Relatório 7 bioquímica

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Faculdade de Engenharia de Alimentos
Unicamp- Universidade Estadual de Campinas
Relatório 7
Enzimas pectinolíticas
 
Caroline Mantovani Celegatti, 155008
Gabriella Stein Durazzo Monteiro dos Santos, 155526
Isabella Peressinoto Romero, 155808
Prof. Hélia Sato
TA 610 Transformações Bioquímicas em Alimentos
Turma B - Grupo 2
2º Semestre 2016
Campinas, 18 de outubro de 2016
1. INTRODUÇÃO
A utilização de enzimas em processos industriais tem aumentado consideravelmente nos últimos anos, especialmente nas indústrias de alimentos. Entre essas enzimas, destacam-se as enzimas pectinolíticas ou pectinases, que atuam sobre as substâncias pécticas, que fazem parte da composição da parede celular dos vegetais, provocando a sua despolimerização e desesterificação.
As enzimas pectinolíticas são produzidas por fungos filamentosos, bactérias, leveduras, plantas (GAINVORS et al., 1994; TSUYUMU et al., 1989), nematóides e insetos (PILNIK & ROMBOUTS). Pectinases correspondem a um grupo que atuam sobre as substâncias pécticas através de reações de hidrólise e de trans-eliminação, provocando a despolimerização das moléculas, e através de reações de desesterificação, hidrolisando a ligação éster entre os grupos carboxila e metil das pectinas (KASHYAP et al. 2001). Podem ser classificadas em dois grandes grupos, com base no seu substrato preferencial, as desmetoxilantes e despolimerisantes (ALKORTA et al., 1998).
O estudo das pectinases tem sido considerado de grande importância, em razão da aplicação nas indústrias que processam matéria-prima vegetal, para remoção de substâncias pécticas, as quais inviabilizam o produto desejado (GHILDYAL et al., 1981; WHITAKER, 1984).
É também aplicado na extração e clarificação de sucos de frutas, na produção de vinhos, na maceração de vegetais e frutas, e na extração de óleos essenciais. A pectina é responsável pela consistência e turbidez de sucos de frutas (ALKORTA et al., 1998), o que, em uma indústria de vinhos e sucos é um problema, causando um considerável aumento de viscosidade, dificultando processos de prensagem, filtração e concentração, diminuindo assim o rendimento do suco.
2. OBJETIVO
O objetivo da aula prática é verificar a atividade das enzimas pectinolíticas e suas aplicações em alimentos.
3. MATERIAL E MÉTODOS
ITEM I - Verificação da Clarificação do Suco de Uva Comercial
9mL de suco de uva foram pipetados em dois tubos de ensaio (15x159mm) numerados enzima e controle. 1mL mde enzima comercial pectinase 6% foi pipetado no tubo enzima e 1mL de água no tubo controle. Os tubos foram incubados a 45oC por 1 hora. 
Foi observado se houve clarificação no suco, colocando os tubos contra a luz. Se não houve, 8mL do suco foram transferidos para tubos de centrífuga, no qual foram centrifugados a 1000rpm por 10 minutos e o sobrenadante foi transferido para tubos de ensaio.
Foi verificado novamente se houve clarificação na amostra, e foi comparada com o tubo controle.
ITEM II - Determinação da Temperatura Ótima de Atividade da Pectinase Comercial
Foram distribuídos 2mL de suspensão de pectina cítrica em tampão acetato 0,05M pH 4,0 em 6 tubos de ensaio numerados. Cada tubo foi incubado a uma temperatura diferente (30, 40, 45, 50, 60 e 70ºC), por 10 minutos.
Foi adicionado 1mL de pectinase 0,2 % nos tubos de ensaio, misturando e continuando incubando nas diferentes temperaturas.
Foi verificado em qual tubo houve clarificação mais rápida, sem agitar os tubos. Foi verificado após 5, 10 e 20 minutos. Se ainda não clarificou, foi verificado após 1 hora ou 1 hora e 30 minutos.
ITEM III - Efeito da pectinase na extração de suco de maçã (Demonstrativo)
O item III foi preparado antes da aula prática pelos técnicos do laboratório. As maçãs foram cortadas em 4 partes e fervidas em água por 10 minutos. Em seguida a amostra foi peneirada para obtenção do purê. Amostras de 38 g de purê foram adicionadas em 2 tubos de centrífuga de 50 mL, numerados I e II.
