 x (|A| + |T|) + 4 x (|C| + |G|)
Primer F = 5’ TAA CAA GTG CAA GGA TTT AGG 3’ = 13 x 2 + 8 x 4 = 58ºC
Primer R = 5’ AAG CTG CAA TGA ATC ATG AT 3’ = 13 x 2 + 7 x 4 = 54ºC
Gradiente de Temperatura: 
Primer F = 5’ CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT 3’ = 11 x 2 + 13 x 4 = 74ºC
Primer R = 5’ GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T 3’ = 13 x 2 + 12 x 4 = 74ºC
Desenho dos Primers: Os primers devem apresentar especificidade e complementariedade:
Especificidade: Não podem parear em locais indesejados do genoma (bandas inespecíficas).
Complementariedade: Devem ser complementares com as sequências alvo, mas não podem ser complementares entre si (dímeros de primers – inutiliza os primers).
Extensão:
- Adição de nucleotídeos para a síntese de uma nova fita a partir do primer pela DNA polimerase.
- Cada uma das fitas simples serve como molde para a síntese de uma nova fita a partir dos primers.
- Após o anelamento, a DNA polimerase começa a sintetizar a nova fita acrescentando nucleotídeos na extremidade 3’.
- Temperatura ótima da enzima Taq polimerase: 72ºC – resiste a alta temperatura.
- Taq polimerase: Enzima DNA polimerase termoestável isolada a partir de uma bactéria 
- Tempo de extensão varia de acordo com o tamanho da sequência
Componentes do “Master Mix” (o que é preciso para fazer a reação): Enzima DNA polimerase; MgCl2 (Cloreto de magnésio – cofator enzimático para a polimerase); dNTPs (Desoxirribonucleotídeos); Fosfatados (nucleotídeos para a síntese de nova fita (dATP, dCTP, dGTP, dTTP); Primers (iniciadores para a polimerase); Tampão (manter o pH da reação e as concentrações iônicas); DNA a ser estudado.
Faz-se uma solução única e depois a divide nos tubos de amostras, só então é colocado o DNA. É feito um tubo controle pra ter certeza que os reagentes não estão contaminados.
Padronização da reação: volume ideal para a reação que está sendo realizada.
Fases cinéticas da reação
Fase Inicial ou de screening: Primers procuram as sequências molde. A proporção de primers para sequência molde é muito maior, o que aumenta a efetividade da reação.
Fase Intermediária: A amplificação ocorre normalmente, os primers encontram o DNA molde e a enzima polimerase está trabalhando.
Fase de Platô: A amplificação já não ocorre com muita eficiência devido à limitação dos reagentes. Ocorre perda de atividade da enzima, gasto de reagentes – enzima, dNTPs, etc. Há maior probabilidade de amplificações inespecíficas.
Quando terminar os ciclos haverá muitas cópias da sequência de DNA.
A temperatura substitui a helicase e a SSB e o primer substitui a primase.
A taq polimerase é uma DNA polimerase, não se usa a DNA polimerase humana porque esta desnatura em altas temperaturas.
Visualização do produto: Eletroforese em Gel
- Técnica de separação de fragmentos de DNA, RNA ou proteínas em campo elétrico dentro de um gel.
- A molécula de DNA tem carga negativa, em pH neutro ou alcalino, assim ela é atraída para o polo positivo quando é aplicada uma corrente. A velocidade da corrida depende do tamanho da molécula (peso molecular).
- Bandas: a separação é por tamanho da sequência de DNA, as sequências menores correm mais que as maiores. 
Determinação de tamanho dos fragmentos de DNA:
Eletroforese - Utilização: 
- Métodos analíticos: presença/ausência dos fragmentos de DNA; 
- Métodos preparativos: isolar fragmentos específicos de DNA. 
Matriz (Gel):
- Depende do tamanho do fragmento que se quer visualizar;
- Gel de poliacrilamida ou de agarose;
- Quanto mais densa a malha do gel, menores são os fragmentos que podem ser separados. 
Gel mais frouxo: fragmentos grandes – agarose;
Gel mais denso: fragmentos pequenos – poliacrilamida
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida:
- Solução de bis-acrilamida;
- Utiliza um suporte em que monômeros de acrilamida se polimerizam;
- Análise DNA fita simples ou dupla;
- Separa fragmentos que diferem em 1bp
- DNA pode ser recuperado do gel com alto grau de pureza.
- Possui os poros menores que o gel de agarose.
Corrida: 1) Colocar a amostra nos pocinhos no polo negativo; 2) Preencher a cuba com o tampão; 3) Aplicar a corrente; 3) Coloração (para DNA: Nitrato de prata (AgNO3); para proteínas: Comassie Blue)
Gel de Agarose:
- Mais utilizado na análise DNA dupla fita
- Mesmo princípio da poliacrilamida
- Montagem mais fácil 
- Tamanho da malha depende da concentração do gel (varia entre 1-3%);
- Para usar o gel se agarose para separar fragmentos pequenos deve-se aumentar a concentração de agarose do gel.
Corrida: Colocar o gel solidificado na cuba de eletroforese com tampão e aplicar a corrente
Tampão de Carregamento:
- Adicionado na amostra
- Aumenta a densidade da amostra, adiciona cor, auxilia na mobilidade e migração.
- Azul de bromofenol – banda em 300 pb; verde de bromocresol; Fast green
Marcadores de peso molecular
- Aplicação da ladder: marcador de peso molecular (escadinha de peso molecular)
- Referência para a quantidade de pares de base.
Visualização do Gel de Agarose:
- Acrescentar o corante no gel
- Usar uma câmara que emite luz UV
- Intercalantes de DNA que emitem fluorescência em luz UV
- Brometo de etídio: mutagênico, carcinogênico, exige cuidados.
- GelRed: Alternativa segura ao brometo, que não oferece riscos a saúde.
Aplicações: Diagnóstico de Doenças Infecciosas, sequenciamento, detecção de mutações específicas (diagnóstico de doenças genéticas), estudos de relações evolutivas, estudos Forense, testes de paternidade, identificação de linhagens de animais, identificação de sequências repetitivas no DNA, DNA fingerprinting, amplificação de regiõesespecíficas de DNA; análise de polimorfismos de DNA; estudos evolução molecular; rastreabilidade. 
Principais vantagens: pequenas amostras de DNA molde, rapidez 
Principais desvantagens: geração de fragmentos de tamanho até 5 Kb, inespecificidade e infidelidade 
Variações da PCR: Nested-PCR; PCR Multiplex; RAPD; SSCP; qPCR (Tempo Real); RT-PCR
Nested-PCR: (PCR do PCR): Amplificação de uma região grande e depois, amplificação de uma região dentro desta – primers internos.
PCR Multiplex: Identificação de patógenos; Genotipagem de SNP; Análise de mutação; Análise de Ligação; Detecção de RNA; Estudos Forenses 
Utilização de vários pares de primers específicos – uma única reação para identificar várias coisas. Dificuldade: depende do desenho do primer.
RT-PCR (Transcription Reverse – PCR):
Detecta infecção por BRSV. Diferencia causa viral de bacteriana. O molde é o RNA e não o DNA – o RNA serve de molde para a síntese do cDNA (DNA complementar).
Primer pra extrair todo o RNA da célula – calda poli-A
Para extrair um RNA específico: primer imediatamente após a calda poli-A
PCR em Tempo Real (qPCR):
- Monitora fluorescência emitida durante a reação de PCR – dispensa o gel
- Indicador da produção de amplificados em cada ciclo da reação 
- Quantificação de DNA e RNA de maneira precisa 
- Emissão de fluorescência aumenta proporcionalmente ao produto da PCR 
- Fluoróforos SYBR Green® (imprecisa) e TaqMan® (precisa – sonda específica)
SYBR Green®:
- Vantagens: baixo custo, facilidade na manipulação e sensibilidade
- Desvantagem: ligação a todo DNA dupla fita (dímeros de primers e produtos inespecíficos), podendo superestimar a amplificação.
