Protocolo de Prova Prática II (Dosagem de Proteínas ou glicídeos) Bioquimica I

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Protocolo de Prova Prática II – Bioquímica I
 
Objetivos: fazer a dosagem de açúcares ou proteínas, a partir da espectrometria de luz visível e comparando com curvas-padrões já estabelecidas préviamentes. Por Atiles Reis
Assinale aqui o composto a ser dosado:
Açúcar [ ]
Proteína [ ]
Passo a passo 
Colocar sobre a bancada uma estante com 7 tubos. 2 tubos para diluição (para dois valores de diluição (ex: 10x e 20x) e 4 para as duplicatas (2 para diluição de 10x e 2 para a diluição de 20x). Cada tubo de diluição servirá para fazer a diluição do material. Já nos tubos de duplicata colocaremos 1 ml dessa diluição já feita e esse material que será analisado. Por isso a diluição deve totalizar mais que 2 ml para que hajam 1 ml certos em cada duplicata. Aconselhável 5ml de solução final no tubo de diluição. O 7° tubo será para o branco de análise.
Definir valores de diluição a serem utilizados. É aconselhável usar duas diluições, com valores como 10x e 20 x de diluição. Caso ambos não caibam na curva, será necessária uma terceira diluição. 
Escrever nos tubos de diluição os valores de diluição a serem feitos neles e também identificar os tubos que servirão como duplicatas.
Definir a quantidade de solução problema a ser colocar. Para isso é necessário fazer a relação:
 
Diluição = Volume final/volume de solução problema
Ex: uma diluição de 10x:
10 (valor de diluição) = 5 ml (volume final da solução)
 X (volume de solução problema)
X = 0,5 ml de solução problema.
Pegar um bequer com água destilada e outro com solução problema, além de uma pipeta automática P5000, P 1000 e P 200 e suas respectivas ponteiras.
Fazer a diluição 1 ( x):
- Quantidade de solução problema ( )
- Quantidade de água destilada ( )
OBS: água + solução problema devem totalizar volume final desejável de 5ml (pode ser alterar, mas sempre mais que 2ml). Lembrando que se esse volume se alterar, a conta de quantidade de solução problema deve ser alterada!!!
 - Deve se inserir as quantidades de água e solução problema com as respectivas pipetas. É necessário lembrar que se o volume for de 0,5 ml, NÃO SE DEVE UTILIZAR A PIPETA P200 3 VEZES, POIS ISSO AUMENTARÁ O ERRO DA PIPETA EM 3 VEZES! O mesmo se aplica ao resto. Para esse volume, utilizariamos a P1000 ajustado ao valor. Para completar com água, que, seguindo ao exemplo, adicionaríamos 4,5 ml, poderíamos utilizara P5000, pipeta de maior capacidade na sala ou utilizar uma pipeta de vidro. 
- Homogenizar o tubo calmamente.
- Adicionar 1ml de solução homogeizada a duplicata 1 e 2. Deixar os 3ml restantes de estoque.
Fazer a diluição 2 ( x)
- Quantidade de solução problema ( )
- Quantidade de água destilada ( )
- Homogenizar o tubo calmamente. Dessa vez, é aconselhável que a outra dupla faça ou que a pessoa que fez a da diluição 1 limpe as mãos antes de fazer a da 2 para que não haja contaminação. 
- Adicionar 1ml de solução homogeizada a duplicata 3 e 4. Deixar os 3ml restantes de estoque. 
OBS: os mesmos cuidados devem ser tomados nessa diluição. 
Faça o branco de reação adicionando 1ml de água destilada no tubo vazio
Agora, siga o protocolo específico de seu composto.. 
Açúcar pelo método de DNS (Glicose)
Adicionar a cada tubo de duplicata com 1 ml de solução problema diluída em água destilada e no branco, 1ml de DNS (o composto laranja), que já deve estar setado para esse volume.
Vortexizar a solução com cuidado para que ela seja homogeinizada 
Adicionar em banho-maria por 5 minutos com cuidado. Ajustar o timer assim que adicionar os tubos forem colocados. 
Retirar os tubos e deixar esfriar por uns 5 a 10 minutos, até quando for possível pegar com as mãos
Completar o volume dos tubos com água ate que eles totalizem volume final de 15 ml. Ou seja adicionar 13 ml de água em cada tubo.
Homogeinizar com cuidado utilizando as mãos tomando cuidado com a contaminação. 
Fazer a análise espectofotométrica no especfotômetro utilizado em aula (Espectrofotômetro [ ]) a 540 nm. Começando pelo branco para tarar o espectrofotometro.
Anotar a absorvância de cada duplicata 
	
