Efeito do Ambiente no Crescimento e na Atividade Microbiana

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Efeito do Ambiente no Crescimento e na Atividade Microbiana
Todos os micro-organismos são unicelulares, logo sofrem um efeito maior do ambiente onde está. Ele responde diretamente às variações de temperatura, pH, pressão osmótica. Dessa forma, os micro-organismos foram selecionados para determinados nichos específicos. Assim, as características físico-químicas do meio exerceu essa pressão seletiva de forma a agrupar os micro-organismos de acordo com: filogenia, morfologia e influência das condições sobre a célula em função da resposta do ambiente. Os fatores físicos incluem a temperatura, pH e pressão osmótica. Os fatores químicos incluem fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, fósforo, oxigênio, etc. 
 
Definição dos grupos de micro-organismos quanto à presença de O2: Micro-organismos que utilizam o oxigênio molecular (aeróbios) produzem mais energia a partir de nutrientes que os micro-organismos que não utilizam o oxigênio (anaeróbios).
Aeróbios obrigatórios: Micro-organismos que utilizam o oxigênio molecular para sobreviver. 
ATP geração de ATP O2 – respiração aeróbia
Tem um doador de elétrons, que doa para a enzima de oxirredução. A enzima também doa e depois se reduz, faz com que o próton saia, gerando um potencial de membrana. É aeróbia, pois o último aceptor vai formar água. 
Em bactérias, tudo ocorre na membrana. Se a respiração é aeróbia, há uma cadeia de citocromos que é chamada de C-C-C (enzima de oxidorredução que é capaz de receber elétrons). O NAD reduzido é um doador de elétrons e a crista da mitocôndria doa para o citocromo, que ao receber, se reduz e tem tendência de doar esse elétron. O elétron vai passando de um citocromo para o outro, até ser recebido pelo oxigênio e gerar água. Isso acontece para gerar um potencial de membrana. O elétron tem carga negativa e à medida que passa joga carga para fora. Uma face da membrana terá carga negativa e a outra positiva (fora), gerando o potencial elétrico que aumenta a diferença de carga. Ao chegar ao seu potencial, há um complexo proteico chamado ATP sintase que usa energia potencial para fazer a ligação do ATP. A energia elétrica vai ser transformada em energia química. Na ATP sintase tem proteína receptora de próton que joga próton para dentro e quebra a energia. A ATP sintase capta essa energia e usa para fazer ligação de ATP. Nos aeróbios estritos, só faz isso se o aceptor for o oxigênio – Reação de oxidorredução.
Anaeróbios facultativos: Capacidade de continuar a crescer sem a presença de oxigênio. Podem utilizam o oxigênio quando ele está presente, mas são capazes de continuar a crescer utilizando a fermentação ou a respiração anaeróbia.
Anaeróbios obrigatórios: Incapazes de usar o oxigênio para produzir energia. 
Anaeróbios aerotolerantes: Não crescem na presença de O2, mas o toleram relativamente bem. Possuem um sistema que neutraliza as formas tóxicas do oxigênio. 
Adaptações para reduzir o efeito tóxico do oxigênio
Catalase: 2H2O2 2H2O + O2
O peróxido de hidrogênio produzido na reção contém o ânion peróxido, que também é tóxico. Os micro-organismos desenvolveram enzimas para a neutralização desse ânion, sendo a mais comum a catalse (converte o peróxido de hidrogênio em água e oxigênio). 
Peroxidase: H2O2 + 2H+ 2H2O 
Quebra o peróxido de hidrogênio, mas não produz oxigênio (diferentemente da catalase).
Superóxido dismutase (SOD): O2- + O2- 2H2O2 + O2
Formados em pequenas quantidades durante a respiração normal dos organismos que utilizam o oxigênio como aceptor final de elétrons, produzindo água. Na presença de oxigênio, os anaeróbios obrigatórios parecem formar radicais superóxidos, que são tóxicos para os componentes celulares que todos os organismos tentando crescer no oxigênio atmosférico devem produzir uma enzima – a superóxido-dismutase (SOD) para neutralizar esses radicais. Sua toxidade é causada pela sua grande instabilidade. Os aeróbios, os anaeróbios facultativos crescendo aerobicamente e os anaeróbicos aerotolerantes produzem SOD, com a qual eles convertem o radical superóxido em oxigênio molecular e peróxido de hidrogênio.
Classificação dos micro-organismos com relação ao pH ótimo de crescimento
- Acidófilos: Crescem em pH abaixo de 4,0.
- Neutrófilos: Crescem em pH entre 5,5 e 7,5.
- Alcalófilos: Crescem em pH acima de 7,5.
- Alcalino-tolerante: Cresce em pH 7,0 até no máximo 9,0.
- Alcalofílico: pH ótimo de 10-12.
- Alcalofílico extremo facultativo: Cresce em pH 7,0, mas seu ótimo é maior que 10. 
- Alcalofílico obrigatório: Não cresce a 7,0 e o pH mínimo é 10,0.
- Alcali-tolerante: O máximo para crescimento seria pH 7,0, porém consegue tolerar até pH 8,0.