TaqMan®:
- Sonda: Fluoróforo (repórter) + Quencher (silenciador que reduz a fluorescência devido a proximidade com o fluoróforo) 
-Vantagens: hibridização específica entre a sonda e o alvo p/ gerar fluorescência. Sondas podem ser marcadas com diferentes fluoróforos, o que permite a amplificação de sequências distintas em uma mesma reação 
-Desvantagem: síntese de diferentes sondas para sequências distintas
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA):
- Polimorfismo gerado por mutações ou rearranjos entre 2 sítios ou no próprio sítio de ligação do primer;
- Dispersos no genoma desde cópia única até cópias altamente repetitivas 
- Utilizado para espécies que não tem genoma sequenciado;
- Vê a variabilidade genética/polimorfismos;
- PCR com primers aleatórios (~15 nt – pode ter análogos de base) - Cada primer revelará mais de 1 loci 
- Análise da estrutura genética de populações 
- Caracterização de bancos de germoplasma ou coleções de recursos genéticos;
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism):
- PCR normal, a diferença está na eletroforese;
- Explora as diferenças entre fitas simples de DNA; 
- Pareamento entre bases da mesma fita de DNA resulta em estruturas secundárias, onde a alteração em uma única base pode levar à formação de novas estruturas secundárias que possuem mobilidade eletroforética diferente da original; 
- Observa-se a conformação da molécula de fita simples no gel;
- Indivíduos heterozigotos geram pelo menos 4 bandas no gel (2 idênticas ao alelo normal e 2 ao alelo mutante) 
- Permite análise de fragmentos com 50-400bp 
- Análise: gel de poliacrilamida com ureia e formamida (desnaturante) - mantém o DNA separado
- Polimorfismos
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 
- Identifica variações na sequência de DNA entre indivíduos; 
- Usa enzimas de restrição para quebrar a sequência paleondrômica do genoma num local específico; 
- Marcadores RFLP derivam da criação ou eliminação de sítios de restrição devido à mutações ou rearranjos no DNA 
- Enzimas de restrição: Naturalmente produzidas por algumas bactérias em resposta a fagos. Papel biológico - clivar moléculas de DNA exógeno. + 3.000 enzimas de restrição conhecidas, hidrolisam uma ligação fosfodiéster em cada fita da hélice de DNA 
SÍTIO DE CLIVAGEM OU SÍTIO DE RESTRIÇÃO: Sequências de 4-8bp palindrômicas. 
Palíndromos – sequência de unidades que tenha a propriedade de manter o mesmo sentido quando lida de trás pra frente. Exemplos: Anilina A cara rajada da jararaca 
- Maioria das enzimas de restrição é específica para sítios únicos de restrição; 
- Sítios de restrição são reconhecidos independentemente da fonte do DNA 
- Fragmento de DNA produzido por um par de cortes adjacentes é chamado de FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO 
Tipos de corte das enzimas 
Quem corta mais o DNA genômico? Enzimas que reconhecem locais de restrição compostos por: 
- 4 bp clivam o DNA em média a cada 256 nt (44=256) 
- 6 bp clivam o DNA em média a cada 4096 nt (46=4096) 
- 8 bp clivam o DNA em média a cada 65536 nt (48= 65536) 
- Número de sítios de corte = número de bandas – 1
Sequenciamento
Genômica estrutural: Caracterização física de genomas inteiros, com a compreensão da organização molecular e as informações contidas numa organização, identificação e localização de genes e outros tipos de sequências utilizando tecnologias como mapeamento fino, sequenciamento completo e microarranjos de DNA.
Técnica molecular de determinação da ordem linear dos nucleotídeos de um genoma. Envolve reagentes que degradam as bases nitrogenadas, sequenciamento de uma fita simples de DNA.
Ex.: TEs, microssatélites, pseudogenes, etc. 
Utilidade de sequenciar genomas: Descoberta de genes mais rápido.
Aplicações: Sequenciamento de genomas inteiros; sequenciamento de regiões específicas; genotipagem; identificação de mutações. 
Obtenção da sequência de nucleotídeos: Produto da PCR; vetor de clonagem contendo produto da PCR 
Duas formas de sequenciamento:
- Sequenciamento por Destruição de Bases ou Método Químico 
- Sequenciamento Dideoxi ou Método da Terminação da Cadeia ou ainda Método Enzimático 
Método Químico 
- Sequenciamento fita simples de DNA 
- Processo catalítico: reagentes que degradam as bases nitrogenadas.
- Reagentes envolvidos no processo: 
Piperidina: clivagem de ligação fosfodiéster 
Dimetil sulfato: adiciona CH3 na posição N7 da guanina e N3 da adenina (lig. glicosídicas fracas)
Hidrazina: reage com a timina e a citosina, clivando as ligações glicosídicas 
-Piperidina + Dimetil Sulfato = cliva G 
-Piperidina + Dimetil Sulfato + Ácido Fórmico = cliva purinas G e A 
-Piperidina + Hidrazina = cliva pirimidinas T e C 
-Piperidina + Hidrazina + NaCl 1,5M  cliva C 
- Procedimento: Marcação da extremidade 5’ do DNA com fosfato radioativo (32P), separando os filamentos e permanecendo apenas a fita 5’→3’. O material é dividido em 4 amostras, 1 para cada combinação de reagentes, que clivam diferentes nucleotídeos, gerando fragmentos diferentes em cada tubo. 
Os fragmentos são separados no gel de poliacrilamida, de forma que cada um dos fragmentos (bandas) tenha uma diferença de 1 nt. É analisado o tamanho por padrão dos fragmentos no gel (bandas). Nos tubos das diferentes amostras são colocados no 1º reagente que cliva G, no 2º G e A, no 3º T e C, no 4º C. 
A vantagem é que não há erro na síntese de DNA pela polimerase, pois ela não é utilizada, a desvantagem é que os reagentes são tóxicos e a marcação com 32P gera bandas difusas e dispersão do sinal, além de ser um composto radioativo.
Método Enzimático: Baseado na síntese de DNA unifilamentar in vitro, na presença de nucleotídeos dideoxi (ddNTPs) (não têm o grupo 3’-hidroxila)
Pode ser de 2 tipos: Sequenciamento enzimático manual ou Sequenciamento enzimático automático. A análise é feita em gel de poliacrilamida ou por capilar; ambos utilizam o mesmo princípio.
Método Enzimático Manual 
- Procedimento: Obtenção do molde através da desnaturação de um DNA de fita dupla Anelamento do “primer” (iniciador) ao molde e a extensão do “primer”: dCTG, dGTP, dTTP, dATP + DNA polimerase Adição dos ddNTPs Os fragmentos de DNA são separados no gel, com 1 base de diferença Detecção dos fragmento após a eletroforese.
Os Primers sãomarcados com radioisótopos, e a síntese é realizada em diferentes tubos, cada canaleta do gel corresponde um diferente ddNTPs. A eletroforese é em gel de poliacrilamida desnaturante e a análise das bandas é manualmente.
Método Enzimático Automático 
Os ddNTPs são marcados com diferentes grupos fluorescentes, a eletroforese é em gel de poliacrilamida desnaturante e a análise das bandas é feita por um laser no final do gel, que excita os diferentes grupos fluorescente, de forma que cada um produz um pico de emissão diferente que é capitado por um detector e visualizado/analisado no computador.
Sequenciador automático: Analisam os eletroferogramas e o resultado é um cromatograma com 4 cores mostrando picos que representam cada uma das 4 bases do DNA 
 
Sequenciamento de Segunda Geração (Next Generation Sequencing - NGS)
Pirosequenciamento ou Sequenciamento por Síntese: Técnica que detecta os pirofosfatos (PPi) liberados durante a síntese do DNA e envolve uma cascata enzimática que resulta na liberação de luz:
-DNA polimerase 
- Klenow: atividade de adição dNTPs
-ATP sulfurilase: PPiATP
-Luciferase: oxida a luciferina
-Apirase: degrada dNTPS não incorporados e ATP em excesso
-dNTPS + primer + D-luciferina + APS
-Monitoramento dos nucleotídeos (1 por vez)
-Intensidade da luz é captada → Câmera CCD
Método
1) Preparação do DNA: Extração e purificação do DNA, fragmentação do DNA (400-600pb) (nebulização) e ligação do DNA a adaptadores A e B (fragmentos de DNA de sequência conhecida → anelamento dos primers).
