Métodos de Imunoensaios

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Métodos de Imunoensaios
APRESENTAR OS IMUNOENSAIOS E DIFERENCIAR ESTES MÉTODOS DE ACORDO COM O PRINCÍPIO DE
CADA TESTE.
AUTOR(A): PROF. WALTER KINDRO ANDREOLI
AUTOR(A): PROF. WALTER KINDRO ANDREOLI
Os testes sorológicos ou imunoensaios são técnicas para a detecção de antígenos, anticorpos ou substâncias
que desempenhem papel de antígenos como drogas, hormônios, etc.  Devido ao grande desenvolvimento
auxiliam no diagnóstico de certeza, demostrando o patógeno com a identificação dos seus produtos nos
tecidos ou fluidos do hospedeiro.
Os métodos de imunoensaios são divididos em:
métodos que utilizam reagentes não marcados (não ligantes), com destaque para imunoprecipitação e
imunoaglutinação
métodos que utilizam reagentes marcados (ligantes), destacando-se os ensaios ELISA, imunofluorescência
e western blot.
A tabela abaixo mostra os principais testes de acordo com a classificação:
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TESTES TIPOS CARACTERÍSTICA
Reagentes não marcados
precipitação,
aglutinação  
floculação e
reação de fixação do complemento
menos sensível
Reagentes marcados
radioimunoensaio;
imunoenzimáticos (ELISA, dot-ELISA, Western Blot);
imunofluorescência 
mais sensível
 
Métodos que utilizam reagentes não marcados
PRECIPITAÇÃO
As técnicas de precipitação permitem a quantificação de precipitados formados pela reação antígeno-
anticorpo. Apresentam baixa sensibilidade, já que para a visualização do macrocomplexo é necessário
grande quantidade de moléculas de antígeno e anticorpo ligadas.
Os antígenos solúveis combinados aos anticorpos específicos precipitam e os complexos antígeno-
anticorpo formam agregados insolúveis grandes, malhas que consomem um grande número de moléculas de
anticorpo.
Teoria das Malhas
Baseia-se na formação de malha ou rede, alternando moléculas de antígeno (Ag) e anticorpo (Ac), que
quando atinge o equilíbrio (zona de equivalência) ocorre precipitação.
A formação de linhas de precipitação em qualquer tipo de imunodifusão é dependente das concentrações de
antígeno e anticorpo.
Alteração do equilibrio da proporção Ag e Ac interferem no resultado:
Efeito pró-zona há excesso de anticorpo (realizar diluição dos soros). A amostra apresenta resultado não
reagente quando testada sem diluir, embora contenha anticorpos.
Efeito pós-zona: há excesso de antígeno
Técnicas baseadas nas reações de precipitação
Imunodifusão
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Difusão radial simples: um dos componentes fica fixo no gel e o outro migra radialmente a partir de um
orifício feito no gel. Após 24-96 horas observa-se o precipitado na forma de um halo circular em volta do
orifício central. A concentração do componente migrante é proporcional à área do halo formado (Mancini),
e assim, o método é quantitativo, pois a partir de padrões de concentrações conhecidas é construída uma
curva-padrão (diâmetro) versus concentração.
Difusão radial dupla: Dois componentes migrando simultaneamente, um em direção ao outro. O gel é
somente um suporte neutro para a visualização da interação. Formam-se linhas, mais ou menos curvas
(arcos de precipitação). A curva apresentará concavidade próxima ao elemento de maior peso molecular.
Se temos um soro-padrão ou antígeno-padrão podemos comparar amostras-teste em relação aos arcos
formados.
AGLUTINAÇÃO
O princípio das técnicas de aglutinação é o mesmo das de precipitação, mas o componente conhecido, Ag
ou Ac, está adsorvido a partículas/células, o que facilita em muito a visualização do complexo AgAc na
forma de agregados.
A aglutinação é a formação de agregados suficientemente grandes de células interligadas por pontes
moleculares de anticorpos que se combinam simultaneamente com dois epítopos iguais, porém situados à
superfície de duas células diferentes. 
Aglutinação Direta
Na aglutinação direta, o antígeno faz parte naturalmente da partícula/célula, como por exemplo, antígenos
eritrocitários (sistema ABO) em hemácias humanas, antígenos heterófilos em hemácias de carneiro e de
cavalo, antígenos O, H e Vi na Salmonella, etc.
Aglutinação indireta
Método em que partículas ou células são sensibilizadas com antígenos ou anticorpos.   Neste método são
muito empregadas partículas de poliestireno (látex), carvão e gelatina e hemácias de aves e carneiro.
