Relatório, método de coloração Gram

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Crescimento Microbiano através da Inoculação da Calça Jeans
FARIA, Francielly Fernanda de; COSTA, Giovana Cunha de Araújo; CAMPOS, Júlia Giordani Sardiña; GOMES, Luana Crisitna Camargos; VEIGA, Tammy Damares
fran0934@hotmail.com, giovanacunhac@gmail.com, juliagiordanii@live.com, luanacamargos_gomes@hotmail.com, tammydamares@gmail.com 
Graduandos do Curso de Engenharia Química
Centro Universitário de Formiga – UNIFOR
1. Resumo
Este artigo foi realizado como parte das atividades práticas desenvolvidas na disciplina de Microbiologia e tem como objetivo observar e interpretar o mecanismo de reação de Gram como um método de coloração diferencial.
2. Introdução
2.1. Princípios da Coloração
Um corante, ou pigmento, é uma molécula que pode se ligar a uma estrutura celular e conferir-lhe cor. As técnicas de coloração fazem com que os microrganismos se destaquem contra seus planos de fundo. Os corantes também ajudam os pesquisadores a agrupar as principais categorias de microrganismos, examinar diferenças estruturais e químicas e observar partes da célula.
As principais etapas do preparo de um espécime microbiano corado para exame microscópico são:
1. Confeccionar um esfregaço, ou uma camada fina do espécime sobre uma lâmina de vidro.
2. Fixar o esfregaço seco à lâmina, usualmente com o calor, para fazer aderir o microrganismo à lâmina.
3. Coloração com um ou mais corantes.
Em microbiologia, são utilizados dois tipos principais de coloração: a coloração simples e a diferencial. A coloração simples utiliza um único corante e revela os formatos básicos das células e seus arranjos. O azul de metileno, a safranina, a carbol-fucsina e o cristal violeta são corantes comumente utilizados em colorações simples. A coloração diferencial utiliza dois ou mais corantes e diferencia dois tipos de organismos ou duas partes diferentes de um mesmo organismo. As colorações diferenciais mais comuns são a coloração de Gram, a coloração álcool-ácido-resistente de Ziehl-Neelsen e a coloração de esporos de Schaeffer-Fulton.
2.2. Coloração de Gram
A coloração de Gram, provavelmente a coloração diferencial que mais tem sido utilizada, foi desenvolvida pelo médico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884. Gram estava testando novos métodos de coloração de materiais de autópsia e biópsia quando percebeu que, com determinados métodos, algumas bactérias se coravam de forma diferente que os tecidos ao redor. Como resultado de seu experimento com corantes, foi desenvolvida uma coloração extremamente útil, a coloração de Gram (FIG. 1). Nela, as células bacterianas primeiramente absorvem o cristal violeta, e então acrescenta-se o iodo. O iodo age como um mordente, ou seja, uma substância química que ajuda na retenção do corante em determinadas células. Aquelas estruturas que não retêm o cristal violeta são descoradas por etanol a 95% ou por uma solução etanol-acetona; são então lavadas e coradas (contracoradas) com safranina.
As bactérias coradas pelo método de Gram são classificadas em dois grupos: as bactérias Gram-positivas, que retêm o corante cristal violeta e aparecem coradas em violeta-escuro; e as bactérias Gram-negativas, que perdem o cristal violeta quando tratadas com álcool. As bactérias Gram-negativas são coradas com o corante safranina e aparecem coradas em rosa/vermelho.
 Figura 1 – Método de coloração de Gram
 Fonte: Google Imagens
3. Materiais e Métodos
· Lâminas
· Culturas em meio sólido
· Alça de platina
· Cristal violeta
· Iodo
· Álcool etílico
· Safranina
· Lâminas coradas pelo método de Gram
· Microscópio óptico
· Óleo de imersão
Colocou-se uma gota de óleo de cedro sobre a lâmina e observou em objetiva de imersão (IOOX).
4. Procedimento Experimental
Coloração de Gram (método clássico)
1. Preparou-se um esfregaço fino, secou-se a temperatura ambiente e fixou-se pelo calor.
2. Cobriu-se o esfregaço seco e fixado com a solução de cristal violeta (corante) durante 1 minuto.
3. Esgotou-se a lâmina e cobriu-se com iodo durante (mordente) 1 minuto.
4. Inclinou-se a lâmina a 45° e lavou-se em água corrente.
5. Mantendo-se a inclinação, lavou-se com álcool 95° GL (diferenciador), por 20 segundos.
6. Lavou-se e depois cobriu-se a preparação com solução diluída de safranina (corante de contraste), de 15 a 30 segundos.
7. Lavou-se e secou-se entre duas fitas de papel filtro, delicadamente.
8. Colocou-se uma gota de óleo de cedro no centro do esfregaço.
9. Colocou-se a lâmina no microscópio, focalizou-se usando a objetiva de menor aumento, e, após focalizada usou-se a objetiva de imersão (100x).
5. Resultados e Discussão
Tabela 1 – Identificação do tipo de Gram
	Soluções
	Gram +
	Gram -
	Cristal Violeta
	violeta
	violeta
	Iodo
	violeta
	violeta
	Álcool Etílico
	Desidratação da parede celular; diminuição da porosidade e da permeabilidade; permanece violeta
	Extração dos lipídeos da parede celular e aumento da porosidade. Houve descoloração.
	Safranina
	A célula não é afetada, permanece violeta.
	A célula adquire o corante, tornando-se rosa/vermelha.
Fonte: Laboratório de Microbiologia do UNIFOR - MG
Após análises microscópicas, foi identificada o tipo de Gram através da forma, arranjo e principalmente a parede celular das bactérias analisadas.
Encontrou-se uma bactéria com forma de bacilo (bastonete). Como arranjo, identificou-se bacilos isolados e estreptobacilos (agrupados em cadeia). E, como fator principal, foi identificada uma parede mais complexa, composta por uma fina camada de peptideoglicano, e externamente por lipoproteína, membrana externa (característica das bactérias Gram Negativas).
Devido a fina camada de peptídeoglicano, essas bactérias não retém o cristal violeta, mas são coloridas pelo corante de contraste, a safranina, onde adquiri-se uma coloração rosa/vermelho (Tabela 1).
Após diversas análises experimentais, tem-se como resultado final uma bactéria Gram Negativa, apresentando-se coloração rosa.
6. Conclusão
Com o experimento realizado foi observada a quantidade de bactérias presentes em uma calça jeans, e através da inoculação dessas em meio de cultura PCA foi possível a realização da coloração das mesmas, para uma identificação mais precisa .
Foi identificada uma bactéria do tipo Gram Negativa, devido a camada externa característica desse grupo e a fina camada de peptideoglicano, a qual não retém o cristal violeta e apresenta coloração rosa (FIG. 2) característico da absorção da safranina.
Figura 2 – Bactéria Gram Negativa
Fonte: Google Imagens
7. Referências
BLACK, Jacquelyn G. Microbiologia: fundamentos e perspectivas. 4.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2013. p. 60-63.
JR, Michael J. Pelczar; CHAN, E.C.S.; KRIEG, Noel R. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2. ed. São Paulo: Pearson Education do Brasil, 2005. p. 89- 90.
MURRAY, Patrick R.; ROSENTHAL, Ken S.; PFALLER, Michael A. Microbiologia Médica. Tradução da 5. ed. Rio de Janeiro: Elsevier Editora Ltda. Disponível em: <https://books.google.com.br/books?hl=pt-BR&lr=&id=gkn5wMuAJQEC&oi=fnd&pg=PA1&dq=colora%C3%A7%C3%A3o+de+gram+artigo+cientifico&ots=7i75CxOMwa&sig=u8baef0vsgI4r9aXQVqnDNu_LwA#v=onepage&q&f=false>. Data de acesso: 05 de nov. de 2015.