2) PCR em emulsão (emPCR): Um fragmento de DNA será capturado por cada bead, e sofrerá emulsão junto com os reagentes em uma mistura de água e óleo. A bead será capturada em um micro-reator, onde ocorrerá a PCR. RESULTADO: produção de várias cópias do mesmo fragmento imobilizadas na bead (enriquecimento da amostra).
3) Pirosequenciamento: Deposição da bead contendo o amplificado nos poços da placa de sequenciamento (uma bead por poço) e a adição do Mix (contendo DNA polimerase + a solução contendo sulfurilase e luciferase).
Pirosequenciamento é um método bioluminescente (mede a liberação de PPi por meio da detecção de luz – a luciferase e a sulfurilase são responsáveis por liberar o sinal luminoso que é lido pelo sequenciador): ocorre a adição de um nucleotídeo provoca a liberação de PPi, a sulfurilase converte PPi em ATP na presença de adenosina 5’ fosfosulfato (APS) e a luciferina (na presença de Luciferase) converte o ATP em luz visível, o sinal de luz é captado por câmera CCD (Charge Coupled Device).
Illumina Genome Analyzer - Solexa: Sequenciamento por Síntese
Utiliza nucleotídeos marcados com diferentes fluoróforos. Inovação: amplificação in vitro dos fragmentos em uma plataforma sólida de vidro → PCR de fase sólida.
Applied Biosystems SOLiD: A reação de sequenciamento é catalisada pela DNA ligase, é feito PCR de emulsão, utiliza 5 diferentes primers e 16 diferentes sondas, cada uma com 2 nt específicos e 6 análogos de base.
Aplicações: Sequenciamento de DNA e RNA (RNA-seq), perfil de expressão gênica, análise de pequenos RNAs, estudos de metilação, genotipagem de SNP
Desafios: montagem (de novo assembly ou referência), repetições do genoma, problemas de leitura
Tecnologia do DNA recombinante
DNA recombinante: ocorreu graças à descoberta das enzimas de restrição. DNA recombinante é a união de pedaços de DNA.
Molécula de DNA recombinante: Molécula construída pela ligação de um fragmento de DNA de interesse (doador) e um vetor bacteriano.
 Para fazer um DNA recombinante é preciso
1. DNA Doador - DNA de interesse - Extraído e isolado através de PCR (genes específicos), DNA genômico (biblioteca) ou cDNA (mRNA específicos ou bibliotecas). 
2. Vetor: Molécula de transporte e amplificação do DNA de interesse. É onde a molécula de DNA a ser estudada é inserida
 Passos e ferramentas moleculares necessárias para a construção de uma molécula de DNA recombinante: 
1º passo: ISOLAR o DNA do organismo doador. Pode ser utilizado genoma total ou um gene específico (PCR)
2º passo: CORTAR a molécula de DNA do organismo doador e do vetor de clonagem. O corte pode ser feito de maneira física (sonicador) ou enzimático (endonucleases de restrição). As enzimas de restrição são naturalmente produzidas por algumas bactérias em resposta a fagos; apresentam como papel biológico clivar moléculas de DNA exógeno.
- As enzimas de restrição hidrolisam uma ligação fosfodiéster em cada fita da hélice de DNA. A região onde ocorre a clivagem é chamada de sítio de clivagem ou sítio de restrição. Sequências de 4-8bp – PALINDRÔMICAS
Palíndromos – palavra, frase ou qualquer outra sequência de unidades (como uma cadeia de DNA) que tenha a propriedade de manter o mesmo sentido quando lida de trás pra frente.
5’- GAATTC -3’
3’- CTTAAG -5’
A mesma enzima usada no vetor deve ser usada no DNA doador. A maioria das enzimas de restrição é específica para sítios únicos de restrição. Os sítios de restrição são reconhecidos independentes da fonte do DNA. O fragmento de DNA produzido: FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO.
Tipos de enzimas de restrição:
3º passo: LIGAR o DNA doador ao DNA vetor de clonagem – formação da molécula de DNA recombinante
Extremidades coesivas: DNA ligase catalisa formação de uma ligação fosfodiéster.
Extremidades cegas: DNA ligase em maior concentração. Exige transformação prévia das extremidades não coesivas em coesivas por meio de 2 processos:
- Adição de nucleotídeos à extremidade 3’-OH de fragmentos de cadeia simples protuberante e adição de adaptadores às extremidades não coesivas.
4º passo: Amplificação da molécula de DNA recombinante
 Vetor de clonagem utilizado para a construção da molécula de DNA recombinante: Vetores de clonagem são moléculas de DNA que são usadas para “transportar” as sequências de DNA de interesse para os hospedeiros biológicos. 
Existem vários vetores que se pode usar para clonagem. Todos os vetores de clonagem compartilham 4 características em comum: Contêm um (ou mais) marcador genético para seleção; habilidade de promover replicação autônoma; contêm sítios de restrição únicos para facilitar a clonagem do inserto de DNA; apresentam uma quantidade mínima de DNA não-essencial para otimizar a clonagem.
 Tipos de Vetores de Clonagem: Vetores para clonagem de genes em hospedeiros bacterianos
Plasmídios:
- DNA circular dupla fita;
- Extra cromossômico;
- Ocorrem em bactérias;
- Transportam genes de resistência (antibióticos);
- Tamanho de inserto: até 20Kb
- Dezenas a centenas de cópias por bactéria
- Origem de replicação ori para replicação no hospedeiro bacteriano;
- Sítios únicos de restrição para inserção do DNA que será clonado;
- Marcador de seleção (gene de resistência a antibióticos: tet – tetraciclina, amp – ampicilina);
- Úteis para clonagem de genomas pequenos ou de genes específicos;
- Exemplos: pBR322, pUC18.
Vetores virais - Fagos:
- Vetor viral para replicação no hospedeiro bacteriano;
- Fragmento de interesse é incorporado ao genoma viral;
- Como o vírus infecta as células com alta eficiência, o gene clonado pode ser introduzido na célula hospedeira com mais eficiência do que a transformação;
- Tamanho de inserto: até 25Kb (fago lambda)
- Exemplo de vetores virais bacterianos: fago lambda (λ), bacteriófago M13.
Híbridos de plasmídio + fago = cosmídio:
- Vetor sintético híbrido de plasmídeo + fago;
- Vantagens de ambos os vetores: replicação autônoma; genes para seleção; tamanho de inserto: 45Kb
- Infecta o hospedeiro como um fago, mas se replica como um plasmídeo.
BAC (Bacterial Artificial Chromosome): Suporta insertos de até 600Kb; isolados e manipulados como plasmídeos; utilizado na construção de bancos de genomas complexos (bibliotecas genômicas)
Vetores para clonagem de genes em hospedeiros eucariotos:
YAC (Yeast Artificial Chromosome)
- Mini cromossomos de leveduras;
- Suportam insertosde até 1000Kb;
- Replicação autônoma: se comportam como um cromossomo, dividindo-se a cada divisão celular;
- Mantidos em leveduras (células hospedeiras);
-Apresentam origem de replicação, centrômero, 2 telômeros, marcador de seleção e sítio de policlonagem;
- Sofre recombinação com os cromossomos da levedura;
- Replicação lenta.
Vetores virais: retrovírus
 Passos para clonagem de uma molécula de DNA recombinante: Uma típica clonagem em plasmídio envolve 5 passos
Digestão da amostra de DNA (enzima de restrição);
Digestão do plasmídeo que será utilizado como vetor (mesma enzima de restrição);
Ligação da amostra de DNA com o vetor plasmídeo (DNA ligase);
Transformação da bactéria hospedeira (E. coli) com os produtos da ligação introdução da molécula de DNA recombinante em uma célula hospedeira apropriada: Há basicamente 2 métodos para a transformação de bactérias: eletroporação e transformação química.
Transformação química: CaCl2 e choque de temperatura
Membrana celular e o DNA apresentam carga negativa - causa repulsão. Para anular essa repulsão adiciona-se íons Ca++, que reveste a parede celular e facilita a penetração dos plasmídeos; a temperatura elevada faz com que as proteínas das membranas fiquem mais fluídas aumentando seus poros.
Eletroporação: Curto pulso de carga elétrica para facilitar a entrada do DNA. Um pulso elétrico de alta voltagem é empregado para abrir poros na membrana celular por onde o DNA plasmidial pode passar; é utilizado para inserir os vetores BACs e YACs devido ao grande tamanho do inserto.
