Microbiologia Biofilmes Microbianos

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Biofilmes Microbianos
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Introdução
Comportamento coletivo
Comunidades associadas às superfícies
Estrutura dos Biofilmes
Por que formar um biofilme?
Disponibilidade de nutrientes e cooperatividade metabólica
Aquisição de novas características genéticas
Papel dos biofilmes nas doenças
Genética da formação dos biofilmes 
 
Introdução
Nossa percepção de bactérias como organismos unicelulares baseia-se essencialmente no conceito de culturas puras, nas quais as células podem ser diluídas e estudadas a partir de culturas líquidas. Como praticamente todos os conceitos e conhecimentos microbiológicos foram adquiridos a partir do estudo de organismos em culturas puras, somente há alguns anos começamos a entender que, na realidade, a maioria das bactérias se encontra na natureza vivendo em comunidades, de maior ou menor estruturação.
O tipo de "ecologia" que imaginávamos em relação aos procariotos, ou seja, células individuais crescendo de maneira planctônica (livres, em suspensão), raramente é encontrado na natureza. Sabe-se atualmente que, quando em seus habitats naturais, via de regra as bactérias são encontradas em comunidades de diferentes graus de complexidade, associadas a superfícies diversas, geralmente compondo um biofilme, isto é, um ecossistema estruturado altamente dinâmico, que atua de maneira coordenada. 
Assim, embora possam ter uma existência planctônica independente, este tipo de vida parece ser eventual.
Os biofilmes, complexos ecossistemas microbianos, podem ser formados por populações desenvolvidas a partir de uma única, ou de múltiplas espécies, podendo ser encontrados em uma variedade de superfícies bióticas e/ou abióticas. Desta maneira, muitos autores definem biofilmes como associações de microrganismos e de seus produtos extracelulares, que se encontram aderidos a superfícies bióticas ou abióticas.
Geralmente, a dinâmica de formação de um biofilme ocorre em etapas distintas. Inicialmente temos or organismos denominados colonizadores primários, que se aderem a uma superfície, geralmente contendo proteínas ou outros compostos orgânicos. As células aderidas passam a se desenvolver, originando microcolônias que sintetizam uma matriz exopolissacarídica (EPS), que passam a atuar como substrato para a aderência de microrganismos denominados colonizadores secundários. Estes colonizadores secundários podem se aderir diretamente aos primários, ou promoverem a formação de coagregados com outros microrganisos e então se aderirem aos primários.
Desenvolvimento de um biofilme. (a) Colonização primária de um substrato; (b) crescimento, divisão celular e produção do exopolissacarídeo (EPS), com o desenvolvimento de microcolônias; (c) coadesão de células individuais, de células coagregadas e grupos de células idênticas, originando um biofilme jovem, de múltiplas espécies; (d) maturação e formação de mosaicos clonais no biofilme maduro.
(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003) 
 
Assim, o biofilme corresponde a uma "entidade" dinâmica pois, de acordo com os microrganismos que o compõem, teremos consições físicas, químicas e biológicas distintas. Estas alterações fazem com que cada biofilme seja único, de acordo com os microrganismos presentes. Neste sentido, ao longo do tempo a composição microbiana dos biofilmes geralmente sofre alterações significativas. A figura abaixo ilustra não somente a estruturação fisico-química de um biofilme, mas também sua evolução e amadurecimento, dependendo das relações estabelecidas pelos microrganismos presentes.
 
