Cromatografia em camada delgada

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Cromatografia em Camada 
Delgada
Discentes: Daniely de Godoy Silva
Germano Blaquez Junior
Gislaine Ap. da Cunha
Docentes: Profº. Drº José Eduardo de Oliveira
Profª Amanda Coelho Danuello
Histórico da Cromatografia em 
Camada Delgada
BEYERINCK em 1889 usou sólidos em camada delgada 
sobre vidro, para o desenvolvimento circular de misturas 
de sais inorgânicos.
Em 1938 IZMAILOV e SCHRAIBER reintroduziram a 
Cromatografia em Camada Delgada, para análise de 
produtos farmacêuticos, mas não foi muito usada até o 
desenvolvimento, por KIRCHNER do método de aderir os 
sólidos ao suporte.
Em 1956 atingiu grande desenvolvimento, pelo método 
de preparar as placas com reprodutibilidade por STAHL.
Cromatografia :
Método físico-químico de separação dos componentes de uma 
mistura, realizada através da distribuição destes componentes 
entre duas fases, que estão em contato íntimo.Uma das fases 
permanece estacionária enquanto a outra move-se através dela.
Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os 
componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de 
tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido 
pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais 
destes componentes. 
Cromatografia
Planar Coluna
Líquido LíquidoGás
Líquido Fase 
ligada
Sólido Líquido LíquidoSólido Fase 
ligada
CP CCD CCD
CGL CGS CGFL CLL
Sólido
CLS CE
Fase 
ligada
CLFLCTI CB
Critério de classificação
Técnica
Fase Móvel
Fase 
Estacionária
Tipo de 
cromatografia
Cromatografia GasosaCromatografia Gasosa (CG): 
(aplicada a compostos orgânicos voláteis).
•A fase móvel é um gás
•A fase estacionária é frequentemente um líquido
de alto p.e. sobre um suporte sólido ou um 
adsorvente sólido
Métodos cromatográficos
Cromatografia Líquida em 
Coluna Clássica
Cromatografia Líquida em coluna clássica (CCC) 
(utilizada para separar analitos em solução, incluindo
íons) metálicos e compostos orgânicos). 
•A fase móvel é um solvente
•A fase estacionária é um líquido sobre um suporte
sólido, um sólido ou uma resina de troca iônica, etc. 
Algodão
Disco de 
papel 
filtro
Cromatografia Líquida de Alta 
Eficiência
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLAE) 
(uma variação da cromatografia líquida que
utiliza bombas de alta pressão para aumentar
a eficiência das separações) 
. SOLVENTES
BOMBA
INJETOR COLUNA
DETETOR COLETOR
DESCARTE
Outra Classificação
Fase Normal 
Polaridade: FE > FM
FE utilizada : Sílica G
Fase Reversa
Polaridade: FE < FM
FE utilizada: Sílica C18
CromatografiaCromatografia emem CamadaCamada
DelgadaDelgada
Consiste na separação de uma mistura através
da migração de seus componentes sobre uma
camada delgada de adsorvente (fase
estacionária) retido sobre uma superfície plana, 
geralmente placas de vidro. Isso acontece devido
a processos de adsorção. Após ocorrido o 
processo, a placa passa a se chamar
cromatograma.
Fase Estacionária (FE): Contém o adsorvente
Fase Móvel (FM): Contém o solvente
Mecanismos
Adsorção Partição Exclusão
Líquido/gás sólido
Líquido sólido
+
+
+ -
-
Líquido/gás líquido Líquido/gás gel/sólido
INTERAÇÕES INTERMOLECULARES
Iônicas
Ponte de Hidrogênio
van der Waals Keeson (dipolo/dipolo)
Debye (dipolo/dipolo induzido)
London (dipolo induzido/dipolo 
induzido) 
Troca Iônica
Aplicações:
9 Identificação de compostos orgânicos com pontos de fusão 
próximos;
9Estudos preliminares da complexidade dos componentes de um 
extrato orgânico;
9Investigação de: Casos de envenenamento; ingestão de 
estimulantes por atletas;
9 Estudos de reações : presença de intermediários estáveis;
9Análise da pureza de compostos;
9Análise da eficiência de: destilação e cristalização
Vantagens da Cromatografia em Camada Delgada
a. Maior rapidez;
b. Menor trajeto da fase móvel ;
c. Boa resolução;
d. Alta sensibilidade;
e. Manchas em geral menos difusas;
f. Possibilidade, quase sempre, de emprego de reagentes de 
detecção corrosivos;
g. Baixo custo;
h. Facilidade de raspar a camada, com espátula fina ou com 
uma lâmina para microscopia, para recuperar, por eluição o 
conteúdo de uma mancha ou de uma banda;
ADSORVENTES UTILIZADOS EM CCD
Adsorvente: termo geral para Fase Estacionária
Atividade dos adsorventes varia em função da quantidade de água presentes 
no mesmos. Quanto menor o teor de água, maior será a sua atividade, isto é, 
maior sua afinidade para com as substâncias a separar. A atividade depende, 
pois, da temperatura e do tempo de aquecimento a que é submetido o 
adsorvente.
Na prática, as cromatoplacas, após sua ativação, devem ser utilizadas logo a 
seguir, ou então conservadas em dessecadores de dimensões apropriadas, 
para que não tenham seu grau de atividade diminuído, por adsorção de água 
do ambiente.
Exemplos de adsorventes:
¾Sílica-Gel ou àcido Silícico;
¾Óxido de alumínio ou alumina;
¾Celulose;
¾Kieselgur; 
¾Poliamida;
Sílica gel ou Ácido silícico
Mecanismo de adsorção:
-Si-OH: Interações polares por ponte de hidrogênio, como doador ou aceptor de H.
-Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo ou dipolo/dipolo induzido
SiO O Si
O
O O
O
OH
Mais usada na CCD
Substância porosa e amorfa.
Apresenta caráter ácido.
Possui característica polar, devido à presença de 
grupos hidroxilas denominados silanóis. Deve 
apresentar número de hidroxilas razoável para ser 
