5.4 PCR de Colônia

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR
LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR
DISCIPLINA: BIOLOGIA MOLECULAR I
GUIA DE AULA PRÁTICA
Utilização da Técnica de Reação em Cadeia com Polimerase (PCR)
1 - INTRODUÇÃO
	Até o final da década de 80 as técnicas de Biologia Molecular estavam limitadas pela sensibilidade de métodos de clonagem e detecção. Estes métodos dependiam da marcação isotópicas de sondas de DNA capazes de detectar quantidades ínfimas de fragmentos gênicos. Foi então que na virada da década, uma técnica de concepção simples mas que até esta época era tida como inviável devido a problemas de execução prática, teve a sua utilização popularizada. Nos últimos cinco anos a utilização da técnica do PCR tem tomado proporção universal na Biologia Molecular e áreas afins, tornando-se uma metodologia rápida, prática e de aplicação generalizada. Hoje com a quantidade de métodos que exploram o princípio do PCR, é possível dizer que esta técnica tem aplicação ilimitada tornando-se imprescindível a qualquer grupo de pesquisa na área.
	O princípio do método baseia-se no enrequecimento de um dado fragmento de DNA de forma exponencial, utilizando-se uma reação em cadeia. Em cada estágio da reação cada fita do fragmento de DNA duplex dá origem a uma fita complementar, em um processo de replicação. Desta forma cada fragmento duplex dá origem a dois fragmentos duplex. Repetindo-se a reação por um número grande de estágios ou ciclos, é possível a amplificação de sequências de DNA que se encontram em pequenas quantidades. O racional do processo consiste em vários passos repetitivos onde o DNA duplex é inicialmente desnaturado a cerca de 95(C; resfriado a uma temperatura de reanelamento onde o DNA alvo é reconhecido por um oligonucleotídeo complementar, que é utilizado como primer para a reação de polimerização; e finalmente a temperatura é elevada até ao ótimo da DNA polimerase utilizada, ocorrendo assim a replicação do DNA simplex a partir do primer. A participação de um par de primers específicos para a região do DNA a ser amplificada é essencial, e são eles que delimitam o fragmento amplificado e perfazendo a porção 5’ do fragmento amplificado.
	A amplificação eficiente de DNA dependente da ciclagem de templeratura para desnaturação, anelamento e polimerização. Este foi o principal problema técnico encontrado, pois as polimerases até então conhecidas perdiam a atividade enzimática rapidamnete a temperaturas elevadas como àquelas requeridas para a desnaturação. Portanto, esse método foi deixado de lado até que foram descobertas as enzimas termoestáveis isoladas de organismos termifílicos como bactérias nativas de fontes de águas quentes ou de chaminés vulcânicas do fundo do mar.
	O processo repetitivo de amplificação envolve a desnaturação do DNA; o anelamento dos primers; e a elongação de cada primer pela DNA polimerase. Em cada ciclo da reação o conteúdo de DNA alvo é duplicado, o que gera um processo de amplificação que tende ao exponencial, onde a quantidade de DNA resultante é 2n, sendo n o número de ciclos executados. Com isso, dependendo da escolha de primers específicos é possível criar condições que permitam a substituição de técnicas corriqueiras como a clonagem molecular, mutagênese sítio dirigida, até técnicas mais complexas como análise de polimorfismo genético ou o isolamento de DNA de fósseis.
PCR DE COLÔNIA - METODOLOGIA
Material necessário :
Oligonucleotideos sintéticos. PR e PF na concentração de 5 pmol/(l cada.
Desoxinucleotídeos trifosfatados. Mistura dos quatro dNTPs 2 mM cada.
Tampão de enzima 10X
MgCl2 20 mM
DNA polimerase de T. aquaticus 5U/(l
H2O miliQ
1 - Para preparar o DNA template ressuspenda parte de uma colônia em 100 (l de água. Usar 1 ou 2 (l da suspensão na reação de PCR.
2 – Calcular a concentração em pmol/(l dos primers PR e PF a partir dos seguintes dados:
PR – PM= 11.660,6; concentração 1 (g/(l.
PF – PM = 12.341,1; concentração de 1 (g/(l
Fazer a diluição para 200 (l de solução de trabalho de 5 pmol/(l. 
3 – A partir das soluções concentradas de dNTPs (100 mM cada), preparar 100 (l da solução de trabalho de 20 mM cada.
4 – A partir da solução de 50 mM de MgCl2, preparar 100 (l da solução de trabalho de 20 mM.
5 - Montar o sistema de reação conforme a tabela abaixo:
	
	Estoques
	
	
	DNA molde 
	1 a 2 (l
	
	
	Primer forward 10 pmol
	5 pmol/(l
	
	
	primer reverso 10 pmol
	5 pmol/(l
	
	
	dNTPs 200 nM
	2 mM
	
	
	tampão da enzima 1X
	10X
	
	
	MgCl2 2 mM
	20 mM
	
	
	H2O
	-
	
	
	Taq DNA polimerase 1U
	1,25 U/(l
	
	
	Volume final
	
	20 (l
	
Ao final adicionar algumas gotas de óleo mineral para evitar evaporação.
2 - Programar a máquina de termociclagem para os seguintes ciclos:
	95(C por 5 minuto
	30 ciclos de:	94(C por 2 minuto
			62(C por 90 segundos
			72(C por 2 minuto
	Polimerização final de 10 minutos a 72(C.
	levar a máquina para 4(C até a retirada dos tubos.
3 - Analisar as amostras por eletroforese em gel de agarose.