As bactérias tem capacidade de variar o máximo e o mínimo o pH interno. São variações que conseguem suportar. 
Formas de controle do pH interno
Funciona para neutralizar o pH quando se tem uma pequena alteração, sendo necessário manter o pH interno. Ela vai crescer menos, pois terá que gastar energia para manter o pH. Vai desviar vias metabólicas ou gastar ATP, tendo menos energia para se dividir. 
- Produção de compostos tamponantes (ex: aminoácidos)
- Produção de H+ ou OH
- Transporte ativo de H+ ou OH
Classificação dos micro-organismos com relação à temperatura ótima
A temperatura mínima de crescimento é a menor temperatura na qual uma bactéria pode crescer. A temperatura ótima de crescimento é a temperatura na qual a espécie pode crescer. A temperatura máxima de crescimento é a maior temperatura na qual uma espécie pode crescer. 
- Psicrofílicos: Crescem em baixas temperaturas. <15°C (cresce entre 0° e 15°) – sua proteína exige uma temperatura de ativação baixa e a membrana também. 
- Mesofílicos: Crescem em temperaturas moderadas. 20-40°C. pH ótimo 37°C.
- Termofílicos: Crescem em altas temperaturas. 
- Termofílicos moderados – 45-80°C. pH ótimo 60°C.
- Termofílicos extremos: 60-80°C. pH ótimo 88°C.
- Hipertermofílicos: 80-113°C. pH ótimo 106°C.
Ao aumentar a temperatura, a velocidade começa a aumentar, pois na temperatura baixa a atividade enzimática está abaixo do ótimo e dessa forma não irá crescer. À medida que fornece energia de ativação, vai moldando o sítio catalítico de acordo com os agrupamentos que ela vai reagir. Abaixo do mínimo, não tem mais energia de ativação suficiente. Outra coisa é o substrato que vem do meio. Para sair de fora para dentro, precisa do transporte de membrana, o qual tem que ter uma fluidez adequada. Abaixo do mínimo, não tem transporte de membrana, pois ela está muito densa. Nessa região, tem fluidez inadequada de membrana e baixa atividade enzimática. Quando a temperatura aumenta, acelera o transporte de membrana e tem energia para atividade enzimática. Depois de a proteína atingir seu ótimo, ela desnatura, perde sua forma ativa e tem o colapso de membrana e a célula morre. 
Adaptações da membrana de bactéria à termofilia
Os ácidos graxos fazem diferença ao tipo de tolerância à temperatura que a bactéria vai ter. 
C – C – C – C = O
	OH
O óleo tem insaturações e é mais fluido a temperatura ambiente. A gordura é saturada, apresentando apenas ligações simples e características mais sólidas. 
Quanto mais baixa a temperatura de crescimento, mais instauração vai ter, apresentando uma fluidez adequada. As insaturações permitem que a membrana funcione bem em temperatura mais baixa. As que crescem em temperatura mais alta, precisa de temperatura mais alta para atingir sua fluidez adequada para o sistema de transporte. As que crescem em temperatura acima de 60°C, não apresentam o agrupamento carboxila. 
C – C – C – C – CH3
Adaptação das membranas de Archaea à termofilia
Quando a membrana é formada por hidrocarbonetos sem grupo hidroxila, reage com glicerol e sai molécula de água, formando a ligação éter, que é termoestável. Para desorganizar isso é mais difícil, pois precisa de maior temperatura para permanecer integra. Para aumentar a termoestabilidade, a bactéria tem ligação continuada, isso faz com que a membranatolere temperatura acima de 80°C. 
A maior parte dos modelos de membrana é formada por duas camadas. Em temperatura maior que 65°, os ácidos graxos com suas saturações não tolera. Assim, as bactérias que crescem em temperatura alta tem cadeia única e mais longa de hidrocarboneto, e ao invés de duas, faz ligações éter com glicerol, dando uma maior estabilidade – monocamada. 
Efeitos da temperatura sobre as enzimas
- Estrutura primária
- Estrutura secundária
- α-hélice
- Configuração folha β
- Pontes de hidrogênio
- Pontes dissulfeto
- Interações hidrofóbicas
- Forças de Van der Walls
O fator de termotolerância e de termoestabilidade de uma proteína está nos pontos de interação. Quanto mais enovelada, mais resistente ela é. 
Na estrutura terciária: A proteína se enovela na estrutura terciária. Quanto mais enovelada ela for, maior ponto de contato e mais estável será a proteína. Com a temperatura modificando sua conformação, ela vai perdendo sua estrutura terciária. Quanto mais estiver interagindo por ligações, mais resistente será, precisando de maior temperatura para quebrar os pontos de interação. 
Empacotamento da molécula
- Composição de aminoácidos
- Pontes dissulfeto
- Ponte de hidrogênio
- Pareamento de íons
- Redução da entropia – aumento de prolina e diminuição glicina
- Estabilização da hélice
- Encurtamento de terminações C e N 
- Interações hidrofóbicas e aromáticas
Essas características dão a termoestabilidade
Estabilização do DNA em termofílicos
- Hipertermofílicos (Archeae): 2,3-difosfocíclico de potássio – evita a despurinização
DNA ligase reversa: Induz superenovelamento positivo no DNA, que é mais resistente que o convencional (enovelamento negativo).