seletivo na separação de substâncias de diferentes 
polaridades
Tratamento térmico→ eliminação de água ( temperatura recomendada para a sua ativação de 
105 a 110ºC)
Caracterização do tipo básico de sílica gel :
G: adição de sulfato de cálcio, gipsita, (aglutinante);
H: indica ausência de aglutinante;
F: indica adição de substâncias fluorescentes;
P: indica adsorvente para uso preparativo;
R: indica adsorvente de alto grau de pureza;
Preparação: 30g de sílica com 60-70 mLde água = 5 placas de 20x20cm com espessura de 0,3 
mm
CUIDADO! A aspiração da sílica causa 
silicose, um tipo de inflamação 
pulmonar crônica!
Alumina ou Óxido de Alumínio
Segundo adsorvente mais empregado em CCD;
Há três grupos deste adsorvente:
A ativação da alumina faz-se,após secagem ao ar durante cerca de 2 h, pelo 
aquecimento em estufa a 120ºC por 60 min.
A alumina é caracterizada pelo diâmetro dos poros dos grânulos.
Tipo E: apresenta superfície específica de 120 – 180 m2. g-1.
Tipo T: apresenta superfície específica de 60 – 90 m2. g-1.
Preparação: 5 placas de 20x20 cm e espessura de 0,3 mm, recomenda-se a 
utilização de uma suspensão de 30 g de alumina em 40 mL de água destilada. 
O Al
AlO
ClAlCH3
Cl
CH3
Cl
ÁCIDA
pH 4,0
O Al
AlO
ONaAlCH3
ONa
CH3
ONa
BÁSICA
pH 9,0
O Al
2+
AlO
AlCH3 O NEUTRA
pH 7,0
Mecanismo de adsorção:
Al3+: campo positivo favorece interação com moléculas polarizáveis ( sistemas conjugados)
O2-: sítios básicos favorecem a interação com doadores de H+
Celulose
Existem dois tipos de celulose empregadas em 
CCD: a nativa ( celulose fibrosa) e a celulose 
microcristalina.
Existem ainda as celuloses quimicamente tratadas 
aplicadas na CCD: 
Tipos:
CM-celulose ( carboximetilcelulose) → trocador iônico fraco;
DEAE-celulose (dietilaminoetilcelulose) → trocador aniônico básico forte;
ECTEOLA-celulose (mistura alcalina, trietanolamina e epicloridrina→ trocador aniônico 
básico fraco;
PEI-celulose (polietilenimina) → trocador iônico básico forte;
Celulose fosforilada→ trocador catiônico forte;
Celulose microcristalina constitui-se em excelente material para separação de 
substânciasorgânicas hidrofílicas.
Mecanismo: Partição ou troca iônica.
Preparação: 5 placas de 20 x 20 cm, mistura-se 25 g de celulose com 90 mL de água 
destilada, agitando-se por 2 min, antes de colocar na placa de vidro.
Kieselgur ou terra de diatomáceas
É um tipo de ácido silícico oriundo de carapaças de diatomáceas fósseis.
Comparado a sílica e alumina é menos adsorvente e com menor poder 
de resolução.
Pode ser adicionado à sílica para diminuir seu poder adsorvente.
Apresenta baixa atividade
Tipos:
Com aglutinantes;
Sem aglutinantes;
Mecanismo: Partição
Preparação: 30g do adsorvente com 60-70 mLde água = 5 placas de 
20x20cm com espessura de 0,3 mm
Poliamida
Separação de fenóis e ácidos carboxílicos
A separação depende da intesindade das forças decorrentes das ligações de 
hidrogênio com o analito.
Baixa aderência ao vidro: dificuldade de preparação da placas
Tipos:
11 – ácido poliaminoundecanóico (Nylon 11) 
6 – aminopolicaprolactama (Perlon)
6.6 – poli-hexametildiaminamonoadipato
Poliamida acetilada
Preparação:
15g em 60 mL de metanol = 5 placas (20 x 20 x 0,03 cm)
Técnica Geral
Escolha da fase estacionária;
Preparação das placas cromatográficas;
Ativação das placas cromatográficas;
Seleção da fase móvel;
Aplicação das amostras nas cromatoplacas;
Preparação da cuba cromatográfica e desenvolvimento do 
cromatograma;
Revelação dos cromatogramas;
Documentação;
Calculo do fator de retenção Rf;
Escolha da fase estacionária 
Liofilicidade e liofobicidade
Interação com os componentes (polaridade)
Necessidade de aditivos 
Aglutinantes
Substâncias fluorescentes
Capacidade adsorvedora
Preparação da placas
As placas devem ser: resistentes, inertes aos reagentes e solventes, resistentes à
temperatura e uniformes.
Procedimentos para a preparação das placas
Limpeza da placa de vidro→ detergente e água corrente (eliminação de gordura);
Secagem→ em estufa
Preparação das camadas finas dos adsorventes:
Utilização de espalhadores ( mais empregada);
Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do 
adsorvente apropriado.
Dificuldades: Obtenção de solução com viscosidade adequada.
Placas pré fabricadas: Dispensam a fase de preparação; são mais uniformes e 
homogêneas, melhorando a separação e tornando os valores de Rf mais reprodutíveis.
Riscar as placas, 
determinando a altura 
de ínicio e fim da 
cromatografia
Ativação das placas 
Objetivo: retirar substâncias interferentes e 
eliminar água 
Metodologia : Varia de uma adsorvente para outro.
Exemplo : Sílica e alumina ⇒ estufa 105 – 110 ºC por 30 –
60 min; 
Celulose ⇒ estufa 105ºC por 10 min;
Seleção da fase móvel 
Depende: natureza química das substâncias a serem separadas e polaridade da fase 
móvel.
Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por adsorção: levar em conta a 
natureza da fase móvel, da fase estacionária e do soluto. Assim, para solutos muito 
polares deve-se utilizar um adsorvente de baixa atividade e uma fase móvel de grande 
poder eluente.
Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por partição: Realizada com os 
adsorventes celulose microcristalina e kieselgur, constitui um processo de separação 
que depende das diferenças de solubilidade dos componentes das amostras, nas fases 
estacionária e móvel e na imiscibilidade dessas fases.
Aplicação das amostras 