Quando se utilizam hemácias ou células de animais deve-se realizar o teste-controle, que é a reação em
paralelo utilizando as células não sensibilizadas, com a finalidade de verificar se nas amostras há
anticorpos heterófilos que reagiriam com antígenos da célula e não com os antígenos ligados à célula,
resultando em falso-positivos.
O teste de VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) utilizado para diagnóstico da Sífilis usa como
suporte cristais de colesterol, lecitina e o antigeno que é a cardiolipina (ver figura). O teste é realizado em
placas escavadas para a pesquisa de reaginas (anticorpos não-treponêmicos) que estão aumentadas na
Sífilis. Também tem sido classificado como de floculação.
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Vantagens: depende somente do tamanho dos agregados formados, teste semiquantitativo, mais sensíveis
que precipitação (as partículas amplificam a reação o que aumenta sensibilidade), simples, rápido,
partículas com determinantes antigênicos naturais em sua superfície (hemácias, bactérias, protozoários),
partículas inertes (látex, poliestireno, bentonita), baixo custo, leitura visual, facilidade de execução.
Desvantagens: reprodutibilidade dos lotes, acessibilidade para a interação AgAc, estabilidade da ligação
AgAc no suporte.
Métodos que utilizam reagentes marcados
Utilizam-se de substâncias químicas (fluorescentes, enzimáticas, luminescentes e radiosótopos) acopladas
(conjugadas) a antígenos ou anticorpos.
Os conjugados conservam a propriedade do antígeno ou anticorpos e da substância química acoplada. Essa
substância (marcador) tem alguma característica mensurável da substância química.
 
RADIOIMUNOENSAIO
Desenvolvido em 1956 para a detecção de anti-insulina em pacientes tratados com o hormônio, foi a
primeira técnica desenvolvida utilizando  um reagente marcado. Como marcador são usados os
radioisótopos - I125 ou I131.
Vantagens: quantitativo, rapidez, precisão, limiar de detecção em nano ou picogramas
Desvantagens: alto custo do teste, vida média dos reagentes e risco operacional (radiosótopos).
Aplicação: pesquisa de Ag e Ac, marcadores tumorais, hormônios.
IMUNOFLUORESCÊNCIA
Os compostos usados como marcador são chamados fluorocromos,  sendo muito utilizados o isotiocianato
de fluoresceína (FITC) e a lisamina-rodamina (RB-200). O FITC, absorção em 495nm e emissão em 520nm
(região verde no visível), muito empregado pela elevada eficiência e pela sensibilidade da retina humana à
cor verde.
 
Objeto disponível na plataforma
Informação:
Estrutura da micela
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Imunofluorescência Direta:
É a técnica em que se pesquisa antígenos em células ou tecidos (ex: antígenos celulares CD4+, HLA,
tumorais, virais).
Usam conjugados compostos de anticorpos (geralmente policlonais) específicos para o antígeno em questão
e marcados com fluorocromos.
Imunofluorescência Indireta:
Para detectar anticorpos circulantes para vários antígenos infecciosos (bactérias, protozoários, helmintos,
vírus em culturas decélulas) e auto-anticorpos (cortes de tecido contendo as células envolvidas na auto-
imunidade).
Antígenos são fixados em lâminas, o soro contendo anticorpo é incubado sobre eles e esses Ac são
detectados por meio de Imunoglobulinas específicas produzidas em animais para a classe de Ac (IgG, IgM
ou IgA) marcadas com o fluorocromo.
São muito empregados antígenos de Treponema pallidum, Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi,
Leishmania, Plasmodium, cortes de Schistosoma mansoni, etc.
IMUNOENZIMÁTICOS
O marcador é uma enzima que na presença de um substrato altera sua cor, de modo a diferenciar o teste
reagente (positivo) do não-reagente (negativo).
Quando há um suporte de fase sólida o teste ganha o nome de ELISA (enzyme-linked immunosorbent
assay).
Teste de fácil realização, principalmente para detecção de anticorpo e antígeno circulantes, bastando ter
antígeno ou anticorpo adsorvidos ao suporte.
Enzima: Uma enzima muito usada é a peroxidase que atua especificamente sobre a H O , produzindo
oxigênio. Na reação irá oxidar uma série de produtos que mudam de cor, e constituem os chamados
cromógenos.
Cromógenos: cromógenos podem ser solúveis (leitura de intensidade de cor) ou precipitados insolúveis
(manchas insolúveis, como o “dot” e o “imunoblot”ou “western blotting”).
Substrato Fluorogênicos: emitem luz fluorescente após serem consumidos pela enzima; - quantificação da
luz emitida pelo produto – fluorômetro.
