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Métodos de Estudo em Patologia - Biópsias e Histopatologia Biópsia Localização Identificação Procedimento Biópsia Tipos de Biópsia: 1. Incisional 2. Excisional Biópsia incisional Biópsia Incisional Fragmento da lesão Diagnóstico Não curativo Prognóstico Possibilidade de nova cirurgia Material encaminhado em formol a 10%, em volume 10 vezes maior que o da lesão. Deve acompanhar o relatório do dentista ao patologista. Identificação Relato clínico Diagnóstico clínico Aspectos transoperatórios Envio de outros exames Biópsia Incisional Biópsia Incisional Biópsia Incisional Remoção completa da lesão no momento cirúrgico Remover tecido normal adjacente Pode constituir tratamento definitivo Lesões pequenas, inclusive pigmentadas e vasculares Condições sistêmicas devem ser observadas (diabéticos, hipertensos, hemofílicos) Biópsia Excisional Biópsia Excisional Biópsia Excisional Biópsia Excisional Biopsia Incisional x Excisional Exame Histopatológico Macroscopia Processamento Histológico Microscopia Emissão do Laudo Anatomopatologico Processamento Histológico Fixação Desidratação Diafanização Parafinização Microtomia Coloração Macroscopia Descrever a peça a ser biopsiada (tamanho, coloração qtdd de fragmentos, consistência , etc). 2. Fixação: Os principais objetivos da fixação são: A) Inibir ou parar a autólise tecidual; B) Coagular ou endurecer o tecido e tornar difusíveis as substâncias insolúveis; C) Proteger, através do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e procedimentos técnicos posteriores; D) Preservar os vários componentes celulares e tissulares; E) Melhorar a diferenciação ótica dos tecidos; F) Facilitar a subsequente coloração. 2. Fixação: Fragmentos com 3 mm de espessura Tempo de fixação variável dependendo do tamanho do fragmento e do fixador. Volume aproximado de no mínimo 20 vezes o tamanho peça . A peça deve ser imersa rapidamente Tempo para fixação ? Tecido ósseo ? Cassetes 3. Desidratação Antes que um material de inclusão, tal como a parafina, possa penetrar no tecido seu conteúdo em água deve ser removido Consiste em banhos de concentrações crescentes de etanol: 70%, 80%, 90%, 2x 100%. Bateria de Álcool 4. Diafanização ou Clareamento A parafina não se mistura com álcool ou água O etanol é substituído por um líquido miscível com o meio de inclusão (xilol). Os tecidos embebidos em xilol tornam-se translúcidos, razão porque essa etapa é denominada diafanização ou clareamento. 5. Inclusão ou Impregnação: Estufa a 60ºC: parafina ocupa os espaços antes ocupados pelo xilol. Obtenção dos blocos de parafina. Micrótomo Micrótomo Cortes Histológicos Cortes em banho-maria: pescagem 7. Coloração: Coloração rotineira H-E. Hematoxilina (básica). Eosina (ácida). Núcleo é ácido e o citoplasma relativamente básico. Hidratação, Coloração, Desidratação e Clarificação. 7. Coloração: Colorações Corantes que diferenciam ácidos de bases. - formam ligações salinas com radicais ionizáveis presentes nos tecidos. Corantes que diferenciam componentes fibrosos da matriz extracelular. Sais metálicos que precipitam nos tecidos formando depósitos de metal (ex: tecido nervoso). As colorações foram desenvolvidas para visualizar componentes das células e dos tecidos que na maioria são incolores Colorações Baseadas no princípio ácido-base A hematoxilina é uma base, cora componentes ácidos da célula em uma cor azulada – núcleo (DNA e RNA) A eosina é um ácido que cora componentes básicos (proteínas citoplasmáticas) da célula em róseo. Reação e corantes histológicos comuns REAGENTES RESULTADOS Hematoxilina (base) Azul: núcleo; regiões ácidas do citoplasma: matriz da cartilagem. Eosina (ácido) Rosa: regiões básicas do citoplasma; fibras de colágeno. Tricrômico de Masson Azul-escuro: núcleos. Vermelho: músculo; queratina; citoplasma. Azul-claro: mucinógeno, colágeno. Orceína, corante para fibras elásticas Castanho: fibras elásticas. Weigert, corante para fibras elásticas Fibras elásticas. Coloração com prata Preto: fibras reticulares. Hematoxilina férrica Preto: estrias dos músculos, núcleos e hemácias. Ácido periódico de Schiff Magenta: glicogênio e moléculas ricas em carboidratos. Corantes Wright e Giemsa Usados para a coloração diferencial das células do sangue. Rosa: hemácias, grânulos dos eosinófilos. Púrpura: núcleos dos leucócitos, grânulos dos basófilos. Azul: citoplasma dos monócitos e linfócitos. C O L O R A Ç Õ E S Hematoxilina-Eosina Tricrômico de Masson Azul-escuro: núcleos. Vermelho: músculo; queratina; citoplasma. Azul-claro: mucinógeno, colágeno. Resorcina-Fucsina de Weigert fibras elásticas. 