A amostra A amostra éé aplicada na forma de soluaplicada na forma de soluçção 0,1 ão 0,1 –– 1%,dependendo 1%,dependendo 
da sensibilidade do revelador, usando solventes mais volda sensibilidade do revelador, usando solventes mais volááteis teis 
posspossííveis.veis.
AplicaAplica--se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos 
capilares.capilares.
As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm da parte As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm da parte 
inferior da placa, afim de que essas não entrem em contato diretinferior da placa, afim de que essas não entrem em contato direto o 
com o solvente durante o desenvolvimento do com o solvente durante o desenvolvimento do cromatogramacromatograma..
Alinhamento horizontal uniforme.Alinhamento horizontal uniforme.
Preparação da cuba 
A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar 
evaporaevaporaçção) e verticalmente, apão) e verticalmente, apóós aplicadas as amostras, numa s aplicadas as amostras, numa 
cuba de vidro contendo a fase mcuba de vidro contendo a fase móóvel desejada. A cuba deve estar vel desejada. A cuba deve estar 
saturada com vapor de fase msaturada com vapor de fase móóvel para que o cromatograma se vel para que o cromatograma se 
desenvolva regularmente. Para isso, colocadesenvolva regularmente. Para isso, coloca--se papel de filtro na se papel de filtro na 
cuba, que ajuda na evaporacuba, que ajuda na evaporaçção e na conseqão e na conseqüüente saturaente saturaçção. A ão. A 
cuba deve ser dotada tampa esmeriladas de forma a vedcuba deve ser dotada tampa esmeriladas de forma a vedáá--la la 
hermeticamente, garantindo uma boa saturahermeticamente, garantindo uma boa saturaçção da atmosfera ão da atmosfera 
interna.interna.
Desenvolvimento de um cromatograma numa 
cuba
Procedimentos químicos, físicos, ou biológicos
aplicados ao cromatograma para tornar visível as manchas
das substâncias separadas por cromatografia. 
AA-- ProcedimentosProcedimentos FFíísicossicos: Luz ultravioleta (aromáticos ou
dupla ligação conjugada).
CC-- ProcedimentosProcedimentos BiolBiolóógicosgicos e e EnzimEnzimááticosticos: Antibióticos, 
Enzimas e Substratos. 
DD-- ProcedimentosProcedimentos QuQuíímicosmicos: Aplicação de um reativo
químico para formar um derivado colorido ou fluorescente.
Revelação dos cromatogramas
Reveladores Físicos
RadiaRadiaçção ultravioleta para compostos fluorescentes.ão ultravioleta para compostos fluorescentes.
Ex: clorofila.Ex: clorofila.
Reveladores Químicos
Consiste em utilizar reveladores quConsiste em utilizar reveladores quíímicos que, em contato com micos que, em contato com 
as substâncias da amostra, as tornam coloridas e visas substâncias da amostra, as tornam coloridas e visííveis.veis.
Tipos de reveladores quTipos de reveladores quíímicos micos 
AlcalAlcalóóides:ides: DragendorffDragendorff, , iodoplatinatoiodoplatinato
FlavonFlavonóóidesides:: NPNP--PEGPEG
Anti-oxidantes: ββ--carotenocaroteno
SaponinasSaponinas, terpenos e , terpenos e esteresteróóidesides:: anisaldeanisaldeíídodo sulfsulfúúricorico
AntraquinonasAntraquinonas e e cumarinascumarinas:: vapor de amôniavapor de amônia
FenFenóólicos, licos, saponinassaponinas e e terpenterpenóóidesides:: vapor de iodo e soluvapor de iodo e soluçção de ão de 
CeSOCeSO44
Compostos fenCompostos fenóólicos:licos: FeClFeCl33
Reveladores Biológicos
UtilizaUtiliza--se rease reaçções enzimões enzimááticas ou bacterianas para ticas ou bacterianas para 
tornar a mancha vistornar a mancha visíível.vel.
Ex.: para testar se uma amostra contEx.: para testar se uma amostra contéém substância m substância antianti--
ffúúngicangica, revela, revela--se o se o cromatogramacromatograma com esporos de com esporos de 
fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas 
substâncias.substâncias.
Fator de Retenção Rf (Relation front ou Rate 
factor)
Rf = distância percorrida pela substância / distância percorrida pela fase 
móvel.
Os valores Rf variam entre 0 e 1 e são dados com dois algarismos após a 
vírgula.
d
r
1
d
m
d
r
2
Ws1
Linha de chegada da FM
Profundidade da FM
Ponto de partida da amostra
Ws2
•• FartorFartor de de RetenRetenççãoão ((RRff):):
•
• Rf = dr / dm 
••• ResoluResoluççãoão ((RRss):):
•
• Rs = 2(dr1 – dr2) / (Ws1 + Ws2) 
•
•• EficiênciaEficiência::
•
• n = 16 (dr – Ws)2
ParâmetrosParâmetros UtilizadosUtilizados nana CromatografiaCromatografia PlanarPlanar
Desvantagens da CCD
DifDifíícil reprodutibilidade:cil reprodutibilidade:
quantidade de amostra aplicada quantidade de amostra aplicada 
obtenobtençção de ão de cromatoplacascromatoplacas com caractercom caracteríísticas idênticas.sticas idênticas.
Baixa sensibilidade:Baixa sensibilidade:
detecdetecçção ão 
difusão da amostradifusão da amostra
DifDifíícil determinacil determinaçção exata do ão exata do RfRf..
Constantes Físicas
Bibliografia
••COLLINS, Carol H. COLLINS, Carol H. etet al, introdual, introduçção a mão a méétodos cromatogrtodos cromatográáficos, 6ficos, 6ªª eded, ed. , ed. 
Unicamp,Campinas,1995.Unicamp,Campinas,1995.
••NETTO, J. Z., CAZETTA, J. O. Cromatografia Plana, NETTO, J. Z., CAZETTA, J. O. Cromatografia Plana, FunepFunep, Jaboticabal, 2005 , Jaboticabal, 2005 
••THE MERCK INDEX, 13th, ed. THE MERCK INDEX, 13th, ed. MerckMerck & CO., Inc., Usa, 2001.& CO., Inc., Usa, 2001.
Tabela de constantes físicas e Toxicidade 
 