Estágios de formação e vida de um biofilme, determinados por fatores físicos, biológicos e ambientais
(Adaptado de Jenkinson & Lappin-Scott, Trends Microbiol., 9:9-10, 2001) 
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Comportamento coletivo
Há várias décadas, foi proposto que as bactérias poderiam corresponder a organismos interativos, capazes de atuar coletivamente, facilitando sua adaptação às alterações ambientais. Para que um biofilme de uma ou várias espécies seja formado, é necessário o estabelecimento de um comportamento multicelular, que se reflete em atividades coordenadas de interação e comunicação dos vários organismos. Assim, os biofilmes não são simples camadas viscosas contendo organismos. Estes representam sistemas biológicos altamente organizados, onde as bactérias estabelecem comunidades funcionais estruturadas e coordenadas. 
Um dos mecanismos de comunicação interbacteriana que vem se mostrando extremamente importante na formação e desenvolvimento de biofilmes corresponde ao quorum sensing.
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Comunidades associadas às superfícies
Os procariotos podem habitar qualquer ambiente adequado às formas de vida superiores, assim como vários ambientes inóspitos à maioria das formas de vida. Tal fato é decorrente de sua inigualável diversidade metabólica e plasticidade fenotípica. Um dos importantes aspectos associados a esta ubiqüidade está relacionado à capacidade destes organismos migrarem para diferentes nichos, onde podem se propagar. O mecanismo mais comum que permite a migração dos procariotos corresponde à motilidade, seja de origem flagelar, deslizante, ou de outro tipo. No entanto, são conhecidos mecanismos que também permitem a migração bacteriana. Por exemplo, algumas espécies podem sintetizar celulose, originando uma película que mantém as células próximas à interface ár-água, ou na superfície de plantas. Bactérias fotossintetizantes podem se posicionar nas colunas de água, em resposta à intensidade luminosa, pela produção de vesículas de gás. Outras, apresentam magnetossomos, permitindo movimentações ao longo dos campos magnéticos da Terra. Um importante mecanismo na formação de comunidades corresponde à agregação ou aderência, que otimiza tanto as interações celulares como também as taxas de sedimentação dos organismos.
As comunidades bacterianas têm importantes papéis na natureza, seja na produção e degradação de matéria orgânica, na degradação de poluentes, ou na reciclagem de nitrogênio, enxofre e vários metais. A maioria destes processos requer o esforço coletivo de organismos com diferentes capacidades metabólicas. Assim, os biofilmes participam metabolizando esgotos e águas contaminadas com petróleo, na nitrificação, na reciclagem de enxofre oriundo de drenados ácidos de minas (onde o pH é 0) e em vários outros processos. Outro tipo de biofilme está associado às partículas em suspensão, muitas vezes denominadas neve marinha, extremamente importante nas transformações biogeoquímicas do carbono em ambientes pelágicos, na metanogênese, fixação de nitrogênio e produção de enxofre. Estes achados revelam que nos biofilmes podem ser criadas condições de anaerobiose, em ambientes normalmente aeróbios.
Exemplo da ecologia de comunidades microbianas. As quatro microcolônias centrais correspondem a organismos que geram e consomem hidrogênio. Os fermentadores utilizam açúcares e produzem ácidos orgânicos, utilizados pelos produtores de hidrogênio. Além das interações metabólicas, a comunicação intra e intercelular pode ser mediada por moléculas sinalizadoras. 
(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000) 
 
As interações que permitem a agregação de diferentes espécies, ou mesmo gêneros microbianos em um biofilme geralmente envolvem a participação de adesinas (moléculas de adesão presentes em fímbrias ou dispersar ao longo da superfície celular), que reconhcem receptores específicos na superfície de outras células, ou em diversos tipos de substratos. Assim, a figura abaixo esquematiza a formação de um biofilme aquático, revelando a complexidade tanto estrutural como temporal deste ecossistema. As horas correspondem ao tempo médio necessário à adesão dos diferentes microrganismos, revelando a dinâmica de formação e estruturação deste biofilme.
Esquema de coagregações envolvendo bactérias aquáticas. 
(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003) 
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Estrutura dos Biofilmes
A maioria dos biofilmes exibe umacerta heterogeneidade, existindo conjuntos de agregados celulares distribuídos ao longo da matriz exopolissacarídica, que exibem densidades variáveis, originando aberturas e canais por onde a água pode trafegar.
Corte lateral, revelando a estrutura de um biofilme artificial de V. cholerae. A intensidade da cor está associada à densidade celular.
(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000) 
As microcolônias que compõem um biofilme podem ser de uma ou várias espécies, dependendo das condições ambientais. Por exemplo, em locais de grande stress mecanico, tais como a superfície dental, o biofilme é bastante compactado e estratificado. Os espaços intersticiais (canais) também são parte importante dos biofilme, pois permitem a circulação de nutrientes e a troca de metabólitos.
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Por que formar um biofilme?
Acredita-se que a formação de biofilmes esteja associada, por exemplo, à proteção contra o ambiente, ou seja, bactérias em um biofilme encontram-se abrigadas e em relativa homeostase, graças à presença da matriz exopolissacarídica. A matriz contém vários componentes: exopolissacarídeo, proteínas, ácidos nucléicos, entre outros. O exopolissacarídeo é secretado para o meio externo, sendo de diferentes composições. Ao que parece, o EPS tem diferentes estruturas e funções, dependendo das comunidades e/ou condições ambientais. Este polímero pode impedir fisicamente a penetração de agentes antimicrobianos no biofilme, principalmente aqueles hidrofílicos e carregados positivamente. Em alguns casos o EPS é capaz de sequestrar cátions, metais e toxinas. Por estas razões, os biofilmes podem corresponder a excelentes mecanismos de transferência de metais nos ecossistemas, pois vários organismos marinhos pastadores se alimentam de biofilmes. Foi também descrito que o EPS teria papel de proteção contra radiações UV, alterações de pH, choques osmóticos e dessecação.
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Disponibilidade de nutrientes e cooperatividade metabólica
Os canais aquosos dos biofilmes podem ser comparados a um sistema circulatório primitivo, permitindo a troca de nutrientes e metabólitos, assim como a remoção de metabótilos potencialmente tóxicos. Em um biofilme, torna-se possível a cooperação metabólica. Por exemplo, a degradação de compostos orgânicos complexos, originando metano e CO2 durante uma digestão anaeróbia, requer pelo menos três grupos de organismos. As bactérias fermentativas iniciam o processo, gerando ácidos e álcoois, que são utilizados por bactérias acetogênicas. Finalmente, as metanogênicas convertem o acetato, CO2 e hidrogênio, produzindo metano.
Os biofilmes são ambientes ideais para o desenvolvimento de relaçoes sintróficas, que é um tipo de simbiose onde dois tipos de organismos metabolicamente distintos dependem um do outro para utilizarem certos substratos, na produção de energia.
Sintrofia em um grânulo de lodo de um reator metanogênico. Corantes fluorescentes revelam organismos metanogênicos (em verde) e bactérias que oxidam propionato (em vermelho). A cor amarela resulta da combinação verde e vermelho, revelando microcolônias sintróficas interligadas a cadeias de metanogênicos.
(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000) 
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Aquisição de novas características genéticas
Várias bactérias possuem plasmídeos, conferindo as mais diversas características. Estes podem ser transferidos horizontalmente por conjugação, para diferentes espécies presentes em um bioflme. Estudo foram realizados com placas dentais artificiais, formadas inicialmente por bactérias do gênero Streptococcus. Uma linhagem de Bacillus, contendo um transposon conjugativo albergando genes de resistência à tetraciclina, foi inserida no sistema e transferiu este transposon para células de Streptococcus.
A transdução pode, teoricamente, ser responsável pela transferência horizontal de genes em biofilmes. Tal hipótese baseia-se no fato de sistemas marinhos e de água doce contêm uma enorme abundância de bacteriófagos (cerca de 108/ml), sendo responsáveis pela lise de um grande número de bactérias. Diariamente, de 10 a 20% da população bacteriana é lisada por fagos, os quais têm relevante impacto na cadeia alimentar microbiana uma vez que podem aumentar as taxas de mortalidade e/ou reduzir as taxas de crescimento em todos os níveis tróficos. Estudos recentes revelam que os fagos podem estruturar ou restruturar comunidades microbianas. Em uma análise, onde uma população de cianobactérias foi praticamente exterminada pelos fagos, observou-se a presença de novas espécies capazes de degradas os compostos orgânicos que surgiram.
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Papel dos biofilmes nas doenças
Até o momento, a vasta maioria das doenças infecciosas vem sendo tratada eficientemente com antibióticos entretanto, de acordo com as pesquisas mais recentes, sabemos que tal tipo de estratégia pode ser ineficaz em duas situações: 1) com organismos exibindo resistência inata à droga e 2) em bactérias presentes em biofilmes. Em um biofilme, as bactérias podem ser 1000 vezes mais resistente a um antibiótico, quando comparadas às mesmas células planctônicas, embora os mecanismos envolvidos nesta resistência sejam ainda pouco conhecidos. Dentre os possíveis mecanismos, acredita-se que possa haver a inativação da droga por polímeros ou enzimas extracelulares, ou a ineficiência da droga em decorrência de taxas de crescimento muito lentas no interior dos biofilmes.
Infecções assciadas a biofilmes geralmente são de natureza recorrente, visto que as terapias antimicrobianas convencionais eliminam predominantemente as formas planctônicas, deixando as células sésseis livres para se reproduzir e propagar no biofilme após o tratamento. Para tornar o quadro ainda mais grave, as bactérias presentes nos biofilmes encontram-se mais protegidas contra o sistema imune do hospedeiro.
Exemplos típicos de doenças associadas a biofilmes incluem as infecções de implantes tais como válvulas cardíacas, catéteres, lentes de contato, etc.
Os biofilmes podem ainda promover doenças se formados em tecidos, tais como nas infecções pulmonares provocadas por Pseudomonas aeruginosa, em pacientes com fibrose cística, que são suscetíveis a infecções crônicas por esta bactéria. A periodontite é outro exemplo de doença provocada por biofilmes. O principal microrganismo associado a esta doença, Porphyromonas gingivalis, coloniza uma grande de superfícies orais direta ou indiretamente, sendo então capaz de invadir as células das mucosas e liberar toxinas.
Biofilmes e resistência às drogas, devido à densidade e tipos celulares, exclusão física da droga, expressão de genes de resistência, quorum sensing e alterações da superfície celular
(Adaptado de Mah & O’Toole, Trends Microbiol., 9:34-39, 2001)
 
Esquema do desenvolvimento temporal de uma placa dental. 
(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003) 
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Genética da formação dos biofilmes
Quatro organismos, P. aeruginosa, P. fluorescens, E. coli e V. cholerae, vêm sendo intensamente estudados, como modelos na formação de biofilmes de espécies únicas. Este processo pode ser subdivido em etapas: a) Aderência inicial à superfície, b) Formação das microcolônias, c) maturação das microcolônias em um biofilme contendo a matriz de EPS.
	
Estudo microscópico da formação de um biofilme por V. cholerae
(Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol., 182:2675–2679, 2000)
	
Etapas que uma nova espécie bacteriana realiza, durante sua incorporação em um biofilme
(Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol., 182:2675–2679, 2000)
Ao que parece, o processo se inicia quando as bactérias percebem determinadas condições ambientais, que disparam o fenômeno de transição de células planctônicas em sésseis. Assim, Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens parecem ser capazes de formar bioflmes sob quase todas as condições, enquanto E. coli somente os forma se estiver em meios mínimos suplementados com aminoácidos, ou em meios pobres em nutrientes.
Diferentesvias genéticas podem ser utilizadas na formação de biofilmes. Por exemplo, V. cholerae parece ter diferentes vias para realizar a aderência inicial, dependendo da superfície. Assim, quando no intestino, este organismo utiliza a fímbria Tcp para realizar a colonização, embora tal estrutura não tenha papel na etapa inicial de formação de biofilmes em superfícies abióticas, sendo o processo mediado por um outro tipo de fímbria, denominada Msh.
Início de formação do biofilme
A partir de estudos com linhagens mutantes de P. aeruginosa, foi relatado que, quando as células não sintetizam flagelos, são incapazes de realizar as interações iniciais com as superfícies. Mutantes que não produzem a fímbria tipo IV (associada à movimentação das células em uma superfície) são capazes de se aderir formando uma monocamada, ao invés de microcolônias. Existem uma proteína, denominada Crc que, além de atuar regulando o metabolismo das células, também regula a expressão de dois genes que codificam proteínas importantes na montagem da fímbria tipo IV. O LPS da membrana externa também tem papel na adesão inicial. Em E. coli, os flagelos também são importantes nesta primeira etapa de formação do biofilme. Há ainda a participação de fímbrias do tipo I, uma proteína de membrana externa, Ag43 e do LPS. Em V. chloreae acredita-se que o processo seja bastante similar ao de E. coli.
Maturação do biofilme
Após a etapa de interações iniciais, começa a haver a formação das microcolônias, normalmente associada à produção de EPS. Outra etapa importante corresponde à organização da arquitetura do biofilme que, em P. aeruginosa parece ter a participação do "quorum sensing".
Estágios iniciais na formação de biofilmes de Gram negativos (P. aeruginosa, E. coli, e V. cholerae).
(A) Em P. aeruginosa, os flagelos são necessários para aproximar a bactéria da superfície, enquanto o LPS media as primeiras interações, havendo talvez a participação de proteínas da membrana externa. Quando formam monocamadas, fímbrias tipo IV mediam o movimento pulsante, necessário à formação de microcolônias. A produção destas fímbrias é regulada, em parte, por sinais nutricionais (Crc), havendo ainda a ativação de genes envolvidos na síntese de alginato e repressão de genes flagelares. A formação do biofilme maduro envolve a participação de homoserina lactonas sinalizadoras. (B) Em E. coli, os flagelos aproximam as células do substrato, enquanto as primeiras interações são mediadas por fímbris tipo I e a proteína de membrana externa Ag43. O EPS, ácido colânico é resonsável pela arquitetura do biofilme. (C) V. cholerae, também usa os flagelos na aproximação, sendo a ligação mediada por fímbrias MshA e talvez outras proteínas.
(Adaptado de Davey & O’Toole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000) 
 
Dispersão
Em determinados momentos, os biofilmes sofrem dispersão, liberando microrganismos que podem vir a colonizar novos ambientes. Ós mecanismos genéticos associados à dispersão não são ainda bem conhecidos.
Existem três tipos de processos de dispersão: expansiva, quando parte das células de uma microcolônia sofrem lise e outras retomam a motilidade, sendo então liberadas da estrutura. Outro tipo de dispersão envolve a fragmentação do biofilme, onde porções de matriz extracelular associadas a microrganismos são liberadas. Finalmente, o terceiro tipo de dispersão, denominada superficial, ocorre pelo crescimento do próprio biofilme como um todo.
 
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Cynthia M. Kyaw