Manual de aulas práticas MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS.

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Centro Universitário Estácio do Ceará
Curso de Nutrição
MANUAL DE AULAS PRÁTICAS 
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
Fortaleza-CE
Junho/2016
CENTRO UNIVESRITÁRIO ESTÁCIO DO CEARÁ
CURSO DE NUTRIÇÃO
MANUAL DE AULAS PRÁTICAS DA DISCIPLINA MCIROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
Unidade: Via Corpvs
Rua Eliseu Uchoa Becco, 600. Bairro Água Fria
Reitora 
Profa. MSc Ana Flávia Alcântara Rocha Chaves
Pró – Retitor 
Profa. MSc. Geam Carles Mendes dos Santos
Coordenador do curso
Profa. MSc Fernando Cesar Rodrigues de Brito
Elaboração do manual
Profa. Dra. Ana Paula Colares de Andrade
Fortaleza – Ceará
Junho/2016
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Prezados alunos, 
Antes de iniciarmos nossas aulas práticas, devemos tomar alguns cuidados que no dia-a-dia nos ajudarão a desempenhar com mais facilidade as nossas tarefas no laboratório. Abaixo segue uma lista com as principais medidas que devemos adotar para que o nosso trabalho desenvolva-se da melhor maneira possível dentro do laboratório de Microbiologia de Alimentos e nos demais laboratórios que serão utilizados por vocês durante toda a vida acadêmica e profissional. 
CUIDADOS GERAIS A SEREM ADOTADOS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
	É imprescindível o uso de calças compridas e sapatos fechados; 
	É Indispensável o uso do jaleco; 
	Manter o cabelo preso para evitar acidentes;	
	Manter as unhas aparadas; 	
	Evitar se apoiar, sem necessidade, sobre as bancadas; 	
	No caso de ferimentos nas mãos não realizar a aula prática (comunicar ao professor); 
	Comunicar imediatamente ao responsável qualquer ferimento sofrido dentro do laboratório; 
	É obrigatório fazer anti-sepsia das mãos antes e após as atividades práticas; 
	Fazer a desinfecção da bancada, com álcool a 70%, antes e após as atividades práticas; 	
	Não comer ou beber dentro do laboratório; 
	Não tocar a mucosa oral, nasal ou ocular durante as atividades práticas; 
	Não pipetar com a boca, utilizando sempre pêra ou dispositivos similares; 
	Não atender telefones celulares durante as atividades práticas;
	Ao derramar culturas bacterianas cobrir a área com papel toalha e colocar desinfetante; 	
	Ao derramar líquidos, cuidado com comprometimento da rede elétrica (risco de choque elétrico);
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Aula prática nº 1
Preparação de material de laboratório para análises microbiológicas
Preparo de meio de cultura
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Aula prática nº 1
Preparação de material de laboratório para análises microbiológicas 
Preparo de meio de cultura
Fundamento
A preparação do material de laboratório para utilização em análises microbiológicas envolve todas as atividades necessárias para garantir que os frascos, utensílios, instrumentos e vidraria, destinados ao contato com as amostras de alimentos, encontrem-se totalmente limpos, estéreis e isentos de resíduos químicos e orgânicos, no momento das análises. 
A escolha do meio de cultura é uma etapa muito importante no processo de identificação de qualquer micro-organismos em uma amostra. O meio de cultura pode ser escolhido, basicamente, segundo o tipo de amostra ou agente etiológico pressupostamente presente na mesma. Há a possibilidade de, a partir de aspectos observados ao exame microscópico da amostra, não ser possível a identificação, nesses casos há necessidade de realização de cultivo, seguido de nova observação microscópica. Nesse contexto, deve-se escolher o meio mais adequado para que seja possível confirmar a identificação do agente
O objetivo dessa aula é preparar o material que será utilizado nas aulas práticas e os meios de cultura que serão utilizados durante o semestre.
Materiais 
Pipetas	
Tubos de ensaio
Erlenmeyer	
Algodão
Álcool 70%
Placas de petri	
Estufa
Balança	
Espátula
Álcool	
Bastão de vidro
Proveta	
Béquer
Meios de cultura: os que serão utilizados ao longo do semestre.
Metodologia
Acondicionamento dos frascos e utensílios vazios
Placas de petri: devem ser acondicionadas em estojos porta-placas de alumínio ou aço inoxidável, em grupos de mesma dimensão ou embrulhadas em papel Kraft, em grupos de até cinco dez placas.
Pipetas: preencher o bocal com algodão e acondicionar em estojos porta-pipetas de alumínio ou aço – inoxidável, em grupos de mesma capacidade, com as pontas para baixo, na extremidade oposta à da tampa do estojo. Proteger o fundo dos estojos com um chumaço de algodão, para evitar danos às pontas das pipetas. Alternativamente, embrulhar individualmente em papel Kraft, lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da análise.
Tubos de ensaio vazios: tampar com tampão de algodão ou com as respectivas tampas, no caso de tubos rosqueáveis. Acondicionar em grupos, em cestas apropriadas para esse fim, lembrando-se de afrouxar as tampas dos tubos de rosca. Cobrir a parte superior dos tubos com papel Kraft e amarrar com barbante ou liga.
Frascos de homogeneização e outros frascos vazios tampados com tampão de algodão. Cobrir a tampa ou o tampão com papel Kraft e amarrar com barbante ou liga, individualmente.
Espátulas, pinças, tesouras e demais utensílios. Embrulhar individualmente em papel Kraft, lembrando-se de identificar a extremidade do embrulho que deve ser aberta no momento da análise.