No tubo I foi adicionado 1 mL de solução de pectinase 25% e misturado por inversão. No tubo II (controle) foi adicionado 1 mL de água destilada e misturado por inversão.Os tubos de centrífuga foram incubados em banho-maria 40oC por 1hora e 30 minutos com agitação periódica por inversão. Os tubos de centrífuga foram incubados em banho-maria 40oC por 1hora e 30 minutos com agitação periódica por inversão.
Os tubos teste e controle foram retirados do banho maria e colocados em tubos metálicos de centrífuga. A mesma massa dos conjuntos foi ajustada, colocando água destilada entre o tubo de centrífuga e o metálico, que foram centrifugados a 3000rpm por 10 minutos.
Os sobrenadantes foram decantados em provetas de 50 ou 100mL e o volume de suco foi medido.
ITEM IV - Verificar os resultados dos testes de aplicação da pectinase comercial (Multifect) na remoção do albedo de frutas cítricas
Foi verificado os resultados dos testes de aplicação da pectinase comercial na remoção do albedo das frutas cítricas, anotando em qual amostra o albedo foi retirado totalmente, em qual a superfície estava macerada, em qual ocorreu hidrólise extensiva e qual permaneceu sem alterações.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Tabela 1. Determinação da Temperatura Otíma de Atividade de pectinase comercial 
	Temperatura
	30oC
	40oC
	45OC
	50oC
	60oC
	70oC
	Tempo
	1h30
	1h
	1h
	20min
	20min
	20min
Tabela 2. Aspecto e composição de sucos de fruta comerciais
	Tipo de suco
	Aspecto do suco
	Composição
	Suco de uva branco integral
	Formação de alguns precipitados, um pouco turvo, homogêneo
	Suco natural de uva e conservador INS220
	Suco de uva branco integral
	Não turvo, homogêneo, sem separação de fase
	Suco de uva branca e conservantes INS202 e 220
	Concentrado líquido para refresco de fruta (uva)
	Homogêneo, sem separação de fase
	Água, suco concentrado de uva, aroma naturaç, conservador, corante natural e ácido cítrico
	Suco de uva Integral sem açúcar
	Sem separação de fases, homogêneo e turvo
	Uva isabel
	Suco de caju integral sem açúcar
	Turvo, não homogêneo, tem separação de fase
	Suco de caju com alto teor de polpa, acidulante, ácido cítrico, conservante INS223 e 222
	Concentrado para refresco de fruta (abacaxi)
	Turvo com um precipitado
	Suco integral de abacaxi, água, suco concentrado de abacaxi, acidulante, ácido cítrico, estabilizante goma xantana
	Suco de manga maguary original
	Turvo e homogêneo
	Polpa de manga, água, acidulante, ácido cítrico, estabilizante: goma xantana, aromatizante, conservadores: benzoato de sódio, metabissulfito de sódio, antiespumante: polidimetilcicloxano
	Suco de maçã integral
	Turvo com separação de fases
	Maçã de variedades Fuji + gala
	Suco de cajuína tradicional
	Homogêneo
	Suco de caju integral, filtrado e tratado termicamente
	Suco de tomate temperado
	Separação de fases
	Suco de tomate integral, sal e aroma natural de páprica
	Caju maguary original
	Turvo e homogêneo
	Suco integral de caju
	Pêssego maguary original
	Turvo e homogêneo
	-
Efeito da pectinase na extração de suco de maçã
O tubo I apresentou maior rendimento de suco de maçã por utilizar no processamento uma solução de pectinase 25%, já no tubo II foi observado menor rendimento, pois a amostra foi apenas tratada com água destilada. As enzimas pectinolíticas degradam os componentes de alto peso molecular da parede celular dos frutos, tais como celulose e pectina, apresentando um maior rendimento para sucos, como ocorrido nas amostras de purê de maçã tratada com solução de pectinase. Estudos de Teixeira (2011) também revela que uma maior concentração de enzima utilizada se relaciona com uma maior quantidade de substrato degradado, aumento consequentemente, o rendimento do produto analisado. 
Em produtos de frutas, as enzimas têm sido utilizadas para os seguintes propósitos: quebram as cadeias poliméricas de carboidratos, tais como pectinas, hemiceluloses e amidos, aumentando assim o rendimento do suco; melhoramo rendimento de substâncias contidas no fruto (ácidos, substâncias que conferem aroma e cor); clarificam os sucos; liquefazem completamente o fruto, aumentando o rendimento em polpa (Yusof & Ibrahim, 1994). 
