Preparo de lâminas histológicas

Prévia do material em texto

• No microscópio óptico, a imagem 
se forma a partir dos raios luminosos 
de um feixe de luz que atravessou 
uma estrutura. 
 
Preparo de lâminas 
histológicas 
 
1) Dissecçção do órgão/estrutura a 
ser estudada. 
2) Fixação do material com 
formaldeído 4% - estabilização 
molecular do tecido. 
3) Banhos sucessivos em 
concentrações crescentes de etanol 
(70-100%). 
4) Lavagens com solvente orgânico 
– xilol. 
5) Inclusão do material em parafina 
previamente aquecida em 60º. 
6) Resfriamento do bloco de 
parafina e cortes com micrótomo (1-
10 μm). 
7) Inserções dos cortes em lâminas 
de vidro. 
8) Coloração do material. 
9) Montagem da lamínula, com 
bálsamo, sobre o corte histológico. 
 
Explorando as etapas 
 
• Coleta da amostra: 
✓ consiste na obtenção da 
amostra de tecido. 
✓ Pode ser obtida por 
diferentes maneiras: 
○ Biópsia (amostragem 
diagnóstica); 
○ Excisão cirúrgica; 
○ Dissecção após a morte. 
• Fixação: 
✓ Visa evitar a digestão dos 
tecidos por enzimas presentes nas 
próprias células (autólise) ou em 
bactérias. 
✓ Endurecer os fragmentos. 
✓ Preservar em grande parte 
a estrutura e a composição 
molecular dos tecidos. 
✓ Pode ser feita por métodos 
físicos ou químicos. 
✓ Na fixação química, os 
tecidos são imersos em fixadores 
(substâncias desnaturantes) que 
estabilizam as moléculas 
Preparo de lâminas histológicas, técnicas de coloração e uso de 
microscópio óptico 
Histologia Medicina 
 
 
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formando pontes com moléculas 
adjacentes. 
✓ A perfusão intravascular do 
fixador resulta em melhor fixação. 
✓ Os fixadores mais utilizados são 
formaldeído 4% e glutaraldeído 
(reagem com os grupos amina das 
proteínas). 
✓ Para estudos ultraestruturais, 
utiliza-se dupla fixação: glutaraldeído 
tamponado seguido de tetróxido de 
ósmio. 
 
• Inclusão: 
✓ Infiltração dos tecidos por 
substâncias que lhe proporcionam 
consistência rígida. 
✓ Substâncias mais utilizadas: 
parafinas e resinas de plástico. 
✓ Possui duas etapas: desidratação 
e clareamento. 
✓ Desidratação: retirada da água 
do tecido mediante sucessivos 
banhos de etanol em concentrações 
crescentes (70-100%). 
✓ Clareamento: substituição do 
etanol dos fragmentos por 
substâncias intermediárias (miscíveis 
em etanol e na parafina/resina) -
geralmente são os solventes 
orgânicos xilol e toluol. 
✓ Após a aplicação do 
solvente, os tecidos ficam 
translúcidos. 
✓ Inclusão: segue-se o 
contato com parafina derretida a 
60º, cujo calor evapora o 
solvente. A parafina preenche os 
espaços do tecido. 
✓ O bloco de parafina é 
levado ao micrótomo, onde é 
cortado por uma lâmina de aço 
ou de vidro, em cortes de 1 a 10 
micrômetros. 
✓ Cortes ficam em superfície 
de água aquecida até serem 
colocados na lâmina. 
 
 
✓ Método físico: fixação por 
congelamento – mais rápido 
(bom em hospitais), mantém 
enzimas, proteínas em sua 
conformação natural e lipídios do 
tecido. 
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• Coloração e montagem: 
✓ Aplicam-se aos tecidos os 
corantes de interesse (comumente 
hematoxilina e eosina). 
✓ Selagem do tecido na lâmina 
com bálsamo ou goma de damar. 
✓ Posicionamento da lamínula e 
identificação. 
✓ Componentes dos tecidos que se 
coram bem com corante básicos – 
basófilos (ácidos nucleicos, 
glicoaminoglicanos e glicoproteínas 
ácidas). 
✓ Componentes do tecido que têm 
afinidade por corantes ácidos – 
acidófilos (mitocôndrias, grânulos de 
secreção, proteínas citoplasmáticas 
e colágeno). 
✓ Corantes básicos: azul de 
toluidina, azul de metileno e 
hematoxilina. 
✓ Corantes ácidos: Orange G, 
eosina, fucsina ácida. 
 
 
Hematoxilina e Eosina 
 
• Amplamente utilizada. 
• Baseia-se nas propriedades 
ácidas e básicas das moléculas do 
tecido. 
• Eosina – corante de 
natureza ácida, com afinidade 
por estruturas básicas. 
✓ Ex.: colágeno, citoplasma e 
queratinas ácidas (estruturas 
acidófilas). 
✓ Confere coloração rósea. 
• Hematoxilina - corante de 
natureza básica, com afinidade 
por estruturas ácidas. 
✓ Ex.: ácidos nucleicos e 
cartilagem hialina (estruturas 
basófilas) 
✓ Confere coloração azul 
púrpura/violeta. 
 