Preparo de meio de cultura
- Preparar X ml do meio líquido, em um béquer, da seguinte maneira  
Pese:  
caldo ........................Xg 
Adicione X ml de água destilada, misture com o auxilio de um bastão de vidro.
Distribua o meio de cultura em tubos de ensaio, cerca de 5 ml em cada um. 
Tampe com algodão, coloque os tubos em uma lata e cubra-a com papel. 
Esterilizar em autoclave.
- Prepare X ml de ágar bacteriológico, em um béquer, da seguinte maneira  
Pese:  
Agar bacteriológico.........X g 
Adicione X ml de água destilada e aqueça, sobre uma manta aquecedora ou micro-ondas, agitando periodicamente, até completa dissolução do ágar.  
Distribua o meio de cultura em tubos de ensaio (cerca de 5 ml em cada um).
Tampe os tubos com algodão, coloque os tubos em uma lata e cubra-a com papel. Esterilizar em autoclave.
Após a esterilização, distribua o meio de cultura em placas de petri. 
Esterilização
Todo o material de laboratório vazio pode ser esterilizado tanto em autoclave quanto em estufa de esterilização. Na esterilização em estufa, o material deve permanecer a 170 ºC / 1h e, na esterilização em autoclave, a 121º C / 15 min.
A maioria dos meios de cultura é esterilizada em autoclave, por 121 ºC / 15 min. Exceção é feita a alguns tipos de meios de cultura que são esterilizados a 115 ºC / 15 min. ou a 121º C / 10 min.
Referências
Franco, Bernadette D. G. M; Landgraf, Mariza. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo, Ed. Atheneu, 2005. p27-171. 
Silva, N; Junqueira, V. A.; Silveira, N. F. A. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. 3ª Edição. Livraria Varela.
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Aula prática nº 2
Coloração de Gram e observação em microscópio óptico
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Aula prática nº 2
Coloração de Gram e observação em microscópio óptico
Fundamento
Os métodos de coloração são muito importantes em bacteriologia, pois facilitam a visualização das bactérias ao microscópio óptico. Alguns métodos são denominados de diferenciais, isto é permitem a classificação das bactérias em “grupos”. Um método diferencial muito importante em bacteriologia é o Método de Coloração de Gram, que permite distinguir os dois principais grupos de bactérias por microscopia óptica.  Essa técnica é de fundamental importância para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo utilizada rotineiramente em laboratórios de Microbiologia. 
O objetivo dessa aula é executar o Método de Coloração de Gram. A diferenciação das bactérias neste método decorre da capacidadeda bactéria de resistir a remoção do complexo corante iodopararrosanilina por uma solução de descorante orgânico (solução de álcool etílico, solução de acetona, solução 1:1 de álcool-acetona). O complexo corante iodopararrosanilina é formado a partir da reação do corante cristal violeta com o iodo da solução de lugol utilizada como mordente do método. 
As bactérias que retêm o complexo corante (reação positiva) se apresentam coradas em roxo (cor do complexo corante cristal violeta-iodo) são chamadas de “Gram positivas”. As que não conseguem reter o complexo corante, reação negativa, se apresentam coradas em rosa (cor do Contra-Corante = safranina ou da fucsina de Ziehl-Neelsen diluída) são denominadas de “Gram negativas”.
Materiais e Método
Lâmina de vidro
Alça de semeadura
Solução salina 0,85%
Bico de Bunsem
Óleo de Imersão
Microscópio
Pipeta de Pasteur
Micro-organismo: Staphylococcus aureus
Método de Coloração de Gram
Preparo de Esfregaço Bacteriano 
1 - A Partir de Colônias Bacterianas
Retirar uma lâmina de vidro de microscopia (limpa e desengordurada) do recipiente; 
Secar com auxílio de um folha de papel toalha; 
Traçar, com um lápis de cera, uma linha transversal a cerca de 15 mm da borda da lâmina; 
Colocar 2 a 3 gotas de solução salina estéril na lâmina; 
Tocar a colônia bacteriana com uma alça de níquel-cromo estéril; 
Homogeneizar o material da alça na salina colocada da lâmina; 
Distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um “filme” tênue e homogêneo pela área disponível da lâmina (ESFREGAÇO); 
Deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente; 
Fixar o esfregaço à lâmina passando o verso desta por 3-5 vezes sobre a chama do bico de Bunsem; 
2- A Partir de Culturas em Meio Líquido
Retirar uma lâmina de vidro de microscopia (limpa e desengordurada) do recipiente; 
Secar com auxílio de um folha de papel toalha; 
Traçar, com um lápis de cera, uma linha transversal a cerca de 15 mm da borda da lâmina; 
Colocar uma ou duas “alçadas” da cultura na lâmina; 
Distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um “filme” tênue e homogêneo pela área disponível da lâmina (ESFREGAÇO); 
Deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente; 
Fixar o esfregaço à lâmina passando o verso desta por 3-5 vezes sobre a chama do bico de Bunsem; 
Coloração do Esfregaço Bacteriano pelo Método de Gram 
Cobrir o esfregaço com a Solução de Cristal Violeta por 1 minuto; 
Desprezar o corante e lavar a lâmina com água corrente (não deixar que o jato de água incida diretamente sobre o esfregaço); 
Cobrir o esfregaço com o Solução de Lugol (iodo + iodeto de potássio) por 1 minuto; 
Desprezar o mordente e lavar a lâmina com água corrente; 
Cobrir o esfregaço com o Solução Descorante por alguns segundos e desprezar; 
Lavar a lâmina com água corrente; 
Cobrir o esfregaço com a Solução de Contra-Corante (safranina ou da fucsina de Ziehl-Neelsen diluída) por 30 segundos; 
Desprezar o contra-corante e lavar a lâmina com água corrente; 
Secar a lâmina e observar ao microscópio óptico com objetiva de imersão; 
Nota: ao observar as bactérias na preparação coradas pelo método de Gram no microscópio deverão ser caracterizados: a morfologia individual da célula, a formação de agrupamentos e a reação tintorial.