Aplicação de enzimas pectinases na preparação de café solúvel
Pectinases são importantes na fermentação de café e chá, pois aceleram o processo de fermentação , melhorando a qualidade do produto final. Enzimas pécticas são adicionadas para remover a camada de mucilagem do grão, constituída de três quartos de substâncias pécticas. Celulases e hemicelulases, presentes em preparações comerciais, são aspergidas nos grãos, acelerando o processo de fermentação. Como o tratamento dos grãos de café em larga escala com enzimas comerciais é custoso e não econômico, são utilizadas enzimas pécticas microbianas obtidas da fermentação de resíduos da mucilagem (KAYSHAP et al., 2001; SILVA et al., 2000). 
Efeitos das polimetilgalacturonase, poligalacturonase, pectinametilesterase, hemicelulase e celulases para aumentar extrato suco de maçã
Em sucos clarificados, como no de maçã, as pectinases são utilizadas na separação de partículas sedimentáveis, na filtração ou centrifugação. As vantagens do uso de pectinases em sucos incluem: utilização em diversos tipos de produtos, isto é, sucos clarificados, não clarificados, concentrados, polpas, purês etc.; redução do tempo total para extração do suco em relação aos processos clássicos, auxiliam na produção de sucos e concentrados estáveis com redução de resíduos da polpa; custos de produção reduzidos e possibilidade de processamento de diferentes frutas (KAYSHAP et al., 2001). Para o exemplo concreto dos sucos concentrados de pera e maçã, as enzimas dominantes no tratamento enzimático efetuado são as pectinases e as amilases. O seu efeito combinado permite chegar a um sumo livre de amido e polissacarídeos pécticos com cadeias longas, os compostos mais frequentemente associadas a complicações na clarificação e turbidez (REBOLEIRA, 2015). 
 	Em produtos da maçã, como o suco e a sidra, os fenóis têm apresentado considerável interesse devido sua influência nas características sensoriais, como na cor, sabores amargos e adstringentes e na formação de certos aromas. Atualmente, o interesse sobre os compostos fenólicos reside na sua capacidade antioxidante, que contribui para a proteção contra os efeitos prejudiciais ocasionados pelo estresse oxidativo sobre a saúde. Contudo, durante o processamento das maçãs ocorrem grandes perdas de compostos fenólicos pela oxidação, por uma incompleta extração dos tecidos da fruta e na clarificação do suco (NOGUEIRA et al., 2003). A extração do suco de maçãs envolve as operações de trituração e prensagem das frutas. Para melhorar o rendimento em suco obtido na prensagem podem ser adicionadas ao triturado, pectinases e celulases (Shahidi & Naczk, 1995). A utilização de enzimas de liquefação proporcionam um aumento na extração de compostos fenólicos em aproximadamente duas vezes a mais no suco, uma vez que os polifenóis procianidina B2, catequinas e epicatequinas, quercetinas e floredzinas podem estar associados à parede celular (NOGUEIRA et al., 2003).
As enzimas pécticas são classificadas em pectinesterase e despolimerase, sendo que esta última é subdividida em hidrolases e liases (CORDEIRO & MARTINS, 2009). A pectina metilesterase é uma hidrolase que catalisa a desesterificação das ligações éster metílicas de ácido galacturônico da cadeia da pectina, liberando pectato e metanol, como pode ser visto na Figura 1. As moléculas resultantes ficam sujeitas à ação de poligalacturonases e pectinaliases, que irão dar continuidade à degradação dos polissacarídeos pécticos. Desta forma, a PME é das primeiras enzimas a atuar no processo natural de amadurecimento do fruto, antecedendo a ação das restantes enzimas pectinolíticas.
Figura 1. Ação da pectinametilesterase na cadeia de pectina
As poligalacturonases e polimetilgalacturonases também são hidrolases, mas atuam mais em pectato que em pectina e resultam em mono ou dissacarídeos, como pode ser visto na Figura 2 (CORDEIRO & MARTINS, 2009).
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Figura 2. Ação da polimetilgalacturonase e poligalacturonase na cadeia de pectato
A celulose é um polímero linear de glicose unido por ligações β(1-4), sendo que suas características principais são de ser fibrosa, resistente e insolúvel em água. A celulase é uma hidrolase que cliva as ligações β(1-4) da celulose, sendo muito utilizada industrialmente, principalmente na indústria têxtil para o amaciamento e processo de renovação de tecidos e também na indústria de sucos e vinhos, sendo que sua utilização facilita o processo de filtração da polpa das frutas (MENGUER et al, 2002).
A hemicelulase possui as seguintes funções: hidrólise de pectina solúvel e de componentes de paredes celulares, diminuição de viscosidade e manutenção de textura de sucos de frutas; hidrólise parcial de pró-pectina e de pectina solúvel em fragmentos de tamanho médio, formação de precipitado e remoção de hidrocolóides de celulose e hidrólise dos polissacarídeos das paredes celulares vegetais (UENOJO et al, 2007). 
