CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES

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Dedicatória 
 
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA 
CAMPUS DE BOTUCATU 
 
 
 
 
 
 
ISABEL CANDIA NUNES DA CUNHA 
 
 
 
CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES 
 
 
 
 
 
 
 
 
BOTUCATU - SÃO PAULO 
2002 
 
 
 
Dedicatória 
 
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA 
CÂMPUS DE BOTUCATU 
 
 
 
ISABEL CANDIA NUNES DA CUNHA 
 
 
 
 
CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE CÃES 
 
 
 
 
 
 
Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e 
Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de 
Mesquita Filho” - Câmpus de Botucatu, para a obtenção 
do título de Doutor em Reprodução Animal. 
 
 
 
 
Orientadora: Profª. Ass. Drª. Maria Denise Lopes 
 
 
 
 
 
BOTUCATU - SÃO PAULO 
2002 
Dedicatória 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO 
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP 
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SULAMITA SELMA CLEMENTE COLNAGO 
Cunha, Isabel Candia Nunes da 
 Criopreservação do sêmen de cães / Isabel Candia Nunes da Cunha. – 
2002. 
 
 Tese (doutoramento) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de 
Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2002. 
 
 Orientadora: Maria Denise Lopes 
 
 1. Cão – Sêmen - Criopreservação 
 
 CDD 636.708245 
 
 
Palavras-chave: Sêmen; Cão; Criopreservação 
Dedicatória 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 os meus pais Estevão e Maria e aos meus 
irmãos André e Bruno, que me apoiaram e 
incentivaram a cada passo da minha 
caminhada, dedico. 
A 
Dedicatória 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 gradeço especialmente à Profª Ass. Drª. 
Maria Denise Lopes pela amizade, apoio e 
orientação, sem os quais este trabalho não se 
realizaria.
A 
Agradecimentos 
 
Agradecimentos 
 
 realização deste trabalho só foi possível graças à colaboração direta ou 
indireta de muitas pessoas. Manifesto minha gratidão a todas elas e de forma 
particular: 
À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP, Câmpus 
de Botucatu e Departamento de Reprodução Animal e Radiologia 
Veterinária, pelas oportunidades concedidas. 
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) 
pelo subsidio do projeto e pela concessão da bolsa de estudos. 
Ao Professor Frederico Ozanam Papa, pelas correções e sugestões, sempre 
pertinentes. 
À Professora Fernanda Landim Alvarenga, pela amizade e pela orientação 
quanto à realização do teste de reação acrossômica. 
À Professora Carmem Estefânia Serrra Neto Zúccari pelo apoio e auxilio 
durante as sessões de fotografia e pelas longas horas de discussão, sempre 
muito prazerosas. 
A 
Agradecimentos 
 
Ao Professor Nereu Carlos Prestes pela sua disponibilidade e auxílio durante 
as correções finais e por compartilhar inúmeras risadas nos últimos nove anos. 
Ao Departamento de Clínica Veterinária, pelo empréstimo do microscópio de 
fluorescência. 
Ao Professor Adalberto José Crocci pela assessoria estatísca do Experimento I. 
Ao Professor Paulo Roberto Curi pela assessoria estatística dos 
Experimentos II, III e IV. 
Às bibliotecárias Rosemary Cristina da Silva e Luciana Pizzani pela revisão 
das referências bibliográficas e sugestões. 
Aos Professores, Residentes e Funcionários do Departamento de 
Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, pelo afeto e apoio ao longo 
destes anos. 
À pós-graduanda Fabiana Ferreira de Souza pela ajuda incondicional 
durante a realização de todas as fases deste trabalho. 
A todos os integrantes do Laboratório de Reprodução de Pequenos Animais 
e Silvestres por trabalharem para que nossa especialidade seja reconhecida e 
aprimorada. 
A todos os colegas de Pós-graduação, pelo agradável convívio e sugestões 
sempre pertinentes. 
Agradecimentos 
 
Às grandes amigas Denise, Elaine, Maria Célia, Érika e Juliana por serem, 
acima de tudo, . 
A todos que colaboraram direta ou indiretamente na realização deste trabalho
Amigas 
Epígrafe 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“O futuro não nos traz nem nos dá nada. 
Nós é que, para construí-lo, devemos dar-lhe tudo.” 
Simone Weil
Sumário 
 