 
Substância Densidade/ g.mL-1 p.f/ºC p.e./ºC
M.M/ 
g.mol-1
Fórmula 
molecular Toxicidade 
Etanol 0,789 -114,1 78,4 46,07 C2H5OH 
Causa náusea, 
vômito e depressão
Ácido acético 1,049 16,7 118 60,05 C2H4O2
Se ingerido causa 
vômito, diarréia e 
colapso circulatório
Diclorometano 1,326 -25 39,75 84,93 CH2Cl2
Causa fadiga, 
náusea, irritação 
nos olhos e cabeça 
1,2 -
dicloroetano 1,257 -40 83-84 98,96 C2H4Cl2
Depressão do 
sistema nervoso 
central 
Aspirina 1,40 135 - 180,16 C9H8O4
Náusea, vomito e 
irritação 
Acetaminofenol 1,293 170,5 - 151,16 C8H9NO2 [Anti-térmico] 
Cafeína 1,23 238 - 194,19 C8H10N4O2
Estimulante do 
sistema nervoso 
central 
Acetato de Etila 0,902 -83 77 88,10 C4H8O2
Irritação nos olhos, 
pele, nariz e 
garganta. 
Ácido 
Acetilsalicílico - 152 - 300,26 C16H12O6 [Anti-térmico] 
Metanol 0,7866 -97,8 64,7 32,04 CH4O 
Dermatite, dor de 
cabeça, náusea, 
vômitos, anorexia 
 
