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Enzimas Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Vagalume Enzima luciferase quebra a proteína luciferina na presença de ATP Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Louis Pasteur (1850) o Açúcar álcool catalisada por “fermentos”; o Fermentos = Enzimas separáveis da estrutura das células de levedo. Eduard Buchner (1897) o Extratos de levedos açúcar até álcool enzimas funcionavam mesmo quando removidas da estrutura celular. Histórico Profa. Leonora Rios de Souza Moreira James Summer (1926) o Isolou e cristalizou a urease avanço nas propriedades específicas das enzimas; o Cristais de urease proteínas; o Todas as enzimas são proteínas. John Northrop e seus colegas (1930) o Cristalizaram a pepsina e tripsina bovinas proteínas. Histórico Profa. Leonora Rios de Souza Moreira J. B. Haldane (1930) o Tratado intitulado “Enzimas”; o Ligações fracas entre enzima e substrato distorce a molécula do substrato e catalisa a reação. Século XX o Pesquisas reações do metabolismo celular; o Purificação, elucidação da estrutura molecular, mecanismo químico e compreensão geral. Histórico Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Quase todas as reações bioquímicas são catalisadas por enzimas Com exceção de poucas moléculas de RNA que apresentam atividade catalítica, todas as enzimas são proteínas oAlgumas requerem grupos não proteicos para sua atividade catalítica Enzimas características Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Cofatores Algumas enzimas não requerem nada além dos seus resíduos de aminoácidos Outras requerem cofatores o Íons inorgânicos como Fe2+, Mg2+, Mn2+ , etc Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Aceptores/doadores de átomos ou grupos funcionais; Catálise: coenzima + substrato = alojados no centro ativo; Encontra-se ligada à enzima Coenzimas Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Coenzimas Molécula orgânica necessária ao funcionamento da enzima oMuitas derivados de vitaminas são coenzimas Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Holoenzima: Enzimas conjugadas, formadas por apoenzima (porção proteica) e coenzima (porção não proteíca) Profa. Leonora Rios de Souza Moreira 12 A maioria das vitaminas hidrossolúveis são componentes de sistemas de enzima essenciais. Várias estão envolvidas em reações de manutenção do metabolismo energético. Vitaminas são coenzimas Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Origem do termo vitamina Em 1911, um jovem químico do Lister Institute de Londres, Casimir Funk, isolou, do farelo de arroz, uma substância cristalizada que possuía uma função amina. Como essa substância se revelou capaz de prevenir e de curar o “beribéri” experimental, Funk criou o termo “vitamina”, para salientar que essa amina era indispensável à vida. Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Composta de carbono, hidrogênio e o oxigênio, possuem estrutura variada e de acordo com sua solubilidade se dividem Lipossolúveis e Hidrossolúveis. Lipossolúveis são: A (Retinol), D (Calciferol), E (Tocoferol) e K (Menaquinona) Hidrossolúveis são: B1(Tiamina), B2 (Riboflavina), B6 (Piridoxina), B12 (Cianocobalamina) e Vitamina C (Ácido Ascórbico) as principais, sendo importantes também Niacina, Ácido Fólico, Biotina, Ácido Pantotênico, Colina. Vitamina Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Ascorbic acid is a reducing agent (an antioxidant) B series are components of coenzymes, Must be modified before they can serve their functions Structure of some water-soluble vitamins Profa. Leonora Rios de Souza Moreira As duas formas biologicamente ativas são a flavina mononucleotídeo (FMN) e flavina adenina dinucleotídeo (FAD), formadas pela transferência de um AMP do ATP à FMN. A FMN e FAD são capazes de aceitar reversivelmente dois átomos de hidrogênio, formando a FMNH2 ou FADH2. A FMN e FAD estão ligadas fortemente a flavoenzimas que catalisam a oxidação ou redução de um substrato. As formas de coenzima biologicamente ativa são a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) e seu derivado fosforilado, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (NADP+). O NAD+ e NADP+ servem como coenzimas nas reações de oxidação-redução nas quais a coenzima sofre redução do anel piridina para aceitar um íon hidreto (átomo de hidrogênio mais um elétron). As formas reduzidas do NAD+ e NADP+ são o NADH e NADPH, respectivamente. Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Componente da coenzima A, que tem papel importante na oxidação e síntese de acidos graxos Profa. Leonora Rios de Souza Moreira A importância das vitaminas no metabolismo celular Enzimas são nomeadas pelo sufixo “ase” ao seu substrato ou a palavra que descreve sua atividade o Transferases => reações de transferências oHidrolases => Reações de hidrólise oDNA polimerase => Reação de polimerização do DNA oCelulase => hidrólise de celulose Nomenclatura Alto grau de especificidade Altamente eficientes: aceleram a velocidade das reações 108 a 1011 vezes; Reduzem a energia de ativação Mecanismo “turnover”: desempenha funções consecutivas; Podem ser inibidas Km => Propriedades cinéticas de muitas enzimas Enzimas características Enzimas Profa. Leonora Rios de Souza Moreira O sítio ativo da enzima é contornado por resíduos de aminoácidos cujos grupos substituintes (“R”) se ligam ao substrato e catalisam sua transformação Funcionamento das enzimas Profa. Leonora Rios de Souza Moreira produtos ENZIMA substrato sítios ativos PEPSINA proteína alta especificidade peptídeos - catabolismo Funcionamento das enzimas Binding of a substrate to an enzyme at the active site Enzimas: Sítio ativo Profa. Leonora Rios de Souza Moreira região específica da superfície Constituída por grupos R de aminoácidos; Confere especificidade à catalise enzimática. Atividade catalítica – Sítio ativo Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Interagem com um ou poucos substratos e catalisam poucos tipos de reação A especificidade de uma enzima é devido à interação precisa entre substrato e enzima. Essa precisão é resultado da estrutura tridimensional da enzima. Atividade catalítica – especificidade enzimática Tripsina cliva porção carboxiterminal de resíduos de Lisina e Arginina Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Emil Fischer (1894): “chave e fechadura” • Enzimas eram complementares ao tamanho, forma e natureza química do substrato; “Chave e fechadura” pouco eficiente! Modelos de enzima e substrato Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Koshland (1958): encaixe induzido Altera o balanço de forças nova conformação; Substrato: conformação tensionada e distorcida. Modelos de enzima e substrato A enzima não é gasta durante o processo Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Reações não catalisadas tendem a ser lentas – muitas moléculas biológicas são bastante estáveis no ambiente intracelular Sem catálise, as reações necessárias para digestão, contração muscular ou envio de impulsos nervosos não ocorreria em velocidade útil Enzimas: Aumentam a velocidadedas reações Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Enzimas diminuem a energia de ativação Anidrase carbônica oHidratação do CO2 oHidratam 106 moléculas de CO2 por segundo oReação 107 vezes mais rápida que a não catalisada. oReação não catalisada ocorreria em 5 horas Enzimas: Aumentam a velocidade das reações http://www.uff.br/WebQuest/pdf/acidobase.htm Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Catalisador: velocidade da reação NÃO afetam o equilíbrio. Diagrama de coordenadas da reação: Profa. Leonora Rios de Souza Moreira O mesmo ponto de equilíbrio é atingido, porém mais rapidamente na presença de enzimas Enzimas diminuem a energia de ativação Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Valores de aumentos de velocidade de reações catalisadas por enzimas Catalisadores aumentam a velocidade da reação diminuindo a energia de ativação Os grupos funcionais catalíticos das enzimas reagem com o substrato => diminuição da energia de ativação das reações o Formação do complexo ES Enzimas diminuem a energia de ativação Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Enzimas diminuem a energia de ativação e consequentemente aceleram a reação Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Existe uma barreira entre S e P que representa a energia necessária para o alinhamento dos grupos químicos reagentes, rearranjo de ligações, etc oAs moléculas de substrato precisam ser excitadas até um nível maior de energia Uma reação com vários passos, a velocidade total da reação é determinada pelo passo de maior energia de ativação Profa. Leonora Rios de Souza Moreira A enzima é complementar ao estado de transição oAs interações entre a enzima e substrato ocorrem no estado de