Sumário 
 
 
Lista de Figuras .................................................................................. 12 
Lista de Tabelas .................................................................................. 13 
1. Introdução e Revisão Geral _____________________________ 16 
1. Introdução ................................................................................... 17 
2. Revisão Geral ............................................................................. 20 
2.1. Membranas Espermáticas .................................................. 20 
2.2. Estrutura e Composição da Membrana Plasmática ........... 21 
2.3. Respostas da Célula Espermática à Baixas Temperaturas 27 
2.4. Interações dos Componentes dos Diluidores com a Célula 
Espermática ....................................................................... 
31 
2. Experimento I ________________________________________ 41 
1. Revisão de Literatura .................................................................. 42 
1.1. O ejaculado Canino ............................................................. 42 
1.2. A centrifugação ................................................................... 44 
2. Material e Método ....................................................................... 47 
2.1. Animais ................................................................................ 47 
2.2. Coleta do Sêmen ................................................................ 47 
2.3. Exame do Sêmen ................................................................ 48 
2.4. Procedimentos experimentais ............................................. 49 
2.5 Métodos Estatísticos Utilizados............................................. 51 
3. Resultados .................................................................................. 52 
4. Discussão ................................................................................... 55 
3. Experimento II ________________________________________ 58 
1. Revisão da Literatura .................................................................. 59 
2. Material e Método ....................................................................... 64 
2.1. Animais ................................................................................ 64 
2.2. Coleta do Sêmen ................................................................. 64 
2.3. Exame do Sêmen ................................................................ 65 
Sumário 
 
2.4. Procedimentos Experimentais ............................................. 66 
2.5. Métodos Estatísticos Utilizados ........................................... 69 
3. Resultados .................................................................................. 70 
4. Discussão ...................................................................................74 
4. Experimento III _______________________________________ 77 
1. Revisão da Literatura .................................................................. 78 
2. Material e Método ..................................................................... 81 
2.1. Animais ................................................................................ 81 
2.2. Coleta do Sêmen ................................................................. 81 
2.3. Exame do Sêmen ................................................................ 82 
2.4. Procedimentos Experimentais ............................................. 83 
2.5. Métodos Estatísticos Utilizados ........................................... 85 
3. Resultados .................................................................................. 87 
4. Discussão ................................................................................... 90 
5. Experimento IV _______________________________________ 94 
1. Revisão de Literatura .................................................................. 95 
2. Material e Método ..................................................................... 102 
2.1. Animais ................................................................................ 102 
2.2. Coleta do Sêmen ................................................................. 102 
2.3. Exame do Sêmen ................................................................ 103 
2.4. Procedimentos Experimentais ............................................. 106 
2.5. Métodos Estatísticos Utilizados ........................................... 109 
3. Resultados .................................................................................. 110 
4. Discussão ................................................................................... 114 
6. Conclusões __________________________________________ 120 
7. Referências Bibliográficas ______________________________ 122 
8. Anexos ______________________________________________ 135 
9. Resumo _____________________________________________ 143 
10. Abstract ____________________________________________ 147 
Lista de Figuras 
 
Lista de Figuras 
 
 
 
 
Experimento I 
 
FIGURA 1 - Esquema de formação dos grupos experimentais........ 50 
 
Experimento II 
 
FIGURA 1 - Esquema de formação dos grupos experimentais........ 68 
 
Experimento III 
 
FIGURA 1 - Esquema de formação dos grupos experimentais........ 84 
 
Experimento IV 
 
FIGURA 1 - Espermatozóides caninos corados com Fitc-PNA 
(emitindo fluorescência verde) e pelo PI (emitindo 
fluorescência vermelha). a – reação acrossomal 
verdadeira, b - falsa reação do acrossomo c – 
espermatozóides lesados.............................................. 
 
