Fracionamento Celular

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Presença de elementos químicos nos 
seres vivos e superfície da terra 
Composição Química da célula 
• Os compostos celulares são baseados em 
compostos de carbono 
• C, H, N e O constituem quase 99% do 
peso celular 
• Água = 70% do peso da célula, logo a 
maioria das reações químicas da célula 
ocorrem em ambiente aquoso. 
Composição química 
Composição química 
Componente Porcentagem do peso total 
E. coli Célula de 
mamífero 
H2O 70 70 
Íons inorgânicos (Na+, K+, Mg2+, Ca2+, 
Cl-, etc.) 
1 1 
Vários substâncias metabólicas 3 3 
Proteínas 15 18 
RNA 6 1,1 
DNA 1 0,25 
Fosfolipídeos 2 3 
Outros lipídeos - 2 
Polissacarídeos 2 2 
Volume total da célula 2 × 10-12 cm3 4 × 10-9 cm3 
Volume celular relativo 1 2000 
Principais moléculas orgânicas 
encontradas nas células 
• Açúcares; 
• Lipídios; 
• Ácidos nucleícos 
(DNA e RNA); 
• Proteínas 
 
 
FRACIONAMENTO CELULAR 
- Centrifugação - 
1. Rompimento das células em uma solução tampão 
que preserve as estruturas intracelulares 
(HOMOGENIZAÇÃO por choque osmótico, 
ultrasom, processo físico); 
2. Separação dos componentes celulares por 
tamanho e densidade na centrifugação; 
A separação de estruturas maiores como o núcleo 
ou mitocôndrias é feita em centrífugas 
denominadas de preparativas, com velocidades até 
20.000 r.p.m. 
 
Primeiras Etapas 
 
 
centrífuga 
preparativa 
 
 
20.000 rpm 
Centrifugação 2 
A separação de estruturas 
pequenas como o 
ribossomo é feita em 
centrífugas denominadas 
de ultracentrífugas, com 
velocidades acima de 
20.000 r.p.m., podendo 
chegar a 80.000 r.p.m. 
 
3.000 a 5.000 
r.p.m. 
Até 20.000 
r.p.m. 
Acima de 
50.000 r.p.m. 
Etapas finais 
 
Ultracentrífugas 
 
80.000 rpm 
Centrífugas 
Centrifugação 3 
Centrifugação 
ZONAL ou por 
velocidade de 
sedimentação e 
ISOPÍCNICA ou 
sedimentação por 
equilíbrio 
Tamanho é mais 
importante 
Densidade é mais 
importante 
Steep 
Cloreto de 
Césio 
gradient 
Stabilizing 
Sucrose 
gradient 
 
Densidades de estruturas celulares em sacarose 
 
 Estrutura Densidade (g/cm3) 
 Golgi 1.06-1.10 
 Membrana Plasmática 1.16 
 REL 1.16 
 Mitocôndria 1.19 
 Lisossomos 1.21 
 Peroxissomos 1.23 
 Vírus de Planta 1.30-1.45 
 Rhino- and enterovirus 1.30-1.45 
 Ácidos nucleicos, ribossomos 1.60-1.75 
 Glicogênio 1.70 
 
Coeficiente de sedimentação (s) 
Definido pela relação entre a velocidade com que 
uma partícula sedimenta em uma dada solução e 
a aceleração centrífuga aplicada. 
S = v/a = m {1-(d/d’)}/f 
onde: 
m = massa da partícula; 
d = densidade da partícula; 
d’ = densidade do solvente; 
f = coeficiente de fricção (depende da forma da 
partícula e viscosidade da solução) 
 
ISOLAMENTO DE LINFÓCITOS 
VIA GRADIENTE (FICOLL) 
Centrifugação 
Purificação de DNA plasmidial de 
bactérias por centrifugação isopícnica. 
Plant Virus Purification Virus Biological Isolation: 
•Host range and virus multiplication 
•Extraction Step 
•Clarification Step 
•Concentration Step 
•Virus Yield and Quality 
Steps of Virus Purification: 
PLYV Symptoms 
Purification PLYV 
Buffer pH- 5.2 
• Tipos de cromatografia: 
• a = Partição (papel ou de camada fina); 
• b = Coluna (troca iônica, hidrofóbica, 
filtração em gel, afinidade) material da 
coluna pode ser celulose ou silica; 
• c = HPLC (high performance liquid 
chromatography) 
Cromatografia 
Cromatografia 
Papel ou camada fina Coluna 
Cromatografia de coluna 
Cromatografia 3 
Tipos de cromatografia de coluna 
Cromatografia 4 
3 passos cromatográficos 
consecutivos usados para 
purificar uma proteína. 
Em A: resultados de uma coluna 
de troca iônica; 
B: Filtração em gel 
C: Cromatografia de afinidade. 
Colunas de HPLC 
Eletroforese 
Eletroforese 
Eletroforese 
SDS-PAGE 
Eletroforese 
Gel bi-dimensional 
Western-blot 
Espectrometria de massa 
• Espectrometria de massa para identificação de 
proteínas e seqüência de peptídeos. 
• Espectrômetro de massa pode ser usado para 
identificar proteínas determinando a sua massa precisa 
e massa de peptídeos derivados delas. 
• Os fragmentos polipeptídicos são inseridos no 
espectrômetro de massa e as suas massas são medidas. 
• Esse tratamento gera peptídeos de vários tamanhos 
diferindo um do outro por apenas um amino ácido. 
• A diferença da massa entre dois peptídeos muito 
parecidos pode ser deduzida indicando os aminoácidos 
diferentes. 
• Pela repetição desse procedimento, uma seqüência de 
aminoácidos parcial da seqüência original pode ser 
determinada 
Eletroforese de ácidos nucleicos 
Ag vAp 
Eletroforese 
PLYV Symptoms 
Buffer pH- 5.2 
Viral RNA and Coat Protein
4.8 kb 36 kDa
M 1 2 3 M 1 2 3
CSS 
Construction of Physical and 
Genetic Maps of the Genome 
of Spiroplasma kunkelii. 
1.66 Mb 
Técnica de Pulsed-Field bidimensional 
utilizada para fazer o mapeamento físico 
do S. kunkelii. 
M S M M S M
Excise sample lane(s).
Digest DNA in gel strips
MM
L MRI Bs Sm Sl 
33.5 kb
15.0 kb
82.0 kb
145.5kb
194.0 kb
242.5 kb
97.0 kb
Single restriction enzyme digestion of the S. 
kunkelii chromosome resolved in PFGE. 
A
M I / I Sl D Sm I / l MSma Sal Sal Sma
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
A
B
C
D
E
G
H
I
J
K
Two-Dimensional PFGE. 
Reciprocal digestions with endonucleases Sma I 
and Sal I. 
Physical map of S. kunkelii chromosome. 
Total of 1.5 Mb