Substrato Quimiluminescente: amplificação de sinal, emitem brilho após serem consumidos pela enzima,
quantificação do brilho emitido pelo produto – luminômetro.
Vantagens: alta sensibilidade, reagentes estáveis, permite automação.
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
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Utilizado largamente para detecção de Ac (IgG e IgM) em doenças infecciosas, antígenos (vírus, toxinas,
marcadores tumorais) e imunocomplexos circulantes.
O teste se realiza em placas, tubos, cubetas ou pérolas (fase sólida inerte), onde se fixa o Ag ou Ac.
Reação: Incuba-se a amostra-teste e, em seguida, o conjugado enzimático. (reagente marcado com enzima).
Se houver a formação do complexo com o conjugado enzimático, após adição do substrato-cromógeno
SOLÚVEL há mudança de cor da solução.
ELISA INDIRETO: o conjugado é constituído de uma anti-imunoglobulina (anti-Ig) marcada com uma
enzima. Quando queremos determinar a classe da imunoglobulina para determinar o estágio da doença, o
conjugado é substituído por uma anti-Ig especifica como anti-IgM, anti-IgG, anti-IgA, anti-IgE.
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Legenda: REPRESENTAçãO ESQUEMáTICA DE UM ELISA INDIRETO
ELISA SANDUÍCHE ou IMUNOMÉTRICO: atualmente este tipo de teste é muito utilizados no diagnóstico da
infecção pelo HIV.
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Legenda: REPRESENTAçãO ESQUEMáTICA DE UM ELISA SANDUíCHE OU IMUNOMéTRICO.
ELISA DE CAPTURA DE IgM:  anti-IgM é adsorvida a fase sólida que irá capturar as IgM da amostra. Após a
lavagem é adicionado o antígeno e após nova lavagem é adicionado o anticorpo específico marcado com a
enzima.
IMUNOBLOT OU “WESTERN BLOTTING”
Teste imunoenzimático para pesquisa de anticorpos com substrato cromogênico insolúvel. O antígeno é
primeiramente processado por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) que separa os
componentes antigênicos por peso molecular.
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Esses componentes são transferidos para membranas de nitrocelulose (“blotting)” e nessas tiras o teste é
processado. A técnica é utilizada para confirmar a especificidade dos anticorpos detectados por métodos de
triagem, pois discrimina quais determinantes antigênicos são reconhecidos pelos anticorpos.
De modo geral, ainda é uma técnica de custo elevado e, embora muito específica, tem sensibilidade menor
que os testes de triagem.
Observação: Nas técnicas de reagentes marcados as lavagens que ocorrem entre uma etapa e outra são
importantes para evitar reações de fundo inespecíficas.
OUTRAS TÉCNICAS
CITOMETRIA DE FLUXO
Células marcadas com anticorpos fluorescentes são introduzidas no citômetro e são transportadas em fluxo.
Um feixe de laser incide sobre cada célula de forma que os fluorocromos sob ação do laser emitem
fluorescência e os sinais são detectados e convertidos em sinais eletrônicos
Emprego: imunofenotipagem de linfócitos do sangue periférico de pacientes infectados pelo HIV,
diagnóstico e prognóstico de leucemias etc.
ATIVIDADE FINAL
Assinale a alternativa correta sobre o VDRL:
A. O VDRL é um teste de reagente não marcado utilizado para diagnóstico do HiV
B. O VDRL é um teste de reagente não marcado que pesquisa antígeno. 
C. O VDRL é um teste de reagente não marcado que pesquisa cardiolipina, lecitina e colesterol. 
D. O VDRL é um teste de reagente não marcado  que pesquisa reaginas aumentadas na Sífilis. 
REFERÊNCIA
Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde.  Departamento de DST, Aids e Hepatites
Virais. Diagnóstico laboratorial da  infecção pelo HIV/ Telelab diagnóstico e monitoramento. Ministério da
Saúde, 2014. 
Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde.  Departamento de DST, Aids e Hepatites
Virais. Diagnóstico da sífilis/ Telelab diagnóstico e monitoramento. Ministério da Saúde, 2014. 
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Molinaro, E M, Caputo, L F G; Amendoeira, M R R. Conceitos e métodos para a formação de profissionais em
laboratórios de saúde, p 76- 107  vol 4, Escola Politécnica de Saúde Joaquim Venâncio, FIOCRUZ,  Rio de
Janeiro, 2010
VAZ, Adelaide J.; TAKEI, Kioko; BUENO, Ednéia Casagranda.  Imunoensaios: fundamentos e aplicações. Rio
de Janeiro: Guanabara-Koogan, 2013.
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