 
 
 
105 
FIGURA 2 - Esquema de formação dos grupos experimentais ....... 108 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lista de Tabelas 
 
Lista de Tabelas 
 
 
 
 
 
Experimento I 
 
TABELA 1 - Valores médios de motilidade espermática (%) do 
sêmen de cães, nos os 4 grupos estudados, após o 
processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 
2002............................................................................... 
 
 
 
52 
 
TABELA 2 - Valores médios de vigor espermático (escore de 0-5) 
do sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o 
processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 
2002............................................................................... 
 
 
 
53 
 
TABELA 3 - Valores medianos da aglutinação espermática do 
sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o 
processo de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 
2002............................................................................... 
 
 
 
53 
 
TABELA 4 - Porcentagem média de células espermáticas íntegras 
transformadas em arc sen √x (em rad) do sêmen de 
cães, nos 4 grupos estudados, após as centrifugações 
(M1). Botucatu, 2002..................................................... 
 
 
 
54 
 
Experimento II 
 
TABELA 1 - Mediana da motilidade espermática (%) do sêmen de 
cães avaliada antes e após o período de equilíbrio 
(M1) e (M2) nos doze grupos propostos. Botucatu, 
2002............................................................................... 
 
 
 
70 
 
TABELA 2 - Mediana da motilidade espermática (%) do sêmen de 
cães avaliada antes e após o período de equilíbrio 
(M1) e (M2) nos grupos tratados com meio TRIS 
Botucatu, 2002.............................................................. 
 
 
 
71 
 
TABELA 3 - Mediana do vigor espermático (escore de 0-5) do 
sêmen de cães avaliado antes e após o período de 
equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. 
Botucatu, 2002. ............................................................ 
 
 
 
72 
 
TABELA 4 - Mediana da porcentagem de células íntegras no 
sêmen de cães avaliada antes e após o período de 
equilíbrio (M1) e (M2) nos doze grupos propostos. 
Botucatu, 2002.............................................................. 
 
 
 
73 
Lista de Tabelas 
 
Experimento III 
 
TABELA 1 - Medianas da motilidade espermática (%) do sêmen 
canino congelado e descongelado avaliadas após o 
período de equilíbrio (M1) após 10 minutos da 
descongelação (M2) e após o teste de longevidade 
(M3), nos seis grupos propostos. Botucatu, 2002......... 
 
 
 
 
87 
 
TABELA 2 - Medianas do vigor espermático (escore de 0 - 5) do 
sêmen canino congelado e descongelado avaliadas 
após o período de equilíbrio (PE) (M1) após 10 
minutos da descongelação (M2) e após o teste de 
longevidade (M3), nos seis grupos propostos. 
Botucatu, 2002.............................................................. 
 
 
 
 
 
88 
 
TABELA 3 - Medianas da integridade das membranas 
espermáticas (%) do sêmen canino congelado e 
descongelado avaliadas após o período de equilíbrio 
(PE) (M1) após 10 minutos da descongelação (M2) e 
após o teste de longevidade (M3), nos seis grupos 
propostos. Botucatu, 2002............................................ 
 
 
 
 
 
89 
 
Experimento IV 
 
TABELA 1- Medianas da motilidade espermática (%) do sêmen 
canino congelado e descongelado avaliadas após a 
diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 10 
minutos da descongelação (M3) e após o teste de 
longevidade (M4), nos seis grupos propostos. 
Botucatu, 2002.............................................................. 
 
 
 
 
 
110 
 
TABELA 2- Medianas do vigor espermático (escore de 0 - 5) do 
sêmen canino congelado e descongelado avaliadas 
após a diluição (M1) período de equilíbrio (M2) após 
10 minutos da descongelação (M3) e após o teste de 
longevidade (M4), nos seis grupos propostos. 
Botucatu, 2002.............................................................. 
 
 
 
 
 
110 
 
TABELA 3 - Medianas da integridade das membranas 
espermáticas (%) do sêmen canino congelado e 
descongelado avaliadas após a diluição (M1) período 
de equilíbrio (M2) após 10 minutos da descongelação 
(M3) e após o teste de longevidade (M4), nos seis 
grupos propostos.Botucatu, 2002.................................. 
 