8. Montagem: 8. Montagem: 8. Montagem: Uso de lamínulas. Meio de montagem: resinas (Entellan) ou bálsamo do Canadá. Evolução do Microscópio de Luz O Microscópio Óptico não permite o estudo de detalhes com menos de 0,2 m. Microscópio Óptico ou de Luz Microscópio Óptico Monocular Microscópio Óptico Binocular Microscópio Eletrônico de Transmissão Microscopia Eletrônico de Transmissão Microscópio Eletrônico de Varredura Fornece imagens pseudo-tridimensionais. Os é não atravessam o tecido . Interagem com uma camada muito delgada de metal previamente aplicada ao espécime Mostra pricipalmente visão de superfícies Microscopia Eletrônico de Varredura Poder de resolução próximo ao de transmissão. Microscopia Eletrônico de Varredura Microscopia Eletrônico de Varredura Microscópio de Polarização Sob luz polarizada, algumas estruturas têm a propriedade de „birrefrigência‟ que é a capacidade de girar o plano de vibração da luz polarizada. Ex: celulose, colágeno, microtúbulos, microfilamentos. É um conjunto de ondas eletromagnéticas que se propagam em apenas uma direção Microscopia de Polarização Microscopia de Fluorescência Propriedades de certos materiais de absorver comprimento de onda curto (UV) e emitir comprimento de onda maior (visível) Uso de substâncias fluorescentes Imunofluorescência Fundo escuro Microscopia de Fluorescência Microscópio Confocal O preparado é iluminado por um delgado feixe de raios laser que varre o corte, iluminando ponto por ponto um determinado plano da célula, realizando, assim, um “corte óptico”. Geralmente, as células são previamente tratadas por compostos fluorescentes, e a luz emitida sob a excitação dos raios laser é captada e tratada num computador que fornece os sinais para um monitor de vídeo. A imagem que aparece no monitor é formada exclusivamente pelas estruturas que estão no plano de varredura, sem a participação dos componentes celulares situados em outros planos. Microscopia ConfocalMicroscópio de Contraste de Fase Permite o estudo de muitos detalhes celulares in vivo através de um sistema de lentes. Observação de cortes e células não coradas Quanto maior a densidade, maior o índice de refração e menor a velocidade da luz no corpo. Como as diversas estruturas celulares (núcleo, mitocôndrias, grânulos de secreção) têm índices de refração diferentes, causam atrasos diferentes nas ondas luminosas que as atravessam, dando origem a diferenças de fase entre as ondas luminosas emergentes, mas essas diferenças não são visíveis. Microscopia de Luz e Contraste de Fase Microscopia de Luz Contraste de Fase Técnicas Especiais Congelação: Não dissolve os lípidios, não inativa as enzimas e dificulta a difusão de pequenas moléculas. Tecido é endurecido por congelação. Técnica rápida (5 min), Nitrogênio líquido. Congelação: Criostato Immunohistoquímica Marcador Anticorpo 2ário. Anticorpo 1ário. Antígeno Tecidual Imunocitoquímica: método que se baseia numa reação antígeno- anticorpo. Imunohistoquímica Radioautografia Radioautografia Microscopia Diagnóstico Molecular Diagnóstico Molecular www.bioaula.com.br Preparação Tecidual 1. Coleta do tecido do animal 2. Corte do tecido em pedaços 3. Fixação 4. Desidratação 5. Inclusão a.em parafina para Microscopia Óptica (MO). b. em resinas para Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET). 6. Obtenção de cortes a.com navalha metálica para MO. b. com lâmina de vidro ou de diamante para MET. 7. Montagem a. em lâminas de vidro para MO. b. em grades metálicas para MET. Ensinar e antes de tudo uma arte! Tarefa de Casa
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