Biologia Molecular

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Biologia Molecular
Experimentos: 
Griffths: princípio transformante
Chase & Hershey: presença de fósforo, através de experimento com bacteriófago (32P e 35S), corrobora com a teoria de que o DNA é o material genético. 
A experiência de Griffths foi importante por demonstrar a capacidade de transformação de um tipo de bactéria pneumococcus em outro. Já os experimentos de Avery, MacLeod e MacCarty indicaram que o princípio transformante era o DNA. Contudo, a comprovação do DNA como material genético só foi possível com o trabalho de Hershey e Chase, que envolveu o uso de material marcado radioativamente.
O DNA (Ácido Desoxirribonucleico) é um heteropolímero constituído por duas fitas de nucleotídeos unidas em dupla hélice helicoidal por pontes de hidrogênio entras as bases destes nucleotídeos. Estes, por sua vez, são compostos por um grupo fosfato, um açúcar (de cinco carbonos, com um hidrogênio 2’, diferindo da ribose, que possui uma hidroxila 2’) e uma base nitrogenada, que pode se Adenina, Citosina, Guanina ou Timina. 
A e G são as purinas, com estrutura em dois anéis, e G e T as pirimidinas, cuja a estrutura é em um anel. 
As bases só podem parear se as fitas estiverem em posição antiparalela (orientadas em polaridades opostas). Na fita, os nucleotídeos são ligados covalentemente por ligações fosfodiéster que conecta o carbono 5’ de uma desoxirribose ao carbono 3’ do açúcar adjacente, através de uma reação de condensação, onde o nucleotídeo-trifosfato é incorporado a outro com perda de H2O e pirofosfato inorgânico. O fato de os anéis aromáticos que incorporam o Nitrogênio serem planos, permite o empilhamento dos anéis. Vale lembrar que o nitrogênio confere um caráter básico fraco ao anel. 
O grupamento fosfato (alfa) liga-se à desoxirribose pelo C5’, através de ligação fosfoéster, enquanto os outros dois (beta e gama) ligam-se por ligações fosfoanídricas. Na ausência de fosfato, a molécula é caracterizada como nucleosídeo (desoxirribose+base nitrogenada). Neste caso, o nome será terminado em –osina ou –idina. 
Já as bases nitrogenadas estão ligadas, por ligação N-glicosídica, à ribose, pelo carbono C1’. 
A molécula de DNA possui três principais formas: 
A: em que o filamento encontra-se desidratado 
B: em que o filamento encontra-se normal (natural, com moléculas de água)
Z: em que o filamento encontra-se estendido (porque a direção do enrolamento é para a esquerda) 
A estabilidade da molécula de DNA é favorecida por uma série de fatores. As pontes de hidrogênio, mesmo sendo fracas, são importantes neste fato, por existirem muitos pares de base, e consequentemente, muitas interações deste tipo. A disposição planar dos anéis aromáticos também é importante na estabilidade da molécula, por permitir o “empilhamento” das bases. 
A evolução encarregou-se de “retirar” as uracilas do DNA, uma vez que estas assemelham-se à citosinas quanto a estrutura (uma pode ser convertida na outra enzimaticamente). Se o DNA tivesse U, estas poderiam ser convertidas em C, caracterizando mutações. 
Replicação
Evento semiconservativa (experimento de Menselson & Sthal), que pode assumir caráter bidirecional ou unidirecional (varia entre as espécies), contínuo ou descontínuo, envolvendo dezenas de enzimas, e em três etapas: iniciação, síntese (ou prolongamento) e término. O DNA só se replica um vez a cada ciclo celular, na fase S. 
O ponto no qual cada replicação é formada chama-se forquilha de replicação. A origem de replicação (ORI) em eucariotos não possui um ponto definido, ocorrendo várias origens ao longo do filamento. Já os procariotos possuem um origem de replicação (oriC) e esta só corre quando as condições do meio e internas estão favoráveis. A replicação se inicia com a formação de um Complexo de Reconhecimento de Origem (ORC) de replicação, que em eucariotos é ORC1 ou ORC6, e em procariotos é o complexo DnaA (que irá reconhecer os boxes R1-R4 e DUE). Após isso, há a formação de outro complexo, mas desta vez pré-replicação (preRC), levando à formação de um terceiro complexo, o preIC (replissomo). 