Crescimento da bactéria transformada nas placas de ágar com a seleção para a resistência ao antibiótico.
X-gal = 5-bromo-4cloro-3indolil-beta-D-galactosídeo
Colônias azuis representam bactérias ampicilina-resistente que contêm o vetor e expressa a β-galactosidase, que hidrolisa o Xgal presente no meio. Colônias brancas representam bactérias Ampicilina-resistente que contêm plasmídeo + inserto e não produz β-galactosidase.
 Aplicações da tecnologia de DNA recombinante
1. Estudar a estrutura dos genes: Isolar genes específicos para compreender: estrutura gênica, mecanismos que regulam expressão, estudar a função do gene, determinar toda a sequência de nt (sequenciamento), caracterização e localização de genes no genoma
2. Diagnosticar doenças genéticas
- Diagnóstico de doenças genéticas, determinando se um indivíduo é portador de um gene alterado mesmo sem apresentar qualquer manifestação clínica.
- Possibilidade de se introduzir um gene em um organismo com o objetivo de corrigir doenças genéticas.
- Detectada a mutação num indivíduo, substituição do gene mutante por um gene normal é atualmente viável.
3. Terapia gênica: Embora ainda apresente dificuldades técnicas, a terapia gênica apresenta potencial:
- Pela introdução de novos genes em espécies animais e vegetais
- Plantas resistentes a pragas, adaptadas a diferentes condições de nutrientes ou de solo, produzindo frutos com mais proteínas
- Animais que produzam mais leite ou cuja carne tenha menor índice de colesterol, podem ser atualmente criados para atender os interesses dos agropecuaristas ou dos consumidores
4. Melhoramento animal e vegetal
Melhoramento Tradicional
Melhoramento por Transgenia
5. Obtenção de grandes quantidades de proteínas
- Fabricação de proteínas para o tratamento de doenças e produção de vacinas
- Bactérias que carregam um gene humano clonado em um vetor são capazes de replicar indefinidamente essa sequência de DNA, bem como de produzir a proteína que esse codifica. Dessa forma, podem ser utilizadas como indústrias de proteínas.
Ex.: insulina, hormônio de crescimento e vacina contra a hepatite são alguns exemplos de substâncias produzidas com o emprego da tecnologia do DNA recombinante.
Construção de bibliotecas de genes ou genomas 
Biblioteca de DNA - moléculas de DNA recombinante que contém os fragmentos do genoma que se pretende estudar. Coleção de clones representando as sequências de um genoma. Coleção de fragmentos de restrição clonados a partir do genoma de um único organismo.
Dois tipos básicos de bibliotecas:
– Biblioteca genômica: Construída por clonagem de todo o genoma de um organismo. Utilizam vetores que suportam grandes insertos.
Estratégia de construção: 1) isolamento do DNA total do organismo; 2) digestão do DNA genômico com enzimas de restrição; 3) digestão do DNA do vetor de clonagem; 4) ligação molécula recombinante; 5) introdução dos vetores em células hospedeiras → transformação; 6) seleção das bactérias transformadas → clones
- Isolamento e caracterização de genes e/ou conjuntos de genes (clusters);
- Mapeamento físico de regiões e/ou genomas inteiros;
- Elucidação da organização gênica;
- Identificação de elementos reguladores;
- Sequenciamento de genomas inteiros e/ou resequenciamento
Biblioteca de cDNA:
- Banco de DNA que contém somente as sequências transcritas em mRNAs maduros (genes funcionais) em um determinado tecido em um determinado momento ou situação. Contém somente moléculas de DNA complementar (cDNA) sintetizadas a partir das moléculas de mRNA: cDNA não contêm introns, qualquer sequência anterior ou posterior do gene.
Estratégia de construção: 1) isolamento do mRNA total do organismo; 2) síntese de DNA complementar de cada mRNA → transcriptase reversa; 3) digestão do cDNA com enzimas de restrição; 4) digestão do DNA do vetor de clonagem; 5) ligação → molécula recombinante; 6) introdução dos vetores em células hospedeiras → transformação; 7) seleção das bactérias transformadas → clones
Utilidades de uma biblioteca de cDNA:
Clones de cDNA podem ser gerados para: estudos de expressão; determinação da função dos genes na célula eucariota; cDNAs completos (ou quase) podem ser sequenciados para comparação com sequências genômicas; Identificar genes com suas proteínas respectivas, Identificação de éxons facultativos (splicing alternativo)
ESTs (Expressed Sequence Tags): são fragmentos de cDNA
Métodos de Análise de Ácidos Nucleicos: Hibridização
Método que utiliza a tendência natural que uma fita simples de DNA tende a se associar com sua fita complementar para formar a dupla hélice → DNA estável (princípio da complementariedade de bases). A sonda é jogada na amostra.
 Southern blotting: Técnica para analisar sequências de DNA fixas a uma membrana de nitrocelulose ou nylon, permite estudar qualquer sequência de DNA genômico sem amplificação (PCR ou clonagem). 
Princípio da técnica:
DNA é fragmentado com enzimas de restrição Separação em gel de agarose por eletroforese desnaturação dos fragmentos (imersão gel - solução NaOH) transferência do DNA para membrana hibridação (ligação das sondas) Retirada das sondas que não se ligarão Resultado por radiografia do filtro. Há imersão em solução com Sonda marcada.
Sonda é um segmento específico de ácido nucléico utilizado para identificar moléculas específicas de DNA (sequência complementar)
Marcação da sonda:
- Direta: ligação direta da molécula ao DNA ou RNA
- Indireta: uma partícula é ligada à sonda (biotina ou digoxigenina) e detectada por uma proteína marcada (avidina)
 Variações do Southern blotting
Northen blotting – análise de RNA
Western blotting – Análise de proteína: funciona como antígeno-anticorpo. É necessário conhecer a carga da proteína.
 Hibridização “in situ”: Hibridação de sondas de ácidos nucleicos para localizar sequências específicas de DNA ou RNA. A marcação da sonda é por isótopos radioativos que são fluorescentes (FISH)
Hibridação in situ fluorescente (FISH)
Microarrays: Matriz 2D em substrato sólido (membrana nylon, vidro, silicone) que permite análise de grande quantidade de material biológico. A amostra é jogada na sonda.
	
Tipos de Microarrays
- DNA microarrays: cDNA, oligonucleotídeo, BAC e SNP microarrays
- Protein microarrays: interações (-proteína, -DNA e -RNA), atividade e função proteica
- MMChips: microRNA
- Methylation arrays
- Tissue microarrays:análise histológica
- Cellular microarrays: resposta celular
- Chemical compound microarrays: drogas potenciais para alvos terapêuticos
- DNA microarrays: cDNA, SNP e oligonucleotídeo microarrays
Aplicações:
Perfil de expressão gênica: Identificação do perfil de expressão gênica em relação a efeitos de determinados tratamentos (tempo e quantidade); doenças; estágios de desenvolvimento; resposta aos patógenos.
Hibridização Genômica Comparativa: Avaliação do conteúdo do genoma em diferentes células ou organismos estritamente relacionados: deleção e duplicação.
Imunoprecipitação de cromatina (ChIP): Investigação das interações entre proteínas e DNA: epigenética, metilação, transcrição
Detecção de SNP: genotipagem, análise forense, predisposição a doenças, resposta a drogas, estudos de associação, perda de heterozigosidade, mutações em linhagens germinativas/somáticas em câncer
 Splicing Alternativo
Fusão Gênica
Fabricação dos Arrays:
Substratos: Membrana de nylon, Lâmina de vidro ou Chips de oligos
Sondas
Número: 10 a 2,1milhões
Tipo: cDNA, microRNA, DNA, oligonucleotídeo...
Custo: comerciais x personalizadas
Microarrays de oligonucleotídeos (chips) – oligos curtos (25-60 nt) sintetizados “in situ”
Microarrays spots: sondas (cDNA ou oligonucleotídeos) sintetizadas antes da deposição sobre a matriz e impressas mecanicamente em lâminas de vidro
Estudos de Expressão Gênica (cDNA)
Todas as células de um organismo têm o mesmo DNA genômico, os tipos celulares distintos ocorrem devido às diferenças na expressão gênica. A transcrição ou não de um gene é determinada pela presença/ausência de outros produtos dos genes (proteínas), exceto genes constitutivos.