 
 
 
 
110 
 
 
 
 
Lista de Tabelas 
 
 
TABELA 4 - Medianas da qualidade do movimento espermático 
descrito por motilidade total (MT), motilidade 
progressiva (MP), velocidade média (VAP) e 
linearidade do movimento (LIN) avaliada após 30 
minutos da descongelação. Botucatu, 2002.................. 
 
 
 
 
112 
 
TABELA 5 - Mediana da porcentagem de células espermáticas de 
cães lesadas (Ls) e com reação do acrossomo 
verdadeiras (Rv) após a descongelação.Botucatu, 
2002...............................................................................113 
 
 
 
 
 
 
Introdução e Revisão Geral 
 
16
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. Introdução e 
Revisão Geral 
 
Introdução e Revisão Geral 
 
17
1. INTRODUÇÃO 
 
 
 
O interesse na reprodução dos cães, tanto com objetivo 
de melhoramento e difusão de diferentes raças ou como modelo 
experimental para a preservação de canídeos silvestres, desponta como 
um vasto campo para os pesquisadores da atualidade. 
Para que tais objetivos sejam atingidos com sucesso faz-
se necessário o aprimoramento de biotecnologias de avaliação, 
manipulação e conservação do sêmen dos canídeos, assim como, o 
conhecimento e controle do ciclo estral, com desenvolvimento de métodos 
precisos para a detecção da ovulação e de técnicas acessíveis e menos 
cruentas para o depósito do sêmen no trato genital da fêmea. 
Os primeiros animais prenhes por inseminação artificial 
(IA) foram cães, inseminados com sêmen a fresco, em estudos 
conduzidos pelo abade Lazzaro Spallanzani no ano de 1780, na Itália, 
provenientes desta experiência deu-se o nascimento de três produtos 
vivos e normais (Mies Filho, 1987). 
Elias Ivanov, após os trabalhos pioneiros de Spallanzani, 
demonstrou que a fecundação era possível mesmo quando se 
substituíam os líquidos produzidos pelas glândulas anexas masculinas por 
um soro artificial. O mesmo autor, prosseguindo os estudos sobre 
reprodução, esclareceu o papel do frio na conservação do sêmen extra-
organismo (Mies Filho, 1987). 
A primeira gestação decorrente de IA com sêmen canino 
preservado em leite pasteurizado e refrigerado por 7 dias, foi descrita por 
Harrop (1954). A refrigeração é um processo de preservação do sêmen a 
Introdução e Revisão Geral 
 
18
uma temperatura de 5ºC por um período determinado indicado em alguns 
casos como, quando o macho e a fêmea encontram-se em lugares 
distintos de difícil acesso, ou nos casos de impedimento legal da entrada 
de animais em outro estado ou país, antes de um determinado período de 
observação (Cunha, 1997; Johnston et al., 2001). 
O sucesso na congelação de sêmen canino foi descrito 
por Rowson (1954). Coincidentemente, Seager (1969) anunciou a 
primeira prenhez, resultante de uma inseminação artificial com sêmen 
congelado em cães. 
Estudos realizados com sêmen congelado de cães 
demonstraram que, aparentemente, o espermatozóide descongelado não 
apresenta a mesma motilidade e vigor do sêmen fresco ou refrigerado, 
conseqüentemente, sua sobrevivência no trato genital feminino é reduzida 
(Gill et al., 1970; Oettlé, 1986; Linde-Forsberg e Forsberg, 1989; Morton e 
Bruce, 1989; Rota et al., 1995; England e Ponzio, 1996; Gabaldi e Lopes, 
1998; Peña et al., 1998; Johnston et al., 2001). 
Rotineiramente, o sêmen congelado é utilizado para a 
inseminação artificial em outras espécies como a bovina, eqüina, ovina e 
caprina, e, na maioria delas, o sêmen descongelado é depositado no 
útero, evitando desse modo, a barreira cervical, o que não ocorre na 
espécie canina, onde o sêmen é normalmente depositado no fundo da 
vagina (Morton e Bruce, 1989; Linde-Forsberg e Forsberg, 1989). 
As técnicas de preservação de sêmen em baixas 
temperaturas, causam diminuição da fertilidade, devido principalmente, as 
lesões estruturais e funcionais dos espermatozóides advindas do estresse 
térmico (Morton e Bruce, 1989; Jasko, 1994). 
O estudo da complexa estrutura e funcionamento da 
membrana plasmática (MP) é um dos passos mais importantes para o 
Introdução e Revisão Geral 
 