Enzimas do replissomo:
A enzima responsável por unir os monômeros, formando o polímero de DNA, é chamada de DNA polimerase. As células possuem uma variedade de DNA polimerases, porém, somente algumas participam no processo de replicação, sendo, então, denominadas, replicases. A DNA polimerase só é capaz de adicionar um novo monômero se houver uma hidroxila livre 3’ livre. Esta apresenta atividade exonuclásica 5’-3’ e atividade exonucleásica 3’-5’, além da atividade polimerase 5’-3’. PCNA é um antígeno do núcleo celular em proliferação é uma molécula que coordena a replicação, ligado à DNA polimerase. 
A Helicase atua rompendo as pontes de hidrogênio através da hidrolise de ATP como energia. 
As proteínas SSB impedem que as fitas recém abertas, fechem novamente. A topoisomerase (girasse) possibilita a replicação, distorcendo a dupla fita e diminuindo a tensão. 
Na fita antiparalela, a replicação ocorre de modo retardatário, com a formação de fragmentos de Okazaki. A Primase introduz segmentos de RNA (primers) de onde a DNA polimerase iniciará a adição de nucleotídeos. 
A DNA polimerase não consegue replicar o segmento terminal da fita retardatária de cromossomos lineares. No final das fitas que serão replicadas de modo descontínuo (em ambos os telômeros haverá uma) não haverá fita molde de DNA para permitir a ligação com um novo primer depois que o último fragmento de Okazaki tiver o primer de RNA removido. Essa região final (correspondente ao último primer) não terá como ser replicada a menos que uma enzima especial, denominada telomerase esteja presente. 
 A replicação dos telômeros é facilitada pelo tipo de sequência de nucleotídeos presente nessa região cromossômica. Os telômeros dos cromossomos humanos são constituídos de repetições de um conjunto de 6 nucleotídeos (sequência TTAGGG) e a telomerase reconhece a extremidade dessa sequência, estabelece ligação com o DNA e estende a fita molde na direção de 5'para 3’, acrescentando uma nova repetição TTAGGG de cada vez. 
 A telomerase é uma enzima com uma característica única: possui no seu interior uma fita de RNA, que serve de molde para a extensão dos telômeros. De certo modo essa enzima faz uma "transcrição reversa" pois a partir do molde de RNA constrói um novo segmento de DNA na extremidade do cromossomo. 
 Sem atividade da telomerase, os cromossomos tornam-se menores, a cada ciclo de 
replicação, por perda de parte da região telomérica. Com o tempo os telômeros são totalmente perdidos e as deleções passam a ocorrer sobre regiões codificantes. Esse encurtamento progressivo dos cromossomos é considerado um dos fatores que limita ou impossibilita a divisão celular contínua e está associado provavelmente ao processo normal de envelhecimento (de células, tecidos e consequentemente do organismo como um todo).
A replicação pode ser bloqueada quando há degradação do Cdt1 entre a fase S e a M. O Cdt1 é um componente do complexo ORC em eucariotos. Quando este encontra-se ligado a uma proteína nuclear geminin, está impossibilitado de formar o ORC, não havendo prosseguimento do ciclo; somente há quando a geminin é ubiquitinada e degradada via proteassomo. 
Em DNAs circulares, há um complicação ao término. Deve haver uma enzima, a topoisomerase IV, que romperá a fita, liberando as duas (“desconcatenização”). 
Organização da cromatina: o DNA encontra-se enrolado em octâmeros proteicos, as histonas. A metilação e ubiquitinação destas acontece pela atividade do complexo Polycomb (que por sua vez é reprimido pelo complexo PCR). Já a acetilação destas é feitas por HAT (histonas acetil-transferase) e desacetilação por HDAC (histona desacetilases). Vale lembrar que a desacetilação inibe a transcrição, porque com a acetilação, a cromatina se descompacta, permitindo tais processos. Se metilada, a cromatina se compactará, se acetilada, o inverso ocorrerá. 
Gene
Genes são sequencias específicas de ácidos nucleicos: unidade fundamentalda hereditariedade. Um gene é uma união de sequências genômicas que codificam um conjunto coerente de produtos funcionais potencialmente sobrepostos. Um segmento gênico é formado por uma região promotora, um sítio RBS (sítio de ligação do ribossomo), um códon de iniciação da síntese proteica (ATG), o gene propriamente dito que originará um proteína (CDS ou ORF), um códon de parada, e uma sequência que dará termino a síntese proteica. 
Transcrição 
A transcrição é mediada por uma RNA polimerase na direção 5’ -3’. A RNA polimerase liga-se ao promotor, inicia-se a transcrição, que só termina quando a enzima encontra a sequência de terminação. Composta por subunidades (α2ββ’σ):
Beta: Contém o sítio ativo da polimerase
Beta’: ligação ao DNA
Alfa: papel estrutural, ligando as subunidades
Sigma: direciona a enzima para sítios específicos, sendo requerido na ligação da enzima ao promotor. 
A terminação da transcrição pode ser direta, com a formação de grampos por regiões auto complementares do RNA, ou mediada por Rho (como em E. coli), que possibilita o desenovelamento da estrutura recém formada de RNA. 
Para a RNA pol II a TATAAA box é um promotor consensual 
RNA 
Pode assumir várias formas estruturais. Os RNA eucarióticos (transcritos primários) são interrompidos (introns- não codificadores) e possuem modificações pós-transcricionais (splicing – feito pelo spliciossomo). Após a transcrição, a extremidade 3 é clivada e 80 a 250 resíduos de adenilato são adicionados para criar uma cauda poliA, enquanto na extremidade 5’ é adicionada uma estrutura chamada CAP. 
Operon 
Em seu ambiente natural, o operon lac permite às bactérias uma digestão eficiente da lactose. A célula pode utilizar lactose como uma fonte de energia ao produzir a enzima β-galactosidase, codificada pelo gene lacZ, que digere lactose em glicose e galactose. Além desta enzima, a permease codificada pelo gene lacY permite a captação de lactose do meio extracelular. Seria ineficiente produzir enzimas quando não há lactose disponível, ou se houvesse no meio uma fonte de energia de mais fácil digestão, como glicose. O operonlac utiliza um mecanismo de controle duplo para assegurar que a célula produza as enzimas somente quando haja lactose no meio. Isso é conseguido com orepressor lac, que paralisa a produção de enzimas na ausência de lactose, e com a proteína ativadora catabólica (CAP), que auxilia na produção no caso de ausência de glicose no meio. Esse controle duplo faz com que a glicose seja metabolizada pelas bactérias antes que a lactose, o que se conhece pelo nome dediauxia. 
Os três genes estruturais são lacZ, lacY, e lacA:
lacZ codifica a β-galactosidase, uma enzima intracelular que degrada o dissacarídeo lactose em glicose e galactose.
LacY codifica a permease de β-galactosídeos, uma permease de membrana plasmática que bombeia a lactose para dentro da célula.
LacA codifica a transacetilase de β-galactosídeos, uma enzima que transfere um grupo acetil de acetil-CoA a beta-galactosídeos.
Operon trp 
O operon trp possui 5 enzimas capazes de transformar corismato em triptofano. Como bactérias são seres procariontes (sem a membrana nuclear), a tradução começa antes do término da transcrição. O RNAm do trp é rapidamente sintetizado e seu tempo de vida é curto após ter sido totalmente transcrito, respondendo à variações do meio quanto a concentração de trp quase que imediatamente.
Isto é possivel porque o repressor trp, um dímero com 107 aminoácidos, é codificado pelo gene trp que está longe do operon trp. Somente quando o repressor está ligado ao triptofano torna-se capaz de se ligar fortemente ao operador, que possui simetria bilateral.
O operador se superpõe ao promotor para o início de transcrição, ou seja, o repressor, que está ligado ao operador, impede alostericamente que a RNA polimerase se ligue eficientemente ao promotor trp impedindo a transcrição.
O repressor possui uma estrutura dimérica onde cada dímero possui 3 domínios: Um central amino terminal e duas cabeças flexíveis para leitura de DNA (carboxi- terminal). O tema hélice-alça-hélice volta a estar presente em cada subunidade.
É interessante que o repressor sem o trp é incapaz de se ligar ao DNA pois sua região de ligação está separada de 26A, mas quando o trp se liga, ele é capaz de aumentar em 8A a abertura possibilitando a ligação do complexo a 2 sulcos maiores adjacentes no DNA, além de ajudar na estabilização da estrutura.
Fatores de transcrição: estrutura em zíperes de leucina ou dedos de zinco