	Abs a 540nm
	Branco
	
	D1 ( x)
	
	D2 ( x)
	
	D3 ( x)
	
	D4 ( x)
	
Agora parta para a parte teórica para analisar os dados.
Valores da curva padrão:
(Feita por Isabel Wilmer e Bárbara Almeida utilizando Espectofometro F em 05/05/2017)
	Pontos
	 Concentração
	Absorvância
	1
	0
	0
	2
	2
	0,14
	3
	4
	0,292
	4
	6
	0,429
	5
	8
	0,645
	6
	10
	0,81
 
Y= 0,0786x R²= 0,9926
Os valores de absorvância tem que ser menores que 0,810nm para caber na curva. Caso não seja, fazer outra dilução.
Determinando a concentração
Para determinarmos a concentração, devemos seguir a seguinte fórmula:
[ ] = abs * f * diluição
Onde:
[ ] = Concentração do composto
Abs = absorvância em 540 nm
F = fator (equivale a 1/K ou 1/Y nesse caso)
Diluição = diluição utilizada (utilizar 1 caso não haja diluição)
Ex: uma solução diluída 2x e apresentou absorvância de 0,602:
[ ] = abs * f * diluição
[ ] = 0,602 * (1/0,0786) * 2
[ ] = 0,602 * 12,89 * 2
[ ] = 15,51 mM de glicose
Deve-se fazer essa conta para cada duplicata:
[ ] em D1 =
[ ] em D2 =
[ ] em D3 =
[ ] em D4 =
Média das concentrações: nm (desconsiderar caso haja valor muito discrepante em uma das duplicatas)
Proteínas pelo método de Biureto (Caseína)
Adicionar a cada tubo de duplicata com 1 ml de solução problema diluída em água destilada e no branco, 4ml de Biureto (o composto azul), que já deve estar setado para esse volume.
Vortexizar a solução com cuidado para que ela seja homogeinizada.
Colocar no escuro por 30 minutos. Ajustar o timer assim que adicionar os tubos forem colocados no armário. 
Fazer a análise espectofotométrica no especfotômetro utilizado em aula (Espectrofotômetro [ ]) a 550 nm, começando pelo branco para tarar o espectrofotometro.
Anotar a absorvância de cada duplicata
	
	Abs a 550nm
	Branco
	
	D1 ( x)
	
	D2 ( x)
	
	D3 ( x)
	
	D4 ( x)
	
Agora parta para a parte teórica para analisar os dados.
Valores de curva-padrão:
(Feita por Atiles Reis em 12/05/2017 utilizando espectofotômetro F)
	Pontos
	 Concentração
	Absorvância
	1
	0
	0
	2
	2mg/ml
	0,095
	3
	4mg/ml
	0,179
	4
	6mg/ml
	0,276
	5
	8mg/ml
	0,362
	6
	10mg/ml
	0,448
Y= 0,0452x R²= 0,9995
Os valores de absorvância tem que ser menores que 0,448 nm para caber na curva. Caso não seja, fazer outra dilução.
Determinando a concentração
Para determinarmos a concentração, devemos seguir a seguinte fórmula:
[ ] = abs * f * diluição
Onde:
[ ] = Concentração do composto
Abs = absorvância em 550 nm
F = fator (equivale a 1/K ou 1/Y nesse caso)
Diluição = diluição utilizada (utilizar 1 caso não haja diluição)
Ex: uma solução diluída 5x e apresentou absorvância de 0,323:
[ ] = abs * f * diluição
[ ] = 0,323 * (1/0,0452) * 5
[ ] = 0,323 * 22,124 * 5
[ ] = 35,73 mg/ml de caseína
Deve-se fazer essa conta para cada duplicata:
[ ] em D1 =
[ ] em D2 =
[ ] em D3 =
[ ] em D4 =
Média das concentrações: mg/ml (desconsiderar caso haja valor muito discrepante em uma das duplicatas)
Considerações finais:
Discutir os valores encontrados mostrando que a partir dos valores de absorvância e do coeficiente angular de uma curva padrão utilizada, podemos estabelecer também os valores de concentração de uma determinada solução. É necessário deixar claro que essa dosagem não apresenta muita sensibilidade em proteínas mas que ainda assim é largamente utilizada. É necessário mencionarmos ainda o fato de que nas condições experimentais dos laboratórios de aulas práticas, não é possível estabelecer um valor preciso, pois muitas vezes os equipamentos como pipetas e espectofotometrosestão ajustados de forma correta.