19
entendimento das interações das células espermáticas com o meio que as 
circunda e ainda para que se minimizem os efeitos deletérios causados 
pelas alterações provocadas por diminuição ou aumento da temperatura, 
alterações no pH e na osmolaridade (Watson, 1981; Gennis, 1989). 
O caráter bioquímico dos componentes dos meios 
diluidores, a maneira como interagem com os espermatozóides e a 
possibilidade de sua metabolização ou até, os possíveis efeitos adversos 
aos espermatozóides devem ser minuciosamente avaliados. 
A técnica de preservação mais estudada no sêmen dos 
canídeos é a congelação, porém, existem ainda algumas dificuldades 
encontradas na padronização desta metodologia, devido principalmente, 
às particularidades inerentes a esta espécie. 
Em vista do exposto é que tivemos como objetivo deste 
trabalho estudar e avaliar o efeito de diferentes etapas da criopreservação 
do sêmen canino dando-se principal enfoque a: 
9 Verificar o efeito do processo de centrifugação sobre 
a qualidade do sêmen canino (experimento I). 
9 Verificar o efeito de diferentes períodos de equilíbrio e 
momentos de glicerolização sobre o sêmen canino 
(experimento II). 
9 Verificar o efeito de diferentes períodos de equilíbrio e 
diluidores na congelação do sêmen canino 
(experimento III). 
9 Verificar o efeito de três diferentes diluidores sobre o 
sêmen canino descongelado sob dois diferentes 
protocolos (experimento IV). 
 
Introdução e Revisão Geral 
 
20
2. REVISÃO GERAL 
 
 
 
2.1. MEMBRANAS ESPERMÁTICAS 
 
O estudo detalhado da estrutura e função das membranas 
espermáticas torna-se extremamente necessário quando objetivamos 
empregar, com êxito, biotécnicas de preservação espermática. 
Todas as células - procariontes ou eucariontes - são 
circundadas por uma membrana plasmática (MP) que define a delimitação 
da célula, separando seu conteúdo do meio que a circunda. Por servir de 
barreira seletiva, a MP determina a composição do citoplasma celular 
(Cooper, 1996), e, tem, papel fundamental na maioria dos fenômenos 
celulares (Singer e Nicolson, 1972). 
Segundo descrito por Singer e Nicolson (1972), o modelo 
básico das membranas biológicas segue a organização estrutural de: 
bicamada de fosfolipídios com proteínas associadas (Gennis, 1989; 
Cooper, 1996). O mesmo modelo é também verificado nas membranas 
espermáticas (Watson, 1981; Watson, 1995). 
Nos espermatozóides, o duplo folheto não é, 
simplesmente, uma bicamada passiva de membrana lipídica em que 
receptores recebem seus sinais moleculares específicos, mas sim, uma 
estrutura altamente especializada, assumindo um papel ativo na 
capacidade fertilizante, recebendo sinais e modificando-se ao longo do 
processo de espermatogênese, trânsito e armazenagem no epidídimo, 
ejaculação, depósito no trato genital feminino e, finalmente, capacitação e 
Introdução e Revisão Geral 
 
21
penetração do oócito (Bayard, 1982; O´Rand, 1982; Holt, 1995; Watson, 
1995; Lenzi et al., 1996). 
O padrão definitivo de lipídeos dos espermatozóides de 
um ejaculado só é estabelecido após sua maturação epididimária (Holt, 
1984; Watson, 1995; Lenzi et al., 1996). Holt (1984) sugeriu que, além 
das modificações da superfície celular, relatadas como de maior 
importância neste processo, ocorrem ainda modificações no interior da 
MP dos espermatozóides durante sua passagem pelo epidídimo como 
modulação da fluidez, da permeabilidade e da mobilidade das proteínas 
integrais das membranas. 
Fatores externos às células espermáticas, tais como, 
alterações na composição, pH, temperatura e osmolaridade do meio que 
as circunda, podem provocar alterações irreversíveis em suas membranas 
limitando a função fertilizante dos espermatozóides (Gennis, 1989; 
Watson, 2000). 
 