 
 
 
 
 
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• Ácido Periódico de Schiff e 
Hematoxilina (PAS - H). 
✓ O PAS cora estruturas com alto 
teor de carboidratos (ex.: glicogênio, 
glicoproteínas, proteoglicanos). 
✓ Evidencia a membrana basal. 
 Obs.: Membrana basal = lâmina 
basal (colágeno tipo IV, 
peptideoglicanos, laminina) + lâmina 
reticular (fibras reticulares - colágeno 
tipo III). 
• Técnica da reticulina 
✓ Utilizada para corar estruturas 
argiróforas (afinidade por prata). 
✓ Comumente utilizada para 
visualização de fibras reticulares. 
 
 
 
 
 
 
 Obs.: Lembrar dos artefatos 
(falhas na lâmina geradas pelo 
próprio processo de produção)!! 
 
Microscópio óptico 
 
• Microscopia óptica (ou de 
luz). 
• Limite de resolução = 0,2 μm 
(0,0002 mm). 
• Possibilita a ampliação de 
uma imagem em até 1000 a 1500 
vezes. 
• Permite visualizar apenas 
algumas estruturas celulares (ex.: 
núcleo, nucléolo, grânulos 
citoplasmáticos) e componentes 
acelulares, tais como fibras 
proteicas. 
• Requer o uso de corantes. 
• Sistema de lentes 
combinadas que promove um 
aumento de até 1000 x do tecido 
observado. 
• Possibilita a observação de 
estruturas não visíveis a olho nu. 
• Produz uma imagem virtual 
e invertida do objeto. 
• O aumento total = aumento 
da ocular x o aumento da 
objetiva. 
• O campo microscópico 
corresponde à área que está 
sendo observada do objeto de 
estudo. 
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• O campo microscópico é 
inversamente proporcional à 
ampliação. 
 
• Procedimento para usar o 
microscópio óptico corretamente 
1. Retire a capa protetora do 
microscópio; 
2. Ligar o microscópio e verificar a 
intensidade da luz; 
 
3. Verificar se a objetiva 
posicionada no centro da 
platina/mesa é a de menor aumento; 
4. Abaixar a platina/mesa 
lentamente, utilizando o parafuso 
macrométrico, com cuidado 
para não forçar o limite da 
mesma; 
 
5. Puxar a pinça e posicionar a 
lâmina com o material a ser 
observado sobre a mesa/platina, 
soltando a pinça suavemente até 
encostar na quina da lâmina; 
 
 
 
6. Utilizar o charriot para 
posicionar o tecido no centro da 
mesa, onde passa o feixe de luz; 
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7. Ajustar a distância entre as 
oculares até que as imagens se 
unam; 
 
8. Subir, cuidadosamente, a mesa 
com o parafuso macrométrico até 
obter uma focalização grosseira 
(sempre na objetiva de menor 
aumento – 4x); 
 
 
9. Fazer o ajuste fino da imagem 
através do parafuso micrométrico; 
 
 
 
10. Para alterar a objetiva utilizada, 
sempre utilizar o revólver. NUNCA 
segurar na objetivar para fazer a 
mudança; 
 
11. Visualizar a lâmina na 
objetiva de x 10; 
 
12. Visualizar a lâmnina na 
objetiva de x 40; 
 
 
13. Na objetiva de maior 
aumento (100x), colocar uma 
pequena gota de óleo de imersão 
sobre a lâmina e encaixar a 
objetiva de 100x, de modo que a 
mesma fique em contato direto 
com o óleo; 
 Obs.: NUNCA posicionar a 
objetiva de 100x sem o óleo de 
imersão. Uma vez utilizado o óleo, 
não utilizar a objetiva de 40x antes 
de limpar o equipamento com 
éter. 
 Obs.: NÃO movimentar o 
microscópio para mostrar uma 
imagem ao colega. Utilizar o 
parafuso para girar o canhão 
 
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14. Ao terminar a observação, 
retornar para a objetiva de menor 
aumento (4x), abaixar a mesa 
lentamente, retirar a lâmina e 
guardá-la devidamente; 
 
15. Desligar o microscópio e cobri-lo 
com a capa protetora. 
 
 Observações finais: 
✓ A objetiva nunca encosta na 
lâmina, apesar de poder ficar muito 
próxima. 
✓ O microscópio deve estar sempre 
limpo e seco. 
✓ Não sedeve forçar as estruturas 
do aparelho e nem movê-lo. 
✓ Sempre ajustar a intensidade da 
luz para o maior conforto visual e 
procurar desligá-la quando não 
estiver utilizando o aparelho. 
 
Referências 
 
• JUNQUEIRA, LC; CARNEIRO, J. 
Histologia básica. 12. ed. Rio de 
Janeiro: Guanabara Koogan, 2013. 
 
• ABRAHAMSOHN, P. Histologia. 1. ed. 
Rio de Janeiro : Guanabara Koogan, 
2016