 Genômica Funcional: Conexão entre sequências de cDNA e características fenotípicas do organismo; pela complexidade: proteínas e genes interagem em redes altamente conectadas; entender como as células, tecidos e órgãos funcionam em determinadas condições
Procedimento típico: Coleta da amostra, isolamento do mRNA, produção de cDNA, marcação fluorescente, hibridização, scanner, normalização e Análise dos dados
Obtenção de mRNA: Extração de mRNA (cauda poli-A), que não é uma molécula estável, a produção do cDNA o deixa mais estável. O cDNA marcado com fluoróforo permite a localização do spot onde ocorreu a hibridização
Hibridização: As amostras são misturadas e depositadas sobre o microarray
Scanner: Cada cDNA (fluoróforo) é excitado pelo laser e a fluorescência em cada “spot” é detectada. A intensidade relativa dos cDNAs Cy3/Cy5 é uma medida da abundância relativa de um mRNA específico em cada amostra.
Análise e Interpretação dos dados: Os dados devem estar limpos para coleta de informação (qc), os genes agrupados pelo padrão específico de expressão, sendo possível desenvolver uma hipótese:
-Efeitos de uma droga particular ou composto;
-Interações genéticas;
-Vias metabólicas;
A validação é feita por qPCR (PCR em tempo real)
Os Microarrays permitem: estudo da transcrição de milhares de genes ao mesmo tempo, priorizar estudos para os genes com maior potencial significativo, identificar funções potenciais de novos genes, identificar novas funções para genes conhecidos, determinar caminhos de interação gênica, Identificação de biomarcadores, farmacogenômica: respostas a drogas x perfil genético, Medicina personalizada.
Sequenciamento de RNA (RNA_seq): baixo custo, grande quantidade de informações, quantificação de transcritos, identificação de SNPs
SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)
Polimorfismo: afeta pelo mais de 1% da população.
 SNV (Single Nucleotide Variation)
- Alteração de um único nucleotídeo (substituição, inserção ou deleção)
- Abundantes no genoma em regiões codificantes e não codificantes
- Maioria bialélicos (A/T ou G/C)
- Pouco informativos se comparados com os microssatélites (multialélicos) frequência alélica
Os SNP surgem por mutação (qualquer alteração na molécula da DNA em relação à molécula parental que lhe deu origem). As mutações podem ser classificadas de diferentes maneiras:
1. Tipo de célula: Germinativa ou Somática 
2. Natureza: Gênicas ou Cromossômicas 
3. Origem: Espontânea ou Induzida 
4. Efeito: Deletéria, Neutra ou Benéfica
Se a mutação for numa célula somática, apenas suas células descendentes herdarão a mutação. Se a mutação for numa célula germinativa a prole proveniente daquela célula apresentará a mutação.
Alta taxa de mutação pode levar a morte do indivíduo e/ou destruição da espécie.
Se o material genético fosse perpetuado com perfeita fidelidade, a variação genética necessária para a evolução seria perdida, portanto a vida e biodiversidade dependem de um equilíbrio entre ocorrência de mutações e seu reparo.
 Base Molecular das Mutações Gênicas
1. Mutação por Substituição:
Purina ↔ purina (A ↔ G)
TRANSIÇÃO
pirimidina ↔ pirimidina (C ↔ T) 		
purina ↔ pirimidina (A ↔ C) (A ↔ T) TRANSVERSÃO
(G ↔ C) (G ↔ T) 
Consequências funcionais das substituições:
a) Substituições silenciosas ou sinônimas: altera o nucleotídeo, mas não o aminoácido
Funcionalmente sem efeito
Evolutivamente gera diversidade
Devido a redundância do Código Genético as mudanças na 1ª ou 2ª posição de um códon quase sempre mudam o aa, já as mudanças na 3ª posição nem sempre mudam o aa
b) Substituições de troca de sentido ou não sinônimas: o códon para um aminoácido é substituído por um códon para um aminoácido diferente: se causar a falta de funcionamento, são chamadas mutações nulas (proteína inativa); se causar apenas diminuição no funcionamento, são chamadas leaky (proteína com atividade diminuída)
c) Substituições sem sentido: a troca de um nucleotídeo gera um códon de parada (UAG, UGA, UAA). Efeito funcional: geralmente efeito deletério
2. Mutação por Inserção e Mutação por Deleção: Mudança na matriz de leitura de forma que a sequência é lida como uma nova série de códons (mutação de mudança organizacional - frameshift mutation)
 Justificativas para o aumento dos SNPs como marcadores para análise genética:
- Predominância no genoma: marcadores mais potenciais em estarem perto ou em algum loci de característica de interesse
- Regiões codificantes: afetar diretamente a função da proteína (responsável direto por variações entre Δs)
- Adequados para análise genética em larga escala: tecnologia de Chips de DNA e Sequenciamento NGS
 Metodologias para detecção de SNPs
Técnicas Tradicionais:
•PCR + digestão com enzimas de restrição (RFLP)
• Sequenciamento automático (identificação de novos SNPs)
Tecnologias mais Recentes – Genômica:
• Sequenciamento de última geração (NGS)
• Microarranjos de DNA (chips de genotipagem)
Microarrays na identificação de SNPs
Análises de associação para descobrir predisposição genética à doenças e classificar doenças fornecendo a melhor opção de tratamento.
 Análise de Wide-Genome Association (GWA):
Análise de associação com cobertura ampla do genoma: alta densidade de SNPs (todo o genoma) para identificar regiões cromossômicas associadas com um fenótipo. Baseia na suposição de que uma mutação causativa para um determinado fenótipo está em desequilíbrio de ligação com marcadores adjacentes nas diversas famílias da população. Para identificar todos os fragmentos cromossômicos com LD fraco/pequeno efeito: painéis de alta densidade. Apresenta grande aplicação médica.
Variação Estrutural CNV (Copy Number Variation)
Estudos de haplótipos para identificação de genes associados a características quantitativas é um poderoso instrumento. Um segmento de DNA pode ser representado por diferentes haplótipos (combinação de alelos que são transmitidos juntos)
Indivíduos com mesmo haplótipo podem apresentar diversidade fenotípica: CNVs (Copy Number Variations):
- Segmentos de DNA (1Kb-1Mb) com variação no número de cópias entre os Δs de uma população
- Podem conter genes inteiros:
Duplicações: desequilíbrio de dosagem
Deleções: ausência completa de genes
Genes do sistema imune tendem a seremenriquecidos com CNVs: Resistência/susceptibilidade a doenças, resposta à drogas, Diagnóstico pré-natal, Câncer de mama, utismo, esquizofrenia, Parkinson, Alzheimer, Epilepsia. Trabalhos de CNVs relacionados com resistência em bovinos: mastite, dermatofilose, carrapatos
Detecção de CNVs: CGH-array (Comparative Genomic Hybridization array)
A validação é feitA por PCR em tempo real (Detecção de perdas e ganhos de material genético (CNVs)
Microarrays no Diagnóstico
- Detecção de 206 Síndromes, além de monossomia, trissomia e triploidia (69XXX, 69XXY ou 69XYY)
- Diagnóstico pré-natal
- Teste de Genotipagem Linear array HPV (Papiloma vírus): Detecção 37 genótipos de HPV
- Teste para vírus respiratórios: Detecção de 17 tipos mais frequentes de vírus que causam infecções respiratórias em humanos
- Câncer de mama
Organismos Geneticamente Modificados
Organismo em que se tenha introduzido uma ou mais sequências de DNA/RNA (genes), provenientes de outro organismo. Alimentos Geneticamente Modificados: contém OGMs ou derivados destes
Transgênicos: Organismo geneticamente modificado que adquirem características de outro organismo por meio da Engenharia Genética
TRANSGENIA/TRANSGÊNESE - adição de um ou mais genes exógenos (espécie diferente - animal, vegetal ou micro-organismo) ao genoma do organismo de espécie diferente.