2.2. ESTRUTURA E COMPOSIÇÃO DA MEMBRANA 
PLASMÁTICA 
 
9 Lipídeos 
Uma grande variedade de lipídeos pode constituir a MP 
de uma célula e a razão para a existência de tal diversidade parece estar 
diretamente ligada à função específicaque cada membrana exercerá. A 
heterogeneidade em sua constituição, levando a uma especificidade de 
função, é o fator mais intrigante quanto à composição das membranas 
biológicas (Gennis, 1989). 
Introdução e Revisão Geral 
 
22
As principais classes lipídicas encontradas na MP dos 
espermatozóides de mamíferos e de aves não são diferentes daquelas 
encontradas em outras células animais, e incluem, primariamente, 
fosfolipídios, glicolipídios e esteróis. Contudo, a maioria das espécies 
moleculares dentro dessas classes lipídicas são também particulares dos 
espermatozóides e apresentam proporções variando substancialmente 
com o estágio de maturação e desenvolvimento desta célula e ainda com 
as espécies animais (Parks e Graham, 1992; Watson, 1995). 
Os fosfolipídios são constituintes de grande parte das 
membranas espermáticas, sendo responsáveis por cerca de 60 a 70% 
dos lipídeos totais de um ejaculado (Watson, 1981). São moléculas 
anfipáticas constituídas por duas cadeias de ácidos graxos hidrofóbicos 
ligados a um grupo fosfato que constitui a cabeça hidrofílica (Gennis, 
1989; Cooper, 1996). 
Devido ao fato das caudas dos ácidos graxos serem 
dificilmente solúveis em água, os fosfolipídios, espontaneamente, formam 
uma bicamada quando em solução aquosa, com suas caudas 
hidrofóbicas voltadas para o interior da membrana, e seus grupos polares 
da cabeça, expostos para os dois lados, em contato com a solução 
aquosa (Cooper, 1996). 
Em adição aos fosfolipídios, a MP das células animais 
contém ainda glicolipídios e colesterol. Membranas diferentes podem 
conter quantidades distintas destes constituintes, diferindo em seus 
comprimentos e graus de saturação. Em combinação, estes parâmetros 
são importantes na determinação das propriedades dinâmicas das 
membranas (Widnell e Pfenninger, 1990). 
Os glicolipídios são encontrados exclusivamente no 
folheto externo da MP, com a porção glicosilada exposta na superfície 
Introdução e Revisão Geral 
 
23
celular. Estes são, relativamente, o menor componente, constituindo cerca 
de 2% dos lipídeos totais da MP (Cooper, 1996). 
O colesterol por outro lado, é o maior componente da MP 
de células animais, estando presente nas mesmas quantidades molares 
que os fosfolipídios (Cooper, 1996). A quantidade de colesterol 
encontrada na membrana espermática varia entre suas diferentes partes 
(e.x., a taxa de colesterol/fosfolipídio da membrana espermática é maior 
do que a da membrana acrossomal), entre as espécies animais e ainda 
varia entre indivíduos de uma mesma espécie (Gennis, 1989; Amann e 
Graham, 1993; Holt, 1995; Cross, 1998). 
Devido a sua estrutura de espiral rígido, o colesterol 
exerce uma função distinta na estrutura da membrana. Este, sozinho, não 
pode agrupar-se e formar uma bicamada, mas está inserido na bicamada 
de fosfolipídios, com seu grupo polar hidroxil voltado para a cabeça do 
grupo fosfolipídio (Cross, 1998; Cooper, 1996). O colesterol tem 
importante papel na regulação da estabilidade e da permeabilidade da MP 
(Yeagle, 1985), sendo que o efluxo de colesterol da MP dos 
espermatozóides é o primeiro passo para o início do processo de 
capacitação (Seki et al., 1992). 
Cross (1998) relatou que a taxa colesterol/fosfolipídio 
existente na membrana espermática exerce importante papel regulador do 
processo de capacitação espermática, e que, trocas de colesterol por 
fosfolipídios entre a MP e o meio externo, diminuindo o conteúdo de 
colesterol, e aumentando, com isso sua fluidez, desencadeiam a reação 
do acrossomo por: diminuir a microviscosidade da MP , diminuir a adesão 
entre os fosfolipídios e, talvez, permitir um maior influxo de cálcio para a 
célula espermática. Todos estes seriam passos inespecíficos que 
intermediariam a fusão da membrana plasmática com a membrana 
Introdução e Revisão Geral 
 