transição Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Alteração de características do substrato e da enzima no complexo ES Alteração espectroscópicas na enzima bacteriana que catalisa a síntese de L- triptofano a partir de L-serina. o Enzima + serina o Enzima o Enzima + serina + indole Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Baixa [S] Velocidade é proporcional a [S] Velocidade independe da [S] Alta [S] excesso de S As enzimas podem ficar saturadas pelo substrato Profa. Leonora Rios de Souza Moreira • É numericamente igual a [substrato] na qual a velocidade da reação é metade da Vmax • Característico de cada enzima • Reflete a afinidade da enzima pelo seu substrato Profa. Leonora Rios de Souza Moreira E + S ES P k1 k-1 k2 A velocidade máxima da reação (Vmax) será atingida quando quase todas as moléculas de enzima estiverem na forma do complexo ES. constantes de velocidade Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Vmax [S] Vinit = KM + [S] Michaelis-Menten equation Equação de Michaelis-Menten V0 ou V máx [S] Vo Equação da velocidade para uma reação catalisada enzimatica- mente e com um único substrato Relação quantitativa entre a velocidade inicial (V0), a velocidade máxima (Vmax), [S], todas relacionadas pelo Km. Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Quando V0 é metade da Vmax O Km é equivalente à concentração de substrato onde V0 é igual à metade de Vmax Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Km Afinidade da enzima pelo substrato Km Afinidade da enzima pelo substrato Significa que... Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Sinergismo Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Fatores que afetam a velocidade de reações enzimáticas Fatores envolvendo componentes da reação oConcentração do substrato oConcentração da enzima Fatores externos o pH o Temperatura Presença de inibidores Profa. Leonora Rios de Souza Moreira • Condições fixas de: - temperatura - [substrato] - [enzima] Cada enzima tem seu pH ótimo Veloc. pH ótimo Influência do pH na atividade enzimática Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Inibição Enzimática Inibidores enzimáticos são agentes que interferem na catálise, diminuindo ou interrompendo as reações enzimáticas. Inibidores enzimáticos são importantes agentes fármacos oAspirina – inibe a enzima que catalisa o primeiro passo na síntese de prostaglandinas (compostos que produzem sensação de dor) Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Quanto ao tipo: competitiva não-competitiva inibidor a atividade de uma única enzima ou de um grupo restrito de enzimas irreversível reversível inibidor a atividade de todas as enzimas ex: agentes desnaturantes inespecífica - específica - Inibição Enzimática Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Inibição Enzimática Reversível inibidor forma com a enzima um composto instável inibição NÃO envolve modificação covalente Tipos de inibidores reversíveis: o Competitivos o Não competitivos Inibição Enzimática Irreversível inibidor se liga à enzima formando um complexo estável forma-se uma ligação covalente entre o inibidor e a enzima Profa. Leonora Rios de Souza Moreira COMPETITIVA: inibidor liga reversivelmente à enzima e compete com o substrato pelo sítio ativo. Formação do complexo EI que afetam negativamente a eficiência da enzima. NÃO COMPETITIVA: Inibidor e substrato ligam-se em locais diferentes da enzima. O inibidor pode ligar-se a enzima livre ou ao ES, impedindo a reação. Inibição Enzimática Reversível Profa. Leonora Rios de Souza Moreira 55 Inibição Enzimática Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Inibidor competitivo Estrutura semelhante à do substrato Liga-se ao Sítio Ativo da Enzima Inibição Reversível Competitiva Profa. Leonora Rios de Souza Moreira [substrato] necessária para que a enzima funcione normalmente afinidade da enzima pelo substrato Km da enzima aparente Inibição Reversível Competitiva Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Inibição Reversível Competitiva Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Usada para tratar pacientes envenenados por metanol oÁlcool desidrogenase: metanol formoldeído (metanal) • Tóxico. • Cegueira – olhos são sensíveis ao formol Etanol compete com metanol como substrato para enzima o Álcool desidrogenase: etanol acetaldeído (etanal) Inibição Reversível Competitiva Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Inibidor