 Estratégias de transgenia: Duas estratégias na produção de transgênicos
- Transgenia de “ganho de função”: adição de fragmentos de DNA a um genoma, levando a expressão de novos genes
- Transgenia de “perda de função”: interromper a expressão de genes
 Transgênese Vegetal
Transferência de genes mediada por agrobactérias
Transferência via infecção natural
Agrobacterium rhizogenes - bactéria de solo que infecta feridas de plantas e induz a formação de raízes adventícias ao local de infecção denominada “raiz em cabeleira”. INFECÇÃO resulta em: proliferação celular: raízes adventícias.
Agrobacterium tumefaciens (A. vitis e A. rubi) – bactéria de solo que infecta feridas das plantas e induz a formação de um tumor chamado “galha da coroa”. INFECÇÃO resulta em: proliferação celular : tumor
Transferência via Co-cultura
Transferência direta de DNA para protoplastos
Via polietilenoglicol (PEG)
PEG + Ca+2 + Mg+2 + pH alto = promove ligação DNA-protoplasto
Incorporação por endocitose
Via eletroporação: Protoplastos expostos a pulsos elétricos curtos de alta voltagem na presença de DNA exógeno, permitindo a entrada do DNA
Transformação via aceleração de partículas
Biobalística:
 Transgênese Animal
Animal transgênico: “organismo cujo genoma foi artificialmente manipulado pela introdução, modificação ou deleção de um gene, alterando todas as células do organismo, inclusive as células germinativas, de tal forma que a modificação genética seja transmitida aos seus descendentes”.
1. Microinjeção de DNA em pró-núcleos de zigotos:
É o método mais utilizado. O gene de interesse é injetado no pró-núcleo por meio de uma agulha. Ocorre integração aleatória no genoma;
Vantagens:
- Eficiência alta na geração de linhagens de animais transgênicos.
- Índice de sucesso ~30% em camundongos e de 1 a 10% nas espécies domésticas.
Desvantagens:
- Não pode ser aplicado em embriões em estádios mais avançados de desenvolvimento;
- Detecção do local de inserção no cromossomo é difícil;
- Nas espécies domésticas, a frequência de integração de DNA exógeno em seus cromossomos é muito menor, o que torna a produção onerosa.
Limitações da micro-injeção de DNA em pró-nucleo:
- A expressão do transgene é condicionada pelo local de integração;
- Mutagênese de integração;
- O número de cópias transgênicas é variável;
2. Transformação via células-tronco embrionárias:
 Injeção de células tronco embrionárias em blastocistos gerando embriões híbridos (quimeras): 2 ou + linhagens distintas. Podem ser transformadas geneticamente com DNA exógeno, antes de serem usadas para a produção de animais quiméricos. 
Quando essas células transformadas formam as gônadas e participam da formação de espermatozoides e oócitos, a progênie produzida por esses indivíduos quiméricos será transgênica.
Não é o indivíduo que resulta originalmente do embrião quimérico que é transgênico, mas a próxima geração de progênies;
O indivíduo quimérico atua como “fundador” de linhagens para produção de progênies que carregam os genes desejáveis (transgênicas).
Processamento:
Passo 1- obtenção das células-tronco: Embrião fase blastocisto (200 céls); cultura de células do embrião para inserir gene; células transformadas são isoladas e cultivadas.
 
Passo 2 – transformação: DNA recombinante é inserido por eletroporação
Passo 3 - seleção das células transformadas: genes marcadores - resistência a antibióticos (CLONES +)
Passo 4 - injeção dos clones em blastocistos (microinjeção)
Passo 5 - inserção dos blastocistos em fêmeas pseudo-grávidas
Vantagens da utilização de células tronco:
- Podem ser isoladas e derivadas a partir de uma única célula;
- Podem ser mantidas in vitro por várias gerações, produzindo um número ilimitado de células geneticamente idênticas;
- Todos os tecidos da progênie quimérica, gerada a partir das células tronco, carregam o transgene no mesmo local do genoma;
- A produção de transgênicos a partir dessas células permite um grande número de animais geneticamente idênticos;
Construção de camundongos Knockout
- Tecnologia de manipulação de células tronco-embrionária e engenharia genética na geração de camundongos transgênicos
- Remoção da função de um gene existente por recombinação homóloga, portanto não há expressão do RNA
- Esse tipo de estudo tem sido crucial para elucidar função gênica, através da investigação anatômica, fisiológica, bioquímica e comportamental devido à ausência do mesmo.
Desvantagens: A ausência de determinado gene pode ser letal. Alternativamente outros genes podem compensar a ausência do gene nocauteado, mascarando os resultados.
Camundongos Knockout
- Baseado na inserção de moléculas de RNA dupla fita (dsRNA)
- dsRNA é processado pela Dicer (RNAse), originando pequenos RNAs (~22nt - RNA de interferência (siRNA). O siRNA liga-se a um complexo multiproteico RISC 
- Resultado: RNA fita simples + RISC
- Ao encontrar um mRNA complementar, esse complexo se liga e esse mRNA é degradado.
Vantagens: Pode ser utilizado em células em cultura, onde pode ser observado: diminuição da perda da função gênica de modo gradativo; se há letalidade ocorrida pela ausência da proteína; se ocorre aumento na expressão de outros genes para compensar a ausência da proteína.
3. Biobalística ou bombardeamento de partículas
Método físico que utiliza micro-projéteis acelerados para introduzir DNA ou outras moléculas em células ou tecidos (bombardeamento de células com ouro impregnado com o gene desejado). Principal vantagem: habilidade mecânica para atravessar membranas biológicas, independente da estrutura ou das características da membrana das células-alvo.
Eletroporação: Pode ser utilizada em células-alvo ou embrião
Desvantagens: Tamanho da sequência de DNA transferida é limitado;
Infecção por retrovírus
Retrovírus: vírus que inserem uma cópia de DNA de seu próprio material genético, produzido a partir de um RNA molde, no DNA da célula hospedeira após infecção. Tanto retrovírus naturais, quanto aqueles produzidos por engenharia genética podem infectar células de embriões de mamíferos.
Embriões em estádio de pré-implantação ou oócitos podem ser expostos a soluções concentradas de vírus, ou incubados sobre uma única camada de células produtoras de vírus.
Espermatozoides como vetores
Espermatozoides de várias espécies têm demonstrado habilidade de se ligarem ao DNA. São colhidos na ejaculação ou no testículo e incubados a 37-39°C em meio de fecundação. Durante os últimos 30 a 60 min, uma solução de DNA é adicionada nessa suspensão de espermatozóides. Esses espermatozóides com o gene desejado podem serutilizados tanto na fertilização in vitro como na inseminação artificial.
Injeção de DNA exógeno nos testículos
- Análise da Transgenia: Logo após o nascimento, progênies resultantes de transferência de genes por qualquer método, são examinadas quanto à presença do DNA exógeno em seu genoma. A análise é feita por PCR ou sequenciamento. Os animais que incorporam o gene em seu genoma são considerados transgênicos e podem ser utilizados para estudos subsequentes.
- Problemas e preocupações
- Expressão desregulada de genes: produção excessiva (número muito alto de cópias) ou reduzida dos produtos gênicos;
- Mutações de inserção, resultando na alteração de processos biológicos essenciais;
- Mosaicismo nos animais fundadores, resultando na transmissão do transgene para apenas alguns animais da progênie;
- Integração do transgene em cromossomo sexual, resultando em apenas um sexo contendo o transgene
- Efeitos colaterais no animal trangênico. Ex.: artrite, crescimento esquelético anormal, cardiomegalia, dermatite, úlceras gástricas e patologia renal em suínos transgênicos para o hormônio de crescimento humano.
 Enfoque dos Organismos Geneticamente Modificados
Industrial: Utilização de micro-organismos na fabricação de produtos (fermentação): vinho, pão, cerveja, queijo e iogurte. Ex: Bacillus, Zymomonas, Acetobacter, Aspergillus, Penicillium, etc.
Ambiental: Biodegradação e decomposição de materiais ou substâncias químicas, eliminação de contaminantes do meio ambiente (água, terra e ar). Ex.: bactérias que degradam petróleo
Biorreatores: Ex.: produção de energia a partir de fezes de boi e bagaço de cana
Saúde: pesquisa básica, pesquisa biomédica (xenotransplantes), indústria farmacêutica: antibióticos, vacinas, hormônios, vitaminas.