Referências
Franco, Bernadette D. G. M; Landgraf, Mariza. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo, Ed. Atheneu, 2005. p27-171. 
Silva, N; Junqueira, V. A.; Silveira, N. F. A. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. 3ª Edição. Livraria Varela.
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Aula prática nº 3
Contagem de bolores e leveduras
Aula Prática nº 3 
Contagem de bolores e leveduras
Fundamento
A contagem de bolores e leveduras é uma das análises realizadas no controle de qualidade de alimentos, com o intuito de estimar a validade de determinado produto alimentício. A presença excessiva destes microrganismos resulta na deterioração ou redução da vida útil do alimento ou ainda condições precárias de manipulação.
Em alimentos, os fungos são considerados microrganismos que não oferecem risco direto à saúde, apesar de algumas espécies de bolores serem produtoras de micotoxinas julgadas prejudiciais ao homem. Com relação às leveduras, a ocorrência de espécies patogênicas em alimentos é praticamente desconhecida, sua importância reside muito mais no fato de serem eventuais agentes de deterioração (LEITÃO, 1988).
Os bolores revelaram notável capacidade de adaptação e crescimento sob condições extremamente variáveis, desta forma, qualquer produto alimentício está sujeito à deterioração pelo crescimento destes organismos, desde que haja contato com o ambiente atmosférico (LEITÃO, 1988). Os métodos tradicionais utilizados na quantificação destes microrganismos permitem contar as unidades formadoras de colônias, partindo-se do princípio de que cada célula microbiana presente em determinada amostra irá formar, quando fixada em meio sólido adequado, uma colônia visível e isolada (SILVA e JUNQUEIRA, 1995).
Os fungos por serem aeróbios, preferencialmente são inoculados na superfície do meio de cultura, podendo ser utilizado, em alguns casos, o método de plaqueamento em profundidade. Os meios de cultura, rotineiramente, utilizados em laboratório de análise de alimentos são o ágar batata dextrosado, acidificado com solução de ácido tartárico 10% para obter pH em torno de 3,5; o que inibe o crescimento de bactérias (DIFCO MANUAL, 1984) e o ágar dicloran rosa de bengala cloranfenicol, cuja presença de dicloran e rosa de bengala reduzem o diâmetro das colônias de bolores e o cloranfenicol inibe o crescimento de bactérias presentes na amostra. Após a inoculação as placas devem ser incubadas durante cinco dias para permitir o desenvolvimento das colônias (KING et al., 1979).
Essa aula tem como objetivo quantificar estes fungos e avaliar a qualidade de produtos armazenados, em virtude do potencial micotoxigênico de algumas espécies de bolores.
Materiais 
Diluente: 225 ml de água peptonada 0,1%
Tubos de diluição com 9,0 mL de água peptonada por tubo
Pipetas de 5,0 mL
Placas contendo o ágar batata dextrosado acidificado
Solução de ácido tartárico 10% estéril
Álcool 70%
Estufa incubadora a 25ºC
Alça de espalhamento (Drigalsky)
Metodologia
O esquema geral da contagem de bolores e leveduras encontra-se descrito no exemplo exposto na figura abaixo. Porém, faz-se necessário seguir as etapas que compreendem desde a coleta da amostra até o momento da análise. Estas se encontram listadas logo após a figura.
Coleta das amostras
Transporte e estocagem das amostras
Como regra geral, deve-se transportar e estocar as amostras de alimentos da mesma forma como o produto é normalmente transportado e estocado na sua comercialização
Recepção
Devem ser observadas as condições da embalagem e as condições em que foi feito o transporte, antes da análise. Deve ser recusada qualquer amostra com embalagem rasgada, furada, violada, com corpos estranhos ou qualquer outro tipo de defeito.
Preparação da amostra
Higienizar a embalagem da amostra com álcool 70%. 
Identificação do material
Com o auxílio de uma caneta identificar todo o material utilizado, com as respectivas diluições.
Retirada da unidade analítica
A unidade analítica utilizada na analise da maioria dos alimentos e de 25 g (alimentos sólidos) ou 25 mL (alimentos líquidos). Deve-se, primeiramente homogeneizar a mostra (misturando). Retiram-se assepticamente as 25 g ou 25 mL da amostra e coloca-se em 225 mL do diluente (água peptonada 0,1%). Homogeneíza-se, cuidadosamente, constituindo dessa maneira, a diluição 10-1. Para a preparação da segunda diluição (10-2), transfere-se, assepticamente, 1,0 mL da diluição 10-1 para 9,0 mL de diluente. As diluições subseqüentes são obtidas de maneira similar, transferindo-se1,0 mL da diluição anterior para 9,0 mL de diluente. O número de diluições requeridas dependerá do nível de contaminação esperado. Por exemplo, se a contagem estimada encontra-se por volta de 2500 a 25000/g de amostra, as diluições recomendadas para a contagem em placas são 10-1, 10-2 e 10-3. Caso não haja possibilidade de se estimar previamente o nível de contaminação da amostra, deve-se, então, preparar e inocular um numero maior de diluições (10-1 a 10-7).