Fluxograma 
 
Análise Cromatográfica em Camada Delgada 
Determinação dos Rf dos padrões: 
 
 
 
 
 - Transferir a solução para uma cuba 
 cromatográfica até atingir 1,5 cm de 
 altura 
 - Colocar uma folha de papel de filtro 
 da altura da cuba e deixar saturar até 
 que toda a folha esteja umedecida 
 com a fase móvel 
 
 
 
 
 
 
 
 Aplicar cada solução no centro de cada coluna (a 2 cm da base) 
 
 
 - Colocar dentro da cuba e esperar a fase móvel atingir o limite traçado 
 
 
 - Revelar com UV 
 - Revelar numa cuba com vapores de iodo 
 
 
Solução de 1,2 dicloroetano e ácido acético 
12:1 
ó
Cuba 
Saturada 
0,1g de cafeína 
0,1g de ácido acetilsalicílico 
 0,1g de acetoaminofen 
- Adicionar em cada tubo de ensaio 5,0 
mL de etanol e diclorometano (1:1) 
- Aquecer rapidamente em banho-
maria, evitando a perda de solvente 
Soluções 
Padrão 
Mistura de 
referência 
- Num outro tubo de ensaio pipetar 1 
mL de cada solução padrão 
- Agitar bem e homogeneizar a solução 
Placa de vidro 
(com sílica) 
Placa riscada 
- Riscar a placa 
em 4 colunas 
- Ativar a placa 
em estufa a 
110ºC por 10 
Placa ativada 
Placa aplicada
Cromatograma padrão revelado 
Cromatograma padrão
Cálculo dos fatores de retenção dos padrões 
Análise de Analgésicos 
 
 
 
 
 
 - Triturar 
 - Transferir para 3 béqueres de 10 mL 
 - Adicionar 5 mL de etanol/diclorometano 1:1 
 - Dissolver [banho-maria] 
 
 
 
 - Aplicar cada solução em cada coluna da placa 
 juntamente com a MISTURA PADRÃO 
 
 
 - Eluir na cuba 
 
 
 
 
 - Revelar em UV e em iodo 
 
 
 
 
 
 - Medir Rf 
3 comprimidos 
(Amostras) 
Soluções das 
amostras 
Placa aplicada
Cromatograma 
Cromatograma 
revelado 
Determinação 
das amostras 
 
 
 
 
 
	Apresentação cromatografia camada delgada
	Tabela de constantes físicas e Toxicidade
	Fluxograma