Empresas produtoras de preparações comerciais de pectinases; características das enzimas pH e temperatura ótima de estabilidade e as aplicações das pectinases comerciais
O mercado de enzimas é um oligopólio e conta com a participação de 3 principais fornecedores de enzimas, a Novozymes A/S (sede na Dinamarca), Genencor International Inc. (sede nos EUA) e DSMNV (sede na Holanda), sendo que a maior fornecedora é a Novozymes com uma participação no mercado estimada em 47%, em 2009. 
No Brasil existem duas empresas produtoras de enzimas, a Bioenzima Indústria e Comércio Ltda e a Novpzymes Latin America Ltda, resultado da fusão brasileira Novo Industri com a dinamarquesa Nordisk Gentofte (FOCUS, 2011).
Diversas companhias na Europa (Novo Nordisk, Miles Kali-Chemie, Swiss Ferment Co., Novartis, Roche), Estados Unidos (Miles Laboratories, Rohm and Raas Co.) e no Japão (Kikkoman Shoyu Co.) produzem pectinases e preparações comerciais de pectinases (BHAT, 2000; GUMMADI & PANDA, 2003; SAKAI et al., 1993). 
Muitos estudos têm sido realizados para isolamento, seleção, produção, caracterização e aplicações de enzimas pectinolíticas não somente em processamento de alimentos, mas também para outras aplicações industriais. As substâncias pécticas podem ser degradadas por enzimas pectinolíticas, produzidas em diferentes combinações pelas plantas e por microrganismos como fungos, leveduras e bactérias (SILVA et al., 2005,15,16. São muito utilizadas nas indústrias de sucos de frutas para reduzir viscosidade e melhorar e aumentar a eficiência de filtração e de clarificação (ALMEIDA et al., 1937; GUMMADI e PANDA, 2003; FERNÁNDEZ-GANZÀLEZ et al., 2005); no tratamento preliminar da uva em indústrias vinícolas; na maceração, liquefação e extração de tecidos vegetais; na fermentação de chá, café e cacau (ALMEIDA et al., 1937;SILVA et al., 2005); para melhorar a extração de óleos vegetais (SILVA et al., 2005; ,; na extração de polpa de tomate (ALMEIDA et al., 1937) e no tratamento e degomagem de fibras naturais para as indústrias têxtil e de pape (ALMEIDA et al., 1937; KAUR et al., 2004). As pectinases também são utilizadas para reduzir o amargor excessivo em cascas de citrus, restaurar o aroma perdido durante secagem e melhorar a firmeza de pêssego e picles processados. A infusão de pectinase e b-glicosidase aumenta o aroma e as substâncias voláteis de frutas e vegetais, aumenta a quantidade de agentes antioxidantes em óleo de oliva extravirgem e reduz a indução ao ranço, além de outras aplicações conforme a Tabela 3(BHAT, 2000). 
A pectina esterase (polimetilgalacturonato esterase, PMGE) e as liases apresentam valores de temperatura ótima de 40 a 50 °C, já as poligalacturonases fúngicas são úteis pela alta atividade enzimática e possuem temperatura ótima entre 30 a 50ºC (JANYANI, sem ano). 
Tabela 3. Funções e aplicações das pectinases na indústria de alimentos e de vinhos.Aplicação de polissacarídeos microbianos 
Dentre os polissacarídeos microbianos, as gomas xantana e gelana destacam-se para a aplicação em alimentos. Os polissacarídeos de origem microbiana apresentam a vantagem de possuírem propriedades físicas e químicas reprodutíveis, além de apresentarem uma fonte regular. 
Lapasin & Pricl (1999) atribuem o sucesso desses polissacarídeos ao fato de eles poderem ser produzidos sob condições controladas a partir de espécies selecionadas, de modo que problemas de variações de estrutura e propriedades possam ser evitados. A versatilidade exibida pelos microorganismos na síntese de polissacarídeos iônicos e neutros com uma grande variedade de composições. 
5. CONCLUSÃO 
Os polissacarídeos são ingredientes essenciais para a formulação de alimentos, capazes de exercer uma grande variedade de funções para melhorar a qualidade dos produtos finais. 
A utilização de enzimas pectinolíticas e celulolíticas em processamentos de frutas pode contribuir para a obtenção de um produto final de melhor qualidade, através da melhora no rendimento de processos como: extração de pigmentos da casca de frutas, trituração e extração da polpa, clarificação e liberação de aromas. 
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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