Resumo de Bibliotecas de cDNA

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Módulo 1 - BIBLIOTECAS DE cDNA
Coleção de fragmentos de cDNA (DNA complementar a RNAm)
Representa as seqüências expressas em um determinado tecido ou órgão, sob influência de uma determinada condição do ambiente, num determinado momento. Esses fragmentos são normalmente armazenados em vetores de clonagem.
Ao contrário a biblioteca genômica, que contem qualquer fragmento de DNA (codificante ou não), só contém os genes expressos no tempo e local específicos.
Maior vantagem: ausência de introns nas seq clonadas > facilita a identificação de seq expressas.
Uma biblioteca de cDNA devidamente construída deverá:
representar todos os mRNA expressos num determinado tecido e estádio de desenvolvimento; 
conter clones com seqüências de cDNAs provenientes de mRNAs completos; 
possuir número suficiente de clones que garantam a representatividade de todos os mRNA;
ser estável, para que possibilite um correto armazenamento por períodos prolongados de tempo;
Para construir uma biblioteca de cDNA, faz-se:
- extração de mRNA do tecido ou organismo de interesse: nessa fase, a extração de RNA se dá em totalidade, e é necessário separar o RNAm dos demais tipos. Por possuir cauda poliA, o RNAm cria um sistema favorável de separação, uma vez que a solução de RNA total pode passar por uma coluna cromatográfica onde estão acoplados oligodTs que se unirão apenas ao RNAm, enquanto os outros serão eluídos. 
- síntese de cDNA a partir do mRNA (transcrição reversa): primers crutos de oligo(dT) são incorporados a cauda poliA do RNAm, fornecendo um grupo 3’-OH para a seq de nucleotídeos. Em seguida a transcriptase reversa inicia a sintese de DNA unifilamentar complementar a seq de RNAm. 
A adição de RNAse à solução faz com que parte do RNA do híbrido RNA-DNA seja fragmentado, o que leva a DNA polim a sintetizar uma segunda cadeia unifilamentar de DNA utilizando os fragmentos de RNA como primers e a 1ª fita de DNA como molde. 
- clonagem das moléculas de cDNA em um vetor de clonagem 
- incorporação do vetor em uma bactéria para a sua multiplicação (transformação bacteriana). 
- Plaquear os clones: Com um plasmídeo usado na clonagem, as células são diluídas de modo que cada bac cresça em uma colônia distinta. Se a clonagem foi feita mediante fagos, esses são postos para infectar uma camada de bacterias em uma placa de Petri. Cada placa ou colônia tem um fragmento de DNA clonado.
 
Triagem
Através de sondas: seja por sequencias similares já descritas nos bancos de Dados ou produzidas sinteticamente, quando se utiliza a sequencia de aa de uma proteína expressa pela sequencia sonda que se deseja produzir. 
Através de produto protéico: desde que a seq tenha sido clonada em um vetor de expressão.