EXTRAÇÃO ÁCIDOS NUCLEICOS EM AMOSTRAS VEGETAIS

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Extração de Ácidos Nucleicos em Amostras Vegetais: 
 Célula eucariótica vegetal: 
 
 Basicamente temos ácidos nucleicos no núcleo, 
compondo os cromossos 
 Nos cromossomos, os ácidos nucleicos estão 
estruturados em forma de DNA envoltos por uma 
série de proteínas (que devem ser separadas 
durante o processo de extração do DNA) 
Dogma Central da Biologia Molecular: 
 
 O DNA e o RNA são os dois tipos de ácidos 
nucleicos encontrados nos seres vivos 
 Apesar de ambos serem constituídos por 
subunidades de nucleotídeos ligados por ligações 
fosfodiéster, eles apresentam algumas diferenças 
básicas: 
► O DNA apresenta desoxirribose como açúcar, 
já o RNA apresenta uma ribose 
► As bases nitrogenadas presentes no DNA são 
citosina, guanina, adenina e timina. No RNA, 
são encontradas a citosina, guanina, adenina 
e uracila 
► O DNA apresenta duas fitas, mas o RNA 
possui fita simples 
 Apesar de haver essas diferenças, normalmente a 
extração é feita simultaneamente 
Técnicas de Biologia Molecular 
DNA/RNA: 
 
1. Coleta do Material Biológico 
 
 Coleta: cuidados especiais (seleção do material 
biológico) 
 Lavagem/esterilização superficial 
 Armazenamento: –20°C (DNA) a –80°C (RNA e tem 
que ser colocada rapidamente no nitrogênio) 
► Fazer alíquotas 
► Oxidação e degradação 
 
2. Isolamento DNA/RNA 
 
 Depende da amostra 
 Importante saber qual DNA será isolado, porque 
as plantas possuem três conjuntos distintos de 
DNA: nuclear, mitocondrial e plastidial 
 
 Para fazer esse isolamento das organelas, 
normalmente se usa o fracionamento celular 
 O fracionamento celular consiste na separação, 
por centrifugação, das estruturas sub-celulares, 
após rompimento das células 
 Fracionamento por centrifugação diferencial: 
► É o método mais amplamente utilizado para 
separar organitos celulares 
► Baseia-se nas diferenças de velocidade com 
que as partículas sedimentam no fundo de um 
tubo de centrifugação 
► Sujeitas a uma determinada força de 
centrifugação, as estruturas relativamente 
grandes, densas e pesadas, sedimentam mais 
rapidamente 
► Assim, usando-se forças e durações de 
centrifugação crescentes, e retirando de cada 
vez, o sedimento que se concentra no fundo 
do tubo, ou “pellet”, será possível obter 
suspensões de núcleos, depois de 
mitocôndrias, lisossomas e peroxissomas, 
depois separam-se os pequenos microssomas, 
depois ainda, os ribossomas livres. 
► A fração sobrante, despojada quase 
totalmente de estruturas, é o citosol 
 
 
 Fracionamento por centrifugação em gradiente de 
densidades: 
► Consiste em sujeitar uma suspensão de 
partículas com diferentes densidades, a uma 
força centrífuga constante, mas num meio de 
densidade gradualmente variável, de uma 
extremidade à outra do tubo. Empregam-se 
diversas substâncias para criar, num tubo de 
centrifugação, um gradiente de densidades; a 
mais comum é a sacarose 
► Nestas condições, partículas com densidades 
diferentes, deslocar-se-ão no campo de forças 
e situar-se-ão em níveis de densidade da 
solução que igualem a sua própria densidade. 
Deste modo, é possível separar organitos 
como as mitocôndrias, os lisossomas e os 
peroxissomas. 
► As frações isoladas podem, posteriormente, 
ser submetidas a uma gama diversificada de 
análises bioquímicas, para se identificar a 
composição química, a atividade enzimática, 
bem como as capacidades metabólicas. Mas 
podem também ser igualmente 
encaminhadas para observação em 
microscopia eletrônica 
 
 
 
 Objetivo do Isolamento: isolar quantidades 
adequadas, com qualidade adequada 
 Etapas: 
► Obtenção da amostra 
► Lise 
► Inativação de nucleases 
► Separação 
► Precipitação 
► Opcional: purificação, concentração 
 
 Material necessário: 
► Centrífuga com rotor 
► É aconselhável que a centrífuga tenha 
controle de refrigeração 
► Capelas de exaustão 
► Banho-maria com controle de temperatura 
► Vidraria para preparo das amostras 
► Microtubos de polipropileno 
► Micropipetas automáticas (com ponteiras) 
► Gelo e nitrogênio líquido, quando necessário 
 
 Cuidados antes e durante o processo: 
 
► Autoclavar as soluções (121°C, 15-20 min) ou 
a água de preparo 
► Tratar soluções com 0,1% DEPC: inativa 
nucleases por modificação covalente em 
resíduos de His em proteínas (ou autoclavar a 
121°C por 45 min) 
► Usar pipetas específicas ou ponteiras com 
filtros 
► Utilizar luvas 
► Esterilizar vidrarias (240°C, 4h) 
 
1ª ETAPA ISOLAMENTO CELULAR: LISE 
 
 Lise Mecânica: 
► Congelamento seguido de moagem 
► Homogeneizador 
► Sonicador 
 Lise Química: 
► Lise com detergentes (ex: SDS -dodecil sulfato 
de sódio; CTAB - brometo de 
cetiltrimetilamônio) 
► Solução fortemente alcalina (ex: hidróxido de 
sódio) 
 Lise Enzimática: 
► Protease 
 Cuidados: temperatura, ação das nucleases 
 
2ª ETAPA: INATIVAÇÃO DE NUCLEASES 
 
 Estratégias: 
► Uso de tampões de extração com pH por volta 
de 8,0, enquanto o pH ótimo para ação de 
DNAses endógenas fica por volta de 7,0 
► Adição de EDTA (ácido etileno diamono 
tetracético) no tampão de extração 
 A etapa de lise e inativação de nucleases 
pode ser combinada com o uso de 
soluções contendo detergentes para 
solubilizar a membrana celular e sais 
caotrópicos (tiocianato de guanidina, 
iodeto de sódio) fortes para inativar as 
enzimas por diminuir o efeito hidrofóbico 
► Ao final desta etapa, os debris celulares 
podem ser removidos por filtração ou 
precipitação 
 Cuidado: remover totalmente os debris celulares 
 Cuidados especiais: tecidos vegetais são ricos em 
polifenóis 
► Proteção contra compostos fenólicos: Adição 
de agentes antioxidantes, como PVP 
(polivinilpirrolidona), BSA (albumina de soro 
bovino) ou β-mercaptoetanol, ao tampão de 
extração 
 
 Cuidados especiais: Adição de agentes redutores 
para desnaturação de proteínas celulares, 
inativação de RNAses, antioxidantes de polifenóis 
e taninos 
► Ex: β-mercaptoetanol (BME) ou ditil-treitol 
(DTT) 
 
 Cuidados especiais: Viscosidade 
► Polissacarídeos inibem a ação de enzimas de 
restrição e tornam a amostra de DNA 
excessivamente viscosa, interferindo na 
migração do DNA em corridas eletroforéticas 
► O detergente CTAB é utilizado com essa 
finalidade, já que polissacarídeos e ácidos 
nucléicos possuem solubilidade diferenciada 
na presença desse detergente 
 Forma um complexo insolúvel com o 
ácido nucleico, que é posteriormente 
descomplexado com 1M de NaCl 
► É possível ainda precipitar juntamente com 
proteínas utilizando SDS + acetato de potássio 
► Polissacarídeos também podem ser 
removidos pelo emprego de gradiente de 
cloreto de césio (CsCl) 
 
 Cuidados especiais: tecidos ricos em proteínas: 
► Extrações com fenol e/ou clorofórmio, que 
desnaturam as proteínas tornando-as 
insolúveis à fase aquosa, onde se encontram 
os ácidos nucleicos 
► Alta concentração de sal (‘salting out’), como 
acetato de potássio, ou mudanças no pH 
podem precipitar proteínas 
► Separação de proteínas com solventes 
orgânicos (cuidado com a pipetagem!): 
 
 
3ª ETAPA: PRECIPITAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS 
 
 Uso de etanol e sal 
 Cuidado: evaporação total do etanol 
 
 O método (explicado) utilizando solventes 
orgânicos é amplamente utilizado 
 Limitações: 
► Uso de solventes orgânicos perigosos 
► Laborioso 
► Fenol residual ou clorofórmio podem estar 
presente no DNA extraído, que pode inibir seu 
uso em aplicações como a PCR 
 Alternativa: reagentes pré-prontos (Trizol, 
Concert). Exemplo é o Trizol: 
 
 
 
 Outra alternativa um pouco mais cara é o uso de 
Métodos cromatográficos: 
 
 O tampão favorece a ligação do ácido nucleico à 
resina de sílica por apresentar baixo pH e alta 
força iônica (alta concentração de sais) 
 Fácil, prático, reduz necessidade de cuidados – 
nem sempre eficiente! 
 Gel filtração: uso de matriz porosa que permite 
difusão de pequenas partículasna matriz 
enquanto que moléculas maiores são excluídas 
 Cromatografia de troca iônica: interações 
eletrostáticas dos ácidos nucleicos com 
grupamentos ligados à matriz da coluna. A eluição 
é realizada com tampões 
 Cromatografia de afinidade: ligante imobilizado se 
liga aos ácidos nucleicos. Eluição com molécula 
competidora 
 Protocolo com cloreto de césio-brometo de 
etídeo 
 Purificação do RNA por afinidade: 
► Ex: poli(A)+ mRNA se liga a partículas 
magnéticas cobertas com estreptavidina 
utilizando oligo(dt) ligado a biotina. Separação 
do complexo com ímã. 
► Cuidados: separação completa das partículas 
magnéticas 
 
4ª ETAPA: DIGESTÃO COM DNAse/RNAse 
 
► Cuidado: testar eficiência da enzima! 
 
 
 
Quantificação e Qualidade do DNA ou 
RNA extraídos: 
 
 Espectrofotometria (amostra lida em 260 nm) 
► Mede o quanto uma substância química 
absorve a luz, medindo a intensidade 
quando um feixe de luz passa através da 
solução da amostra 
► Leitura conjunta do RNA e DNA 
► Cuidados: pipetagem! 
► Concentração de DNA = leitura da DO260 
x 50 x fator de diluição usado na leitura 
► Concentração de RNA = leitura da DO260 
x 40 x fator de diluição usado na leitura 
 Fluorometria (Quibit) 
► As moléculas do analito são excitadas para 
resultar em uma espécie cujo espectro de 
emissão fornece informação para a análise 
qualitativa ou quantitativa onde moléculas 
produzem o efeito da luminescência sendo 
este último o resultado da absorção de 
energia radiante e da posterior emissão de 
parte dessa energia quando regressa ao 
orbital de origem 
► Específico 
► Cuidados: pipetagem! 
 
Qualidade do DNA ou RNA extraídos: 
 
 A260 (leitura feita a 260): pico de ácidos nucleicos 
 A280: pico de proteínas 
 A230: pico de fenóis 
 A260/A280: deve estar entre 1,8 e 2,2 
 A260/A230: eve estar entre entre 1,8 e 2,2 
 
 Avaliação da Integridade do RNA através de 
BioAnalyzer : 
► O princípio do BioAnalyzer é o mesmo de uma 
eletroforese em gel de agarose, mas a corrida 
é feita em um capilar contendo o polímero e é 
gerado um eletroferograma, que é analisado 
automaticamente pelo aparelho que detecta 
qualquer traço de degradação 
► O resultado é exibido na forma de um gráfico, 
através do qual é possível calcular a razão 
28S/18S com maior precisão a partir de seus 
respectivos picos, gerando desta forma o que 
se denomina RIN (RNA Integrity Number) 
► Os valores de RIN estão numa escala de 1 a 
10, sendo que, quanto maior esta pontuação 
maior é a qualidade e/ou integridade do RNA 
► De modo geral, para experimentos de PCR 
quantitativa em tempo real, considera-se um 
RNA de boa qualidade quando o valor de RIN 
está acima de 7,5 
 Escolha do método: 
► Extração eficiente 
► Quantidades suficientes do DNA/RNA extraído 
para processos subsequentes 
► Remoção de contaminantes 
► Qualidade e pureza de DNA/RNA 
► Custos e tempo 
 Cuidados gerais independentemente do método 
escolhido! 
 Armazenamento: 
► DNA 
► RNA - cDNA