Agropecuária: aumento na produção e melhoria de características desejáveis
Vegetal: resistência a doenças, pragas, estresses ambientais (seca, acidez do solo), mais vitaminas e sais minerais, aumento na fixação de nitrogênio, frutas com maior durabilidade
Animal: resistência a doenças e pragas (carrapatos), melhor conversão alimentar, aumento da produção (leite, carne, lã)
*As características desejadas variam conforme a espécie.
Plantas geneticamente modificadas
a) Econômico:
Feijão transgênico: resistente ao vírus do mosaico dourado - Adição de dsRNA: Produção de RNA de interferência
Cana de açúcar transgênica: resistente à seca
-inserção do gene DREB (Dehydration Responsive Element Binding protein) oriundo de Arabidopsis thaliana.
-estratégia: transformação por Agrobacterium, a mesma estratégia está sendo testada em culturas de milho, algodão, feijão e cana-de-açúcar
b) Nutricional - Arroz dourado transgênico: Produção de betacaroteno (precursor da vitamina A)
*Transgênico: dois genes de narciso (Narcissus pseudonarcissus) e um gene de bactéria (Erwinia uredovora)
c) Estética - Maçã geneticamente modificada:
-cópias extras de um gene presente na maçã: polifenol oxidase, que é o responsável pela reação química que causa o escurecimento
-as cópias extras adicionadas causam o bloqueio da produção da enzima, prevenindo a reação de escurecimento (oxidação)
d) Saúde - Uvas transgênicas:
-produção de vinho: aumento da longevidade
-variedade de uva seis vezes mais rica em resveratrol: combate o colesterol e melhorar o funcionamento do sistema cardiovascular
- inserção de um gene de uma variedade selvagem chinesa de uva (Vitis pseudoreticulata) em plantas de uvas vitíferas comuns
Animais geneticamente modificados
Aplicações Práticas:
-Aumento na prolificidade e desempenho reprodutivo;
-Melhor conversão alimentar e aumento nos índices de crescimento;
-Melhor composição de carcaça;
-Maior produção de leite e/ou modificações na sua composição;
-Aumento na resistência a doenças.
Aplicações na pesquisa
-regulação gênica da ação de oncogenes e das interações celulares envolvidas no sistema imunológico;
-modelos animais para estudo de doenças genéticas humanas;
-produção de proteínas recombinantes de interesse farmacológico (humano) e zootécnico;
-transgênicos (frequentemente suínos), que não induzam a rejeição, servindo como doadores de órgãos para transplante em humanos;
a) Pesquisa Básica
Estudo da regulação e da expressão gênica. Ex. entender os mecanismos moleculares que controlam a expressão dos genes durante o desenvolvimento fetal e tecido adulto.
Estudo dos mecanismos de diferenciação celular e ativação de genes específicos em diferentes fases do desenvolvimento
*Inserção de genes fluorescentes de agua-viva ou vaga-lume em outros animais demonstra a possibilidade da transgenia
b) Indústria Farmacêutica
Utilização dos animais como biorreatores: produção de proteínas de interesse farmacêutico no leite, sangue e até mesmo na urina. Exemplos: porco produtor de hemoglobina humana.
c) Pesquisa Biomédica
Geração de modelos OGM para estudos biomédicos. Ex: Epilepsia piroxina-dependente
-sintomas: ataques que duram vários minutos (estado de mal epiléptico) envolvendo rigidez muscular, convulsões e perda de consciência
-mutação no gene ALDH7A1 (antiquitina)
d) Xenotransplantes: meios para modificar geneticamente órgãos de animais com o propósito de utilizá-los em transplantes em humanos (sem rejeição).
e) Econômico: Introdução de características econômicas
Salmão transgênico: genes que controlam o hormônio do crescimento do salmão Chinook do Pacífico (Oncorhynchus tshawytscha) e de enguia
-atingem o tamanho de mercado na metade do tempo
-Produção de apenas fêmeas estéreis
f) Vetores no combate à doenças:
Dengue: Projeto Aedes Transgênico (PAT)
-1ª etapa: Juazeiro: 17 milhões de mosquitos transgênicos liberados (2011-2012)
-2ª etapa: Jacobina: 4 milhões de mosquitos por semana (2013-2015)
Apenas os machos são liberados (eles não picam)
-mosquitos transgênicos são produzidos em laboratório, contendo um gene letal que impede que as larvas atinjam a idade adulta
 Medicamentos:
Vacinas vivas contendo OGM aprovados comercialmente no Brasil
Cenouras transgênicas: remédio a partir da cenoura transgênica
- Alivia os sintomas da doença de Gaucher, relacionada com o metabolismo de lipídios (deficiência na produção de glucocerebrosidase), levando ao acúmulo de gordura em órgãos como o baço, fígado e rins, além do surgimento de infecções ósseas e anemia.
-Transgene leva a produção da proteína taliglucerase alfa: purificada e utilizada na fabricação de medicamento injetável que reduz a formação de depósitos de gordura em 40%
Soja transgênica
- Produção em larga escala de uma droga anti-HIV: soja com um viricida que previne a contaminação pelo vírus
- TRANSGENE: gene cianovirina isolado da cianobacteria Nostoc ellipsosporum produz uma enzima que já teve comprovada sua eficácia contra o vírus em testes laboratoriais em estudos préclínicos.
 - Objetivo: gel para ser aplicado antes das relações sexuais. O princípio ativo inibe a replicação do HIV. *plantas são um meio comerciável viável, de baixo custo e de produção em larga-escala
 Questões sociais, ambientais e econômicas
Desvantagens dos Transgênicos orgânicos
Pode matar populações benéficas como abelhas, minhocas e outros animais e espécies de plantas;
Aumento da resistência aos pesticidas, o que gera maior consumo deste tipo de produto;
Morte de fauna pela introdução de genes nocivos;
Desaparecimento de espécies nativas menos resistentes;
Pode ser mais lucrativo plantar não transgênicos (orgânico) pela melhor aceitação no mercado
Vantagens dos Transgênicos
Produtos transgênicos são mais produtivos, necessitando de uma menor área cultivada, diminuindo a degradação do solo;
Reduzem a necessidade de agrotóxicos;
Maior durabilidade na estocagem e armazenamento;
Mais nutritivos podendo combater carências nutricionais; 
Estudos demonstram que os produtos transgênicos não são tão diferentes dos produtos naturais quanto à ocorrência de alergias;
Quanto à diminuição de biodiversidade: banco genético;
 Benefícios dos Transgênicospara a Agropecuária e a Sociedade em Geral
Produtor: aumento da produtividade
Consumidor: aperfeiçoamento nutricional
Meio ambiente: redução do uso de agrotóxicos e da necessidade de se devastar novas áreas de matas nativas para o cultivo
 Possíveis Riscos à Saúde Humana e Animal
Transferência horizontal entre bactérias - possibilidade de disseminação de genes de resistência a antibióticos
Aumento de resíduos tóxicos nos alimentos
Reações adversas dos alimentos OGMs
Reações alérgicas ou de hipersensibilidade
Reações de intolerância – alterações fisiológicas, como reações metabólicas anormais e toxicidade
-alimentos que contêm proteínas alergênicas: soja, amendoim, amêndoas, leite, ovos, mariscos, peixe, trigo, entre outros.
-efeitos pleiotrópicos e epistáticos desconhecidos dos transgenes – riscos potenciais não conhecidos
Potencial alergênico. Ex: Feijão transgênico – gene da castanha-do-pará ao ser testado nos EUA causou reações alérgicas em algumas pessoas
*Alimentos desenvolvidos pela biotecnologia (geneticamente modificado e/ou transgênico) só são liberado para o consumo depois de passar por todos os testes de avaliação de segurança.
*Transgênicos passam por testes mais rigorosos que aqueles aplicados à outros alimentos.