24
acrossomal externa, processo fusogênico conhecido por reação do 
acrossomo. 
Cross (1998) considerou ainda que a MP de um 
espermatozóide recém ejaculado é incapaz de sofrer a reação do 
acrossomo por estar, de alguma maneira, “congelada” pela alta 
quantidade de colesterol em sua estrutura. 
Dependendo da temperatura, o colesterol exerce efeitos 
distintos sobre a fluidez da membrana. Em altas temperaturas, o 
colesterol interfere no movimento das cadeias de ácidos graxos dos 
fosfolipídios, tornando a parte interna da membrana menos fluida, 
reduzindo a permeabilidade à pequenas moléculas. Em baixas 
temperaturas contudo, o colesterol exerce efeito contrário por interferir 
nas interações entre as cadeias de ácidos graxos, prevenindo a 
membrana dos efeitos da refrigeração e mantendo a sua fluidez (Cooper, 
1996). 
A organização estrutural em forma de bicamada é 
essencial para que as funções primordiais da MP sejam cumpridas, esta 
conformação, composta de duas dimensões fluidas, permite que 
moléculas individuais, lipídeos ou proteínas encontrem-se livres para 
movimentos de rotação ou ainda para a movimentação lateral através da 
membrana (Gennis, 1989; Cooper, 1996). 
 
9 Proteínas 
Enquanto os lipídeos são os elementos estruturais 
fundamentais das membranas, as proteínas são responsáveis por 
intermediar e realizar suas funções específicas (Cooper, 1996). 
Introdução e Revisão Geral 
 
25
Quanto a sua massa, a MP é constituída de 
aproximadamente 50% de lipídeos e 50% de proteínas, com as porções 
de carboidrato dos glicolipídios e das glicoproteinas constituindo 5 a 10% 
(Singer e Nicolson, 1972; Widnell e Pfenninger, 1990; Amann e Graham, 
1993; Cooper, 1996). Por serem as proteínas muito maiores que os 
lipídeos, esta porcentagem corresponde a aproximadamente uma 
molécula de proteína para cada 50 a 100 moléculas de lipídeos (Cooper, 
1996). 
Segundo Amann e Graham (1993), embora uma grande 
parte destas proteínas sejam histonas envolvidas no acondicionamento 
de DNA, outras estão envolvidas com enzimas do acrossomo, receptores 
da MP, elementos de funcionalidade da membrana (transporte de íons e 
carboidratos) e estruturas do citoesqueleto (dando formato à cabeça ou 
provendo os filamentos da cauda). 
Singer e Nicolson (1972) distinguiram duas classes de 
proteínas associadas à membrana, chamando-as de proteínas periféricas 
e integrais à membrana. As proteínas periféricas não estão inseridas no 
interior hidrofóbico da bicamada lipídica, em vez disso, encontram-se 
indiretamente associadas com as membranas através de interações 
protéicas, que, freqüentemente, envolvem ligações iônicas que se 
desfazem por pH extremo ou frente a altas concentrações de sais. As 
proteínas integrais à membrana só podem ser liberadas por tratamentos 
que rompam a bicamada de fosfolipídios. 
Muitas das proteínas integrais são chamadas 
transmembrana, por apresentarem vários mergulhos na bicamada de 
fosfolipídio, desta forma, apresentam porções expostas para os dois lados 
da membrana. Assim como os fosfolipídios, as proteínas transmembrana 
são moléculas anfipáticas, com suas porções hidrofílicas expostas para o 
meio aquoso, dos dois lados da membrana. Algumas destas proteínas 
Introdução e Revisão Geral 
 
26
mergulham somente uma vez na membrana, outras realizam múltiplos 
mergulhos (Cooper, 1996). 
As proteínas e os fosfolipídios não são tão hábeis em se 
movimentar de um folheto para o outro da bicamada, por estarem 
inseridos em uma camada fluida, tanto os lipídeos como as proteínas são 
capazes de se difundir, com muita facilidade lateralmente através da 
membrana (Cooper, 1996). 
Ainda assim nem todas as proteínas são capazes de 
difundir-se livremente pela MP. Em alguns casos, a mobilidade dasproteínas da membrana é restrita por associações com o citoesqueleto. 
Com intenção de manter funções distintas, algumas vezes a mobilidade 
das proteínas da MP pode ser restrita a domínios apropriados da 
superfície celular (Cooper, 1996). 
Imediatamente após a espermiogênese, o 
espermatozóide recém formado possui 3 áreas maiores de domínio em 
sua MP: cauda posterior, cauda anterior e conjunto da cabeça (Bartles, 
1995). Em uma divisão futura, o domínio do conjunto da cabeça da MP 
dos espermatozóides divide-se em cabeça anterior e cabeça posterior, 
após sua passagem pela rete testis e pelo epidídimo (Holt, 1984; Bartles, 
1995). 
9 Glicocálice 
Como já descrito anteriormente, a porção extracelular das 
proteínas da MP geralmente é glicosilada, com a porção carboidrato 
exposta na face externa da MP, conseqüentemente, a superfície da célula 
é coberta por uma camada de carboidratos, conhecida como glicocálice, 
formada por oligossacarídeos de glicolipídios e glicoproteinas 
transmembrana (Cooper, 1996). 
Introdução e Revisão Geral 
 
27
Uma parte da função dos glicocálices é de proteger a 
superfície celular. Além disso, os oligossacarídeos dos glicocálices 
servem de marcadores para uma grande variedade de interações 
celulares (Cooper, 1996). 
Amann e Graham (1993) citaram a presença do 
glicocálice na superfície da membrana espermática. Afirmaram, ainda, 
que muitas das proteínas da superfície externa da MP dos 
espermatozóides contêm cadeias de carboidratos que tendem a formar 
um campo de carga negativa e a atrair, e ligar-se, negligentemente, a 
outras proteínas do meio que os circunda. Devido a este material 
adsorvido, o aspecto externo da região do glicocálice dos 
espermatozóides pode variar, dependendo da sua situação ou do meio 
em que ele se encontra. 
 
2.3. RESPOSTAS DA CÉLULA ESPERMÁTICA Á BAIXAS 
TEMPERATURAS 
 
A congelação e a posterior descongelação, com a 
manutenção de todas as funções vitais, é um desafio alcançado com 
sucesso por alguns microorganismos da natureza (Mazur et al. 1972). 
O resfriamento leva a célula a um estado de quiescência, 
reduzindo o metabolismo e proporcionando uma diminuição nos gastos 
energéticos e na produção de catabólitos tóxicos, contribuindo para a 
preservação celular. Da mesma maneira que a congelação pode diminuir 
ou paralisar algumas reações bioquímicas celulares, ela pode, também, 
acelerar outras, levando a danos ou mesmo a morte celular (Mazur et al. 
1972, Watson, 1981; Watson, 1995; Holt, 2000). 
Introdução e Revisão Geral 
 
28
Todos estes efeitos podem se apresentar de maneira 
diferente entre as várias espécies animais, entre indivíduos de uma 
mesma espécie e ainda entre os compartimentos do espermatozóide, 
como o acrossômico ou o mitocondrial (Watson, 1995; Holt, 2000; Kirk, 
2001). 
De acordo com Jasko (1994), as técnicas de preservação 
do sêmen em baixas temperaturas, como a refrigeração ou a congelação, 
causam uma diminuição da fertilidade, devido às injúrias ocorridas nas 
células espermáticas, advindas do choque térmico. 
O termo Estresse Térmico ou Choque Térmico define 
um conjunto de alterações ocorridas nos espermatozóides dos mamíferos 
quