Aula 09 Reação em Cadeia da Polimerase

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PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
Docente: Dyego Miranda
Como acontece a replicação nos seres vivos?
Dentro da célula
DNA
DNA Polimerease
+
dNTP’s, enzimas, energia...
A ideia!
Kary Mullis - 1983
Recriar o processo de replicação in vitro
Publicou em 1985
Ganhou o Prêmio Nobel da Química em 1993
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Como funciona?
Após a extração do DNA, todo o genoma (todos os genes) foi extraído (incluindo DNA mitocondrial);
Nosso objetivo será, por exemplo, estudar apenas 1 gene.
Como funciona?
DNA (todos os genes)
Tampão de reação (pH)
dNTP’s (Nucleotídeos A C T G)
Polimerase (Taq Polimerase)
MgCl2 (íon usado pela Taq)
Primers
Como funciona?
in vivo
A enzima helicase rompe as pontes de hidrogênio
DNA polimerase promove a replicação do DNA
in vitro
A calor rompe as pontes de hidrogênio
Taq polimerase promove a replicação do DNA
Vários ciclos de aumento e diminuição de temperatura, promove a replicação do DNA (amplificação)
Desnaturação
Anelamento
Extensão
A reação
Termociclador
Definição
 PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma técnica que amplifica uma sequência específica de DNA, como objetivo de torná-la abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular.
Vantagens da principal ferramenta em estudos com Biologia Molecular
Quantidades mínimas necessárias para o procedimento;
Obtenção de uma grande quantidade de produto;
Amostra nem sempre puras;
Capacidade de amplificar uma única moléculoa de DNA ou RNA;
Ferramenta importante para Biotecnologia;
Baixo custo.
Componentes
TaqPolimerase: Possui capacidade de resistir a altas temperaturas sem perder sua função
MgCl2: A Taq funciona apenas na presença desse íon, pois o mesmo se liga a Taq para ativá-la
Tampão de reação: Ajuda a manter o pH constante para a atividade da Taq
dNTPs: Nucleotídeos livres que serão incorporados pela TaqPolimerase durante o processo de replicação da sequência-alvo
Primers: Pequenas sequências de DNA, que se paream especificamente a sequência-alvo de interesse para a análise
DNA: Vai conter a sequência-alvo de interesse, que servirá de molde para o pareamento específico dos primers.
H2O ultra-pura: Serve para diluir a mistura
Componentes
Todos os componentes da reação obedecem uma concentração ótima para uma reação eficiente;
Alguns erros podem ocorrer, prejudicando a reação;
Taq Polimerase não estocada em temperaturas baixas;
Erro de pipetagem;
Contaminação por DNA externo;
Temperaturas de ciclagem errada;
Primers não-específicos
PCR em tempo real (qRT-PCR)
Real-time PCR
Quantifica as amostras ao mesmo tempo que amplifica o DNA em cada ciclo
RT-PCR: Transcriptase Reversa
RT-PCR: Reverse Transcription PCR
Quando nós precisamos analisar a expressão de um gene, utilizamos a PCR de transcrição reversa
cDNA
Gene
Transcrição
Transcrição
Reversa
RT-PCR
PCR
Amplificação
In vivo
In vitro
Aplicações
Identificação humana (Ciências Forenses);
Identificação de espécies;
Determinação de mutações;
Estudos evolutivos (paleontologia, estudo de populações, hereditariedade, história, etc.);
Biotecnologia (clonagem, transgênicos, etc.);
Diagnóstico de doenças por patógenos;
Susceptibilidade genética;
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