 Possíveis Impactos no Meio Ambiente
Aumento de resíduos tóxicos
Poluição ambiental
Poluição genética ou contaminação gênica de espécies silvestres: escape genes do ambiente agrícola que vão para o ambiente natural
Fluxo gênico: transgene → população silvestre
Depende de vários fatores:
- compatibilidade sexual
- desenvolvimento em um mesmo ambiente
- período de florescimento em comum
- transporte do pólen de uma população para outra
 Riscos Animais Transgênicos: cruzamento entre transgênicos e silvestres
Deve haver contenção: Introdução de animais estéreis; Isolamento geográfico; Contenção física
Conclusões:
- Determinar os protocolos experimentais para a avaliação de riscos;
- Avaliar, caso a caso, a existência de riscos sobre a saúde humana, animal e ao meio ambiente;
-Divulgar os resultados técnico-científicos para esclarecimentos da população;
- Incrementar a pesquisa na área de riscos ambientais e a saúde animal e vegetal;
- Produtos com mais de 1% de matéria-prima transgênica, devem ter um rótulo específico, que contenha o símbolo e em destaque “produto transgênico” ou “contém (matéria prima) transgênica”.
- Produtos que tenham sido fabricados a partir de transgênicos, mesmo que não contenham o DNA transgênico em sua composição final devem trazer a frase “fabricado a partir de (produto) transgênico” em seu rótulo 
DNA pode ser destruído no processo de fabricação, o que inviabiliza a detecção do gene transgênico. ex: óleos e margarinas.
Biologia Sintética
Biologia + Engenharia => Biotecnologia
Inicialmente desenvolvida para a criação de biocombustíveis 
Criação de sistemas biológicos para fins específicos: reprogramação de redes gênicas
Possíveis aplicações da biologia sintética:
Energia: microrganismos construídos para produzir hidrogênio e outros combustíveis ou capazes de fazer fotossíntese artificial 
Medicina: produção de medicamentos, vacinas, agentes de diagnóstico, proteínas personalizadas e a produção de novos tecidos
Ambiente: detecção de poluentes e a sua degradação ou remoção do ambiente
Indústria química: produção de compostos de química fina, incluindo proteínas capazes de constituir uma alternativa às fibras naturais ou às fibras sintéticas existentes
Agricultura: novos aditivos alimentares
Técnicas de Mapeamento
	
Identificação da posição de um gene no cromossomo. Um mapa cromossômico é a representação de marcadores de maneira ordenada em um determinado cromossomo/genoma. A representação desta ordem deve conter as distâncias entre os marcadores vizinhos
Aplicações:
- Localizar genes responsáveis por características comercialmente importantes
- Localizar genes associados a doenças
- Procurar genes que sirvam como modelo de estudo dos efeitos de doenças genéticas humanas
- Entender a organização do genoma
- Estudar mecanismos de rearranjos cromossômicos que acompanharam a evolução dos mamíferos (Mapeamento Comparativo)
Os mapas genômicos podem ser:
Genético. Ex: de ligação;
Físico. Ex: sintenia, citogenético ou RH;
Moleculares: SNP ou sequência.
 Mapa Citogenético
- Os marcadores têm suas posições localizadas visualmente nos cromossomos (bandas/sub-bandas)
- Mapas citogenéticos tradicionais utilizam sondas marcadas hibridizadas com preparações cromossômicas;
- FISH (cromossomos metafásicos)
- Ordenamento limitado >1-2 Mb
- Inadequado para mapeamento de alta densidade
Os mapas citogenéticos são construídos por meio da técnica de HIBRIDIZAÇÃO IN. Utiliza-se sequências de DNA (sondas) complementares aos genes-alvo para hibridizar cromossomos metafásicos do genoma de interesse.
 Mapa genético de ligação: Fornecem a ordem dos genes em um cromossomo baseando-se na frequência de recombinantes entre os mesmos durante a meiose. É necessário ver a segregação dos alelos em uma família, é utilizado para espécies que apresentam grande número de descendentes. Além disso, é preciso que tenha polimorfismos para que se consiga mapear. É baseado na teoria da recombinação. Importante para animais e plantas de interesse econômico.
Hipótese criada para a construção do mapa: quanto menor a distância entre dois genes em um mesmo cromossomo, maior é a chance de serem herdados juntos (ligados). Análise da herança dos genes a partir dos progenitores para a prole.
Conceitos essenciais:
- 2 genes muito próximos no mesmo cromossomo não se segregam independentemente na meiose
- 1 par de cromossomos homólogos pode trocar segmentos por crossing-over
- Recombinação produz genótipos com novas combinações de alelos parentais
- Loci gênicos em um cromossomo podem ser mapeados medindo-se a frequência de recombinantes produzidos por crossing-over
- A distância de mapa entre dois marcadores é diretamente proporcional à frequência de crossing-over
- Em certas regiões dos cromossomos (centrômeros e telômeros) há supressão da recombinação
Distância genética: frequência de recombinação
- 1% = 1cM
- se a taxa de recombinação for <0.5 os marcadores podem ser considerados geneticamente ligados
- calculada utilizando 2 marcadores
Distância Genética é diferente de Distância Física
- hot-spots de recombinação
- clusters de genes (famílias gênicas)
 MAPA RH (Mapa Físico): Diferenças do mapa de ligação: a recombinação é induzida em laboratório. A análise é feita por PCR. Não precisa da constituição de famílias, nem de polimorfismos. São similares aos mapas genéticos de ligação, porém a distância entre os marcadores é dada em cR. As quebras dos cromossomos são causadas pela radiação, não pela recombinação. Mapeamento RH é uma técnica utilizada para ordenar marcadores ao longo de um cromossomo e estimar as distâncias físicas entre eles.
Processamento: Células somáticas de um organismo de interesse são irradiadas, a radiação quebra os cromossomos ao acaso em fragmentos e, ao acaso, um subconjunto de fragmentos é resgatado pela fusão das células irradiadas com células de roedor (animal diferente do animal a ser estudado). Cada clone resultante pode conter nenhum, um ou vários fragmentos cromossômicos.
Análise estatística é pela presença e ausência dos genes
Hipótese: quanto menor a distância entre dois genes em um mesmo cromossomo, maior é a chance de estarem juntos no mesmo fragmento
Principal vantagem: não necessita de polimorfismo e não é necessário acompanhar os heterozigotos segregando nas famílias.
Análise de um painel RH: Conceitos básicos
Analisado pela técnica de PCR: Experimentos feitos em placas de 96 poços; presença e ausência dos marcadores são avaliados, cada marcador deve ser analisado em duplicata. Os padrões de co-retenção são analisados (90 linhagens): utilizados para a ordenação dos marcadores e estimar a distânciaConstrução de um mapa de RH
Marcadores vizinhos: provavelmente não serão separados pelas quebras no cromossomo. Serão retidos ou perdidos juntos em um único fragmento (ligados)
Marcadores distantes: provavelmente serão separados por uma quebra. Serão retidos ou perdidos independente um do outro (não ligados)
Alta resolução
As distâncias do mapa RH são mais proporcionais às distâncias físicas do que nos mapas de ligação
A quebra do cromossomo é ao acaso, sem “hot spots”, interferência ou diferenças ligadas ao sexo
Mapas RH são a ponte entre os mapas de ligação e os mapas “contigs” (mapas de sequências): úteis em projetos de sequenciamento de genoma (alinhamento e ordenação das sequências geradas)
Mapas RHs são úteis para:
Construir mapas de alta resolução de regiões de QTL, visando obter genes candidatos (uma vez que todos os tipos de marcadores podem ser adicionados)
Determinar ordens incertas ou desconhecidas de marcadores
Corroborar os mapas existentes
Excluir ou incluir genes candidatos vizinhos
Estimar a distância física de uma região de interesse 
 Mapa de Sequência
Contigs ordenados e Sequenciados são mapas físicos com máxima resolução
Bibliotecas com insertos grandes: BACs ~600 Kb
Bibliotecas com insertos pequenos: Plasmídios / Cosmidios 4-45 Kb
 Mapa Comparativo
	Utilizado para comparar o mapa de uma espécie com o de outra. É necessário ter os mesmos genes mapeados nas espécies comparadas.
A construção de diferentes mapas permite integração destes, gerando um conhecimento mais aprofundado sobre os genes, sua localização, organização e funcionamento
	Aplicação:
Estudos de características economicamente importantes
Identificação de regiões de QTL
Manipulação genes para obtenção de fenótipos desejáveis
Importância dos Mapas Genômicos: Identificação de genes relacionados com:
ETLs (características de importância econômica)
QTLs (características quantitativas)
Doenças