Inoculação 
Inocular 0,1 mL de cada diluição na superfície das placas previamente preparadas e, usando uma alça de Drigalsky, espalhar o inóculo por toda a superfície do meio, até que todo o excesso de líquido seja absorvido. 
Incubação
Aguardar que as placas sequem (mínimo 15 minutos), e incubar a 25°C/ 3 a 5 dias). 
Obs.: Deve-se observar as placas com 3 dias de incubação e, caso haja crescimento de bolores e/ou leveduras com colônias espalhadas, efetuar a contagem com três dias, para prevenir a perda das placas por espalhamento total dessas colônias. Caso não se observe risco de espalhamento, re-incubar as placas e contar com 5 dias de incubação. 
Contagem das colônias e cálculo dos resultados
Selecionar as placas com 10 a 150 colônias e contar as colônias com auxílio de uma lupa, em um contador de colônias. Calcular o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por grama ou mL da amostra multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição e por 10 (dez). UFC/g ou mL = N° de colônias x 10/diluição.
Obs: Caso tenha sido utilizado mais de uma placa por diluição (duplicata ou triplicata), considerar como número de colônias a média aritmética da contagem obtida em cada uma das placas da duplicata ou triplicata.
Referências
Difco Manual. Dehydrated culture media and reagents for microbiology. 10th. Ed. Detroit, Michigan, 1984. P. 689691.
Franco, Bernadette D. G. M; Landgraf, Mariza. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo, Ed. Atheneu, 2005. p27-171. 
King, A.D.; Hocking, A.D.; Pitt, J.I. Dichloranrosebengal medium for the enumeration and isolation of molds from foods. Appl. And Environ. Microbiol., v. 37, p. 959964, 1979.
Leitão, M.F.F. Tratado de microbiologia: microbiologia de alimentos, sanitária e industrial. São Paulo: Manole, 1988. v.1.
Silva, N; Junqueira, V. A.; Silveira, N. F. A. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. 3ª Edição. Livraria Varela.
Silva, N. da.; Junqueira, V.C.A. Métodos de análise microbiológica de alimentos. Campinas: ITAL, 1995. 229 p. (Manual Técnico, 14).
Aula prática nº 4
Coliformes totais, fecais e Escherichia coli
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Aula prática nº 4
Coliformes totais, fecais e Escherichia coli
Fundamento
A presença de coliformes nos alimentos é de grande importância para a indicação de contaminação durante o processo de fabricação ou mesmo pós-processamento. Segundo FRANCO (2005), os microorganismos indicadores são grupos ou espécies que, quando presentes em um alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação fecal, sobre a provável presença de patógenos ou sobre a deterioração potencial de um alimento, além de poder indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento, produção ou armazenamento. 
Segundo SILVA (2001), a presença de coliformes totais e fecais em alimentos processados é considerada uma indicação útil de contaminação pós–sanitização ou pós-processo, evidenciando práticas de higiene e sanificação aquém dos padrões requeridos para o processamento de alimentos. 
O grupo de micro-organismos coliformes totais é composto por bactérias da família Enterobacteriaceae, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, quando incubados a 35-37ºC, por 48 horas. São bacilos gram-negativos e não formadores de esporos. Fazem parte desse grupo predominantemente bactérias pertencentes aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella. Destes apenas a Escherichia coli tem como habitat primário o trato intestinal do homem e animais. 
Os demais (Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella), além de serem encontrados nas fezes, também estão presentes em outros ambientes como solo e vegetais, onde persistem por tempo superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal como Salmonella e Shigella. Conseqüentemente, a presença de coliformes totais no alimento não indica, necessariamente, contaminação fecal recente ou ocorrência de enteropatógenos. 
Porém as bactérias pertencentes ao grupo coliformes fecais correspondem aos coliformes totais que apresentam a capacidade de continuar fermentando a lactose com produção de gás, quando incubadas de 44-45,5ºC. Nessas condições, ao redor de 90% das culturas de E. coli são positivas, enquanto entre os demais gêneros, apenas algumas cepas de Enterobacter e Klebsiella mantêm essa característica.
A pesquisa de coliformes fecais nos alimentos fornece, com maior segurança, informações sobre as condições higiênicas do produto e melhor indicação da eventual presença de enteropatógenos.
A técnica do número mais provável (NMP) é metodologia convencional mais utilizada pelos laboratórios de microbiologia de alimentos para estimar a contagem de coliformes totais e fecais. Nesse método, diluições de amostras de alimentos são preparadas e inoculadas em nove tubos de um meio apropriado, sendo os resultados expressos de acordo com a tabela padrão do NMP.
O objetivo da aula é demonstrar a metodologia tradicional empregada na contagem de coliformes totais, fecais e Escherichia coli em alimentos.
Materiais 
Tubos de diluição com 9 mL de água peptonada por tubo
Pipetas: de 1 ou 2mL
Meios de cultura
Tubos contendo 10 mL de caldo LST (lauril sulfato triptose) com tubos de Durhan
Tubos contendo 10 mL de caldo BVB (verde brilhante bile) com tubos de Durhan
Tubos contendo 10 mL de caldo EC (E.coli) com tubos de Durhan
Placas de Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB)
Estufa incubadora regulada a 35ºC
Banho – Maria com temperatura regulada a 45,5ºC.
Metodologia
O esquema geral da contagem de coliformes totais e fecais encontra-se descrito no exemplo exposto na figura abaixo. Porém, se faz necessário seguir as etapas que contribuirão para a precisão da análise e, que se encontram listadas abaixo.
Bancada
Preparo da bancada
Antes de iniciar os trabalhos, deve ser feita uma assepsia na bancada de trabalho e na embalagem das amostras com álcool 70% para redução dos contaminantes presentes. Identificar a amostra e codificar os tubos com os códigos pertinentes. Além disso, a disposição de todo o material requerido para a análise deve ser feita de maneira que facilite todo o processo de análise. 
Amostras
Preparo de amostras
Deve-se fazer a homogeneização da amostra (agitada manualmente, 25 vezes, em sua própria embalagem), constituindo assim a diluição 100. 
A seguir, serão preparadas diluições decimais a partir da diluição 100, em tubos contendo 9,0 mL de água peptonada 0,1%, até que se chegue à diluição 10-4.
Técnica dos tubos múltiplos (NMP)
 Inoculação (teste presuntivo): Transferir alíquotas de 1,0 mL de cada diluição, para séries de três tubos, contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com tubos de Durham invertidos. Incubar os tubos a 35+1ºC durante 24 e/ou 48 h e observar se há crescimento com produção de gás.
 Contagem de coliformes totais: Retirar uma alçada de cada tubo apresentando crescimento e produção de gás e semear em tubos contendo 10 mL de Caldo Bile Verde Brilhante (CBVB), com tubos de Durham invertidos. Incubar a 35ºC +1ºC durante 24 e 48 h e observar se há crescimento com produção de gás. A formação de gás nos tubos de CBVB indica a presença de coliformes totais, sendo o resultado expresso em NMP de coliformes totais/g ou mL em uma tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas.
 Contagem de coliformes fecais: Tomar os tubos com Caldo Lauril Sulfato Triptose (CLS) com produção de gás e semear em tubos contendo 10mLde Caldo E. coli (EC), com tubos de Durham invertidos. Incubar em banho-maria a 45,5ºC + 0,1ºC por 24h e observar se há crescimento com produção de gás. Anotar o número de tubos de EC com produção de gás, e determinar o NMP/g ou mL em uma tabela de NMP adequada às diluições inoculadas. 
Contagem de Escherichia coli : De cada tubo de EC com produção de gás em 24 ou 48 horas, estriar uma alçada da cultura em placas de Agar Eosina Azul de Metileno (EMB). Incubar as placas a 35 C por 24 horas e observar se há o desenvolvimento de colônias típicas de E.coli (nucleadas com centro preto, com ou sem brilho metálico). 
Referências
Franco, Bernadette D. G. M; Landgraf, Mariza. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo, Ed. Atheneu, 2005. p27-171. 
Geus, Juliana Aline Mascarenhas; LIMA, Isaura Alberton. Análise de Coliformes totais e fecais: um comparativo entre técnicas oficiais VRBA e Petrifilm EC aplicados em uma indústria de carnes. Disponivel em http://www.pg.cefetpr.br/ppgep/anais/artigos/eng_tec_alimentos. Acessado em 07.04.2007
Silva, Neusely; Junqueira, Valéria C. A.; Silveira, Neliane F. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. - São Paulo: Livraria Varela, 2001, p31. 
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Aula prática nº 5
Detecção de Salmonella
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Aula prática nº 5
Detecção de Salmonella
Fundamento
A pesquisa de Salmonella sp. é extremamente importante para a indústria alimentícia, tendo em vista que este gênero está associado a 1/3 dos casos de doenças transmitidas por alimentos (Food and Drug Administration FDA, 2003) apresentando relevância no âmbito de saúde pública, além de provocar danos consideráveis na área econômica. 
O gêrero Salmonella, pertencente à família Enterobacteriaceae, é representado por bacilos gram-negativos, anaeróbios facultativos, que utilizam o citrato como única fonte de carbono, não produzem indol, não decompõem a uréia, não fermentam a sacarose, nem a lactose, com exceção de algumas estirpes, descarboxilam a lisina, formam gás sulfídrico (H2S), e fermentam glicose com produção de gás. 
Apresenta como habitat natural o trato intestinal do homem e de animais, sendo eliminadas pelas fezes, que ao entrarem em contato com águas, superfícies e manipuladores, torna iminente sua veiculação por alimentos como carnes, aves, ovos e seus derivados.
Visando à identificação deste micro-organismo a partir de amostras de alimentos, foi elaborado um método tradicional que permite sua detecção mesmo em situações extremamente desfavoráveis, como é o caso de alimentos com uma microbiota competidora muito maior que a população de Salmonella, e/ou alimentos em que as células se encontram injuriadas pelo processo de preservação, como a aplicação de calor, o congelamento e/ou secagem, por exemplo.
A metodologia recomendada, embora apresente algumas variações na seleção dos meios de cultura e forma de preparação das amostras, segue basicamente 4 etapas que podem ser aplicadas a qualquer tipo de alimento:
Pré-enriquecimento em caldo não seletivo: objetiva a recuperação de células injuriadas, conseguida incubando-se a amostra em condições não seletivas, por pelo menos 18 horas. Há vários meios disponíveis para a utilização nessa etapa, recomendados por diferentes órgãos reguladores nacionais e internacionais (AOAC, ICMSF, ISSO E ABNT).
Enriquecimento em caldo seletivo: objetiva inibir a multiplicação da microbiota acompanhante e promover a elevação preferencial do número de células de Salmonella, incubando-se a amostra pré-enriquecida em caldo seletivo, por 18-24 horas. Nessa etapa, recomenda-se a utilização de dois diferentes meios de enriquecimento, porque a resistência de Salmonella aos agentes seletivos varia de cepa para cepa. Os meios comumente utilizados são o caldo tetrationato, selenito cistina e o Rappaport – Vasiliadis.
Plaqueamento seletivo diferencial: objetiva promover o desenvolvimento preferencial de colônias de Salmonella, com características típicas que as distingam dos competidores, para posterior confirmação sorológica e bioquímica. Assim como na etapa de enriquecimento seletivo, recomenda-se que o plaqueamento diferencial seja feito em mais de um tipo de meio de cultura, havendo diversos meios disponíveis para a utilização nessa etapa, como o Agar bismuto sulfito (BS), o Agar Entérico de Hecktoen (HE), o Agar verde brilhante (BG), Agar Salmonella Shigella e o Agar xilose lisina desoxicolato (XLD).
Confirmação: objetiva verificar se as colônias típicas obtidas nas placas são realmente colônias típicas de Salmonella, através de provas bioquímicas e sorológicas. Inicialmente as colônias são submetidas aos testes de descarboxilação de lisina, fermentação de lactose e/ou sacarose, e produção de H2S, no Agar lisina ferro e Agar tríplice açúcar ferro, que permitem eliminar das etapas subseqüentes, boa parte das colônias de não Salmonella. Culturas características nesses meios devem ser submetidas ao teste sorológico somático polivalente, podendo ser eliminadas das etapas subseqüentes todas aquelas com resultado negativo. Culturas com teste positivo ou duvidoso devem ser submetidas a uma bateria de testes bioquímicos adicionais, para confirmação definitiva da identidade.
Materiais
Frascos contendo 225 mL de caldo lactosado simples (caldo de pré-enriquecimento)
Tubos de ensaio contendo caldo tetrationato
Tubos de ensaio contendo caldo Rappaport – Vasiliadis
Placas de Agar Entérico de Hecktoen (HE)
Placas de Agar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD)
Tubos contendo Agar tríplice açúcar ferro (TSI)
Tubos contendo Agar lisina ferro (LIA)
Banho-maria regulado a 43 graus Celsius
Estufa incubadora a 35 graus Celsius
Metodologia
O esquema geral da análise de Salmonella encontra-se descrito abaixo.
Deve-se transferir 25 gramas ou mL da amostra para o frasco contendo os 225 mL de caldo de pré-enriquecimento e homogeneizar a amostra. 
Incubam-se os frascos a 35 graus Celsius / 18-24 horas, com as tampas ligeiramente afrouxadas.
Após o período de incubação, agita-se delicadamente o frasco com o caldo de pré-enriquecimento e transfere-se um mL para 10 mL de caldo tetrationato e Rappaport-Vasiliadis. Incubar ambos os caldos a 35 C/24h.
Decorrido às 24h, devem-se agitar os tubos de enriquecimento seletivo em agitador tipo “vortex” e estriar uma alçada do caldo tetrationato em placas de Agar HE e XLD. Repetir esse procedimento com o caldo Rappaport – Vasiliadis. Incuba-se as placas invertidas a 35 C/24h e após esse período, verifica-se se há o desenvolvimento de colônias típicas de Salmonella:
- Agar HE: colônias transparentes, verde-azuladas, com ou sem centro preto. Cepas fortemente produtoras de H2S podem produzir colônias inteiramente pretas. Colônias de fermentadores de lactose ou sacarose são de cor salmão e não transparentes.
- Agar XLD: colônias transparentes,, cor de rosa escuro, com ou sem centro preto. Cepas fortemente produtoras de H2S podem produzir colônias com centro preto grande e brilhante, ou mesmo inteiramente pretas. Cepas fermentadoras de lactose ou sacarose produzem colônias amarelas com ou sem centro preto. Diversas cepas de Salmonella podem apresentar colônias transparentes amarelas, típicas, com ou sem centro preto.
5. A etapa de confirmação de Salmonella deve ser realizada da seguinte maneira: após ter sido feita a avaliação entre colônias típicas e atípicas, provenientes do plaqueamento seletivo, deve-se remover com o auxilio de uma agulha de inoculação, uma porção da massa de células, do centro da colônia típica e inocular em tubos inclinados de Agar TSI e LIA. A inoculação deve ser feita por picada em estrias na rampa, utilizando-se a mesma alçada para inocular ambos os tubos. Não e necessário nem recomendado flambar a agulha e retirar outra porção da colônia, entre um tubo e outro. Recomenda-se submeter à confirmação preliminar pelo menos duas colônias típicas de cada placa, nos tubos LIA e TSI. Incubam-se os tubos a 35 C por 24 horas e observar se há ocorrência de reaçãotípica de Salmonella (ver descrição abaixo):
- Reação típica no Agar TSI: rampa alcalina (vermelha) e fundo ácido (amarelo), com ou sem produção de H2S (escurecimento do Agar). Reação atípica em TSI que não deve ser descartada se as demais reações em LIA se apresentarem típicas: rampa e fundo ácidos (amarelos), com ou sem produção de H2S.
- Reação típica no Agar LIA: fundo e rampas alcalinos (púrpura, sem alteração da cor do meio), com ou sem produção de H2S (escurecimento do meio). Reação atípica em LIA, que não deve ser descartada se as demais reações em TSI se apresentarem típicas: fundo amarelado com rampa alcalina, com ou sem produção de H2S.
Observações
1 -   se as placas de HE ou XLD apresentarem colônias típicas, porém não isoladas de Salmonella, deve-se estriar uma alçada da colônia, tomada no centro e, se possível, sem tocar nas colônias adjacentes, estriar em placas de HE ou XLD, para purificação da cultura. Somente então, a partir da colônia pura, deve-se inocular os tubos de TSI e LIA.
2 -   os tubos de TSI devem ser inclinados com fundo de no mínimo 2,5 cm e incubados com a tampa ligeiramente afrouxada, para manter condições aeróbicas. Esse cuidado objetiva prevenir a excessiva produção de H2S e reações ácidas errôneas na rampa. Se, ainda assim, houver excessiva produção de H2S, mascarando a reação ácida  do fundo, deve-se assumir a reação como típica.
3 -   os tubos de LIA devem ser inclinados com fundo de no mínimo 4,0 cm e incubados com tampa bem fechada, porque a reação de descarboxilação da lisina ocorre anaerobicamente. A exclusão do ar previne resultados falso positivos, resultantes da desaminação oxidativa das peptonas do meio de cultura.
 Referências Bibliográficas
Andrews, W.H, Hammack, T.S. Salmonella. Bacteriological Analytical Manual. Gaitherburg:U.S.A. Food and Drug Administration, 1998. Disponível em: < http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-5.html >. Acesso 15 jul. 2003
Silva, N. da, Junqueira, V.C.A., Silveira, N.F.A. Manual de métodos de análise microbiológica em alimentos. São Paulo: Livraira Varela, 1997.
Vieira, R.H. Microbiologia, higiene e qualidade do pescado. São Paulo: Livraria Varela, 2003. 378p.
Aula prática nº 6
Contagem de Staphylococcus
Aula prática nº 6
Contagem de Staphylococcus
Fundamento
Os membros do gênero Staphylococcus são cocos gram positivos, com 0,5 a 1,5µm de diâmetro, apresentando-se isolados, aos pares, em tétrades ou em forma de cachos de uva (BANNERMAN, 2003). São mesófilicos, tolerantes a concentrações salinas que variam entre 10% a 20%, crescem na faixa de pH de 4 a 9,8 e possuem a capacidade de crescerem em valores baixos de atividade de água (0,83 – 0,86) (FRANCO; LANDGRAF, 2004). São tipicamente encapsulados ou com formação de cápsula limitada, usualmente catalase positiva, não apresentam motilidade e nem produzem esporos, sendo os mesmos classificados como anaeróbios facultativos, exceto S. saccharolyticus e S. aureus subsp. anaerobius (BANNERMAN, 2003), 
De acordo com a classificação do Taxonomic Outline of the Prokaryotes Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (GARRITY et al., 2004), esse gênero é constituído por 30 espécies e 20 subespécies, sendo consideradas como coagulase positiva S. aureus, S. delphini, S. intermedius, S. schleiferi coagulans e algumas cepas de S. hyicus e as demais espécies são coagulase negativa (GARRITY et al., 2004).
Staphylococcus estão amplamente distribuídos na natureza, sendo o homem e os animais os principais reservatórios. Geralmente, são encontrados nos pêlos, na pele, boca, narinas, glândulas mamárias, trato respiratório e intestinal destes hospedeiros. Certas espécies desse gênero são freqüentemente consideradas agente etiológico de diversas infecções em humanos e animais (BANNERMAN, 2003). 
 A espécie S. aureus é a principal responsável por doenças em humanos, estando essas associadas ao consumo de alimentos ou não. Estima-se que entre 30 - 50% da população humana seja portadora dessa bactéria (LE LOIR et al., 2003). O principal habitat de Staphylococcus em humanos é a cavidade nasal e, por meio dela, atingem tanto a pele como ferimentos, a água, o ar, o solo, o esgoto, plantas de processamento de leite e diversos tipos de alimentos.
A contagem de S.aureus em alimentos pode ser feita com dois objetivos diferentes, um relacionado com a saúde pública, para confirmar o envolvimento em surtos de intoxicação alimentar, e outro relacionado com o controle da qualidade higiênico-sanitária dos processos de produção de alimentos, condição em que S.aureus serve como indicador de contaminação pós - processo ou das condições de sanificação das superfícies destinadas ao contato com alimentos. Em cada um destes casos, o sucesso das analises depende da seleção de um método adequado tanto ao numero de células presente na amostra, como as condições de injurias impostas a células, durante o processamento do alimento. 
De maneira geral, alimentos envolvidos em surtos apresentam uma grande população de S.aureus, não exigindo métodos particulares sensíveis, enquanto na enumeração como indicador, o número de células geralmente é reduzido, exigindo métodos particularmente sensíveis, principalmente se S. aureus não representa a espécie predominante no alimento. É importante ressaltar que alimentos submetidos a tratamento térmico após um período de manutenção em condições que permitam o crescimento podem não apresentar células viáveis de S. aureus, destruídas pelo calor, e ainda assim conter toxinas estafilocócicas, altamente resistentes ao calor.
Há vários métodos disponíveis para a contagem de S. aureus, com sensibilidade variável tanto em função das características seletivas/diferenciais utilizadas na formulação de meios, como em função da técnica de contagem propriamente dita (direta em placas ou pelo número mais provável). Eventualmente, dependendo do objetivo da análise e das condições de injuria impostas às células, pode ser aconselhável a aplicação de um simples teste de presença/ausência, com uma etapa de pré-enriquecimento não seletivo que garanta a reparação das injúrias.
As principais características utilizadas no isolamento de S.aureus são as características seletivas, como habilidade de crescer na presença de 10% de NaCl, 0,01 a 0,05% de telurito de potássio, 0,2 a 0,5% de cloreto de lítio, 0,12 a 1,26% de glicina e 40 mg/L de polimixina, entre outras, e as características diferenciais, como a habilidade para reduzir o telurito de potássio, produzindo colônias pretas, a habilidade para hidrolizar a gema de ovo, por ação de lípases e/ou lecitinases, produzindo halos claros em redor das colônias, a capacidade de crescer a 42-43 C em condições seletivas, a atividade de coagulase e de termonuclease , entre outras. Há vários meios disponíveis para a contagem direta em placas, combinando uma ou mais características seletivas/diferenciais; sendo, porém, o Agar Baird Parcker o mais utilizado, que combina o telurito de potássio, a glicina e o cloreto de lítio como agentes seletivos e a redução de telurito e a hidrólise da gema de ovo como características diferenciais.
O Agar Baird Parcker, não e capaz de suprimir completamente o crescimento de competidores de S. aureus, principalmente outras espécies não patogênicas do gênero Staphylococcus, que produzem colônias semelhantes, havendo necessidade de submeter as colônias a testes adicionais (catalase, coagulase e termonuclease) para confirmação definitiva.
Materiais
Diluente: 225 ml de água peptonada 0,1%
Tubos de diluição com 9,0 mL de água peptonada por tubo
Pipetas de 5,0 mL
Placas contendo o Agar Baird Parcker
Álcool 70%
Estufa incubadora a 35ºC
Alça de espalhamento (Drigalsky)
Metodologia
Coleta das amostras
Transporte e estocagem das amostras
Como regra geral, deve-se transportar e estocar as amostras de alimentos da mesma forma como o produto é normalmente transportado e estocado na sua comercialização
Recepção
Devem ser observadasas condições da embalagem e as condições em que foi feito o transporte, antes da análise. Deve ser recusada qualquer amostra com embalagem rasgada, furada, violada, com corpos estranhos ou qualquer outro tipo de defeito.
Preparação da amostra
Higienizar a embalagem da amostra com álcool 70%. 
Identificação do material
Com o auxílio de uma caneta identificar todo o material utilizado, com as respectivas diluições.
Retirada da unidade analítica
A unidade analítica utilizada na analise da maioria dos alimentos e de 25 g (alimentos sólidos) ou 25 mL (alimentos líquidos). Deve-se, primeiramente homogeneizar a mostra (misturando). Retiram-se assepticamente as 25 g ou 25 mL da amostra e coloca-se em 225 mL do diluente (água peptonada 0,1%). Homogeneíza-se, cuidadosamente, constituindo dessa maneira, a diluição 10-1. Para a preparação da segunda diluição (10-2), transfere-se, assepticamente, 1,0 mL da diluição 10-1 para 9,0 mL de diluente. As diluições subseqüentes são obtidas de maneira similar, transferindo-se 1,0 mL da diluição anterior para 9,0 mL de diluente. O número de diluições requeridas dependerá do nível de contaminação esperado. Por exemplo, se a contagem estimada encontra-se por volta de 2500 a 25000/g de amostra, as diluições recomendadas para a contagem em placas são 10-1, 10-2 e 10-3. Caso não haja possibilidade de se estimar previamente o nível de contaminação da amostra, deve-se, então, preparar e inocular um numero maior de diluições (10-1 a 10-7).
Inoculação 
Inocular 0,1 mL de cada diluição na superfície das placas previamente preparadas e, usando uma alça de Drigalsky, espalhar o inóculo por toda a superfície do meio, até que todo o excesso de líquido seja absorvido. 
Incubação
Aguardar que as placas sequem (mínimo 15 minutos) e incubar a 35°C / 48 horas. 
Contagem das colônias presuntivas
Selecionar as placas com 20 a 200 colônias e contar as colônias típicas de S.aureus: colônias circulares, pretas, pequenas (máximo 1,5mm em diâmetro), lisas, convexas, com bordas perfeitas, massa de células esbranquiçada nas bordas, rodeadas por uma zona opaca e/ou halo transparente se estendendo para além da zona opaca. Eventualmente as colônias atípicas podem apresentar-se acizentadas, sem um ou ambos os halos típicos. 
Confirmação das colônias típicas
Selecionar no mínimo cinco colônias típicas para testes de coagulase, e havendo menos do que cinco tomar todas. Se a placa apresentar colônias suspeitas de mais de um tipo, típicas e atípicas, selecionar pelo menos cinco de cada tipo, ou numero proporcional à distribuição dos diferentes tipos na placa. Transferir cada colônia para um tubo contendo caldo infusão de cérebro e coração (BHI), emulsionar bem a massa de células com o caldo, transferir uma alçada para um tubo com ágar tripticase de soja (TSA) inclinado e incubar a 35 º.C/ 24 horas.
Referências
BANNERMAN, T. L. Staphylococcus, Micrococcus, and other catalase positive Coci that grow aerobically. In: MURRAY, P.R.; BARON, E. J.; JORGENSEN, J. H.; PFALLER, M. A.; YOLKEN, R. H. (Ed.). Manual of clinical microbiology. 8th ed. Washington: ASM, 2003. v. 1, Chap. 28, p. 384-404.
GARRITY, G. M.; BELL, J. A.; LILBURN, T. G. Taxonomic outline of the prokaryotes. Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed., 2004. Disponível em:
<http://141.150.157.80/bergeysoutline/outline/bergeysoutline_5_2004.pdf> 
Visualizado em : 15.01.2007
LE LOIR, Y.; BARON, F.; GAUTIER, M. Staphylococcus aureus and food poisoning. Genetics and Molecular Research, Ribeirão Preto, v. 2, n. 1, p. 63-76, jan., 2003
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