incompetitivo NÃO se liga ao sítio ativo da enzima Inibição Reversível Incompetitiva Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Inibidor não tem semelhança estrutural com o substrato NÃO se liga no sítio ativo da enzima Liga-se ao complexo ES Aumento da [substrato] não diminui a inibição Km da enzima NÃO se altera A VELOCIDADE máxima DIMINUI na presença do inibidor Inibição Reversível Incompetitiva Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Diminui a concentração de enzima ativa Velocidade Máxima da Reação Inibição Reversível Incompetitiva Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Inibição Reversível Incompetitiva Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Inibição Reversível Mista Não se liga ao sítio ativo da enzima Pode ligar-se tanto ao complexoES quanto a E Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Inibição Reversível Mista Inibidor misto Não se liga ao sítio ativo da enzima Liga-se tanto a E quanto ao complexo ES Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Podem ser inibidas reversivelmente por inibidores competitivos que competem pelo sítio ativo da enzima, mas não são transformados pela enzima o Inibidores competitivos competem com o substrato pelo sítio ativo da enzima Inibidores não competitivos ligam-se ao complexo ES e não se ligam ao sítio ativo da enzima Quando o inibidor liga-se a enzima ou ao complexo ES, a inibição é dita mista Inibição Reversível Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Combinam-se com um grupo funcional da enzima oDestroem o Formam ligação covalente muito estável Enzimas podem ser inativadas por modificações irreversíveis de um grupo funcional essencial para a atividade catalítica Inibição Irreversível Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Inibição Irreversível Quimotripsina + DIFP inibe irreversivelmente a enzima Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Enzimas alostéricas apresentam diferentes conformações induzidas por reguladores Enzimas Alostéricas Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Enzimas reguladoras determinam a velocidade de toda uma sequência metabólica, pois catalisa a reação mais lenta oEnzimas alostéricas que funcionam por meio de moduladores alostéricos o Enzimas reguladas por meio de uma ligação covalente reversível Enzimas Alostéricas Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Enzimas alostéricas são geralmente maiores e mais complexas Em alguns sistemas multienzimáticos, a enzima reguladora é inibida pelo produto final da via metabólica em altas concentrações Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Maioria das enzimas segue o padrão michaeliano, entretanto a maioria das enzimas reguladoras são alostéricas Enzimas alostéricas possuem comportamento sigmoidal Profa. Leonora Rios de Souza Moreira 74 Allosteric enzyme kinetics Sigmoidal dependence of V0 on [S], not Michaelis-Menten Enzymes have multiple subunits and multiple active sites Substrate binding may be cooperative Profa. Leonora Rios de Souza Moreira LIGAÇÃO ALOSTÉRICA: efetores (reguladores) ligam não covalentemente em local que não o sítio ativo, alterando afinidade da enzima pelo substrato e/ou a atividade catalítica. Efetores negativos e positivos MODIFICAÇÃO COVALENTE: adição ou remoção de grupos fosfato de resíduos específicos de serina, treonina e tirosina. Fosforilação e desfosforilação o Quinases e Fosfatases Indução ou repressão da síntese o Leva horas para ocorrer aumento. Comum em enzimas de uso específico em uma fase ou momento (não constitutivas). Regulação da atividade enzimática Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Exemplos de modificações covalentes de enzimas Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Regulação da atividade de glicogênio fosforilase . • Forma mais ativa (a)- resíduo de Ser fosforilado • Forma menos ativa (b)- Resíduos defosforilados Glicose -1-fosfato pode ser usada para síntese de ATP no músculo ou convertida em glicose livre no musculo Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Precursos inativo zimogênio é hidrolisado para formar a forma ativa oEx: Enzimas hidrolíticas do estômago e intestino • Tripsinogênio tripsina • Quimotripsinogênio quimotripsina Regulação enzimática por proteólise do precursor enzimático Profa. Leonora Rios de Souza Moreira Profa. Leonora Rios de Souza Moreira
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