 Proteínas especiais: 
- Sac7d de sulfobras que se liga ao suco menor do DNA aumentando em 40ºC a termoestabilidade
- Proteínas fortemente básicas (histonas de Archaea) que formam estruturas mais termoestáveis semelhantes aos nucleossomos de eucariotos
Sequências de bases
- Altos teores de purinas, principalmente adenina
- Preferência por citosina em relação a timina em certos códons devido às ligações de hidrogênio, proporcionando mais estabilidade na interação ribossomo-tRNA.
Psicrofílicos: Adaptação da membrana, a qual é formada por ácidos graxos, insaturações, ligações ésteres. Adaptação das proteínas e enzimas. 
As proteínas requerem baixa energia de ativação, pois são proteínas flexíveis. 
Efeito da atividade de água sobre os micro-organismos (aw)
- Halofílicos: bactérias que crescem em ambientes com baixa atividade de água, quando ela está em interação iônica – cátions e ânions. 
- Osmofílicos: bactérias que crescem em ambientes com baixa atividade de água, porém a interação é molecular.
- Xerofílicos: vivem em ambientes com baixa umidade, logo baixa atividade de água.
A quantidade de água livre no meio define se aquela bactéria vai crescer no meio ou não. 
Atividade de água = água livre no sistema (aw 0-1)
Aw = pw/(pw+ps)
Pw = pressão de vapor da água pura
Ps= pressão de vapor de água na solução
Pressão de vapor: pressão necessária para evitar que a água saia.
A atividade de água varia de 0 a 1em bactérias. 
Efeitos da pressão osmótica sobre os micro-organismos
Em meio com solutos equivalente a 3% NaCl, o citoplasma se desidrata. A aw tem que fornecer mais calor para ela evaporar. 
Há dois mecanismos distintos. Quando aumenta a concentração do meio interno, a água tende a sair. Para não desidratar, os canais de água são fechados, porém, ao abrir, desidrata. Para sobreviver precisa de uma adaptação fisiológica: cria solutos, metaboliza uma série de substâncias, a concentração dentro e fora é igual e a água fica em equilíbrio. Ao aumentar a concentração interna, diminui a água livre e compromete as enzimas. As bactérias só sobrevivem se tiver uma enzima adaptada que catalisa em baixa atividade em água livre.
Adaptações à halofilia: acúmulo de solutos
- Bactérias: aminoácidos
- Cianobactérias de água doce: sacarose e trealose
- Cianobactérias marinhas: glucosilglicerol
- Bactéria fototrófica anoxigênica: glicina, acetoina, trealose
- Archaea halofílica extrema: KCl (tira potássio do anel e suas enzimas e catalisa em baixa atividade de água livre).
Bactérias – cultivo, reprodução e crescimento
Fatores físicos e químicos que afetam o crescimento
- Temperatura, oxigênio, pH, água livre
Crescimento microbiano
- Fissão binária: Reprodução assexuada. A velocidade máxima de crescimento – menor tempo possível entre terminar uma divisão e começar a outra. 
Algumas espécies podem se reproduzir por brotamento (formam uma pequena região inicial de crescimento, que vai se alargando até atingir um tamanho similar ao da célula parental, e então se separam dela).
DNA Replicação do DNA Formação do septo Separação das células
Como faz o alongamento?
Primeiramente, o DNA é duplicado. O DNA é ligado à proteína específica e duplica a fita do DNA, separando antes de fazer o septo. A parede começa a quebrar em vários pontos, hidrolisa a parede e a membrana empurra a parte quebrada fazendo pedaços adicionais dessa parede. Com isso, essa célula estica, originando duas células exatamente iguais (fissão binária)
Na fissão binária, há o aumento exponencial (função logarítmica para bactéria). 
Fases de Crescimento: fase lag, fase log, fase estacionária e a fase de morte celular. 
- Fase lag: O número de células muda pouco, pois não se reproduzem imediatamente em um novo meio. As células não estão dormentes. A população microbiana passa por um período de intensa atividade metabólica, envolvendo principalmente a síntese de enzimas e várias moléculas. 
- Fase log: Células começam a se dividir e entram em um período de crescimento (aumento logarítmico). A reprodução celular é mais ativa nesse período, e o tempo de geração atinge um valor constante. É o momento de maior produtividade metabólica.
- Fase estacionária: Velocidade de reprodução se reduz, o número de mortes microbianas é equivalente ao número de células novas e a população se estabiliza. 
- Fase de morte celular: Número de mortes ultrapassa o número de células novas e a população entra na fase de declínio. 
Medidas de crescimento microbiano
A. Contagem total
B. Contagem de células viáveis: Mede a capacidade de reprodução das células
C. Peso seco
D. Turbidimetria (T)
E. Atividade metabólica
Semeadura da cultura em meio sólido: Cada colônia tem um bilhão de bactérias, originadas de uma única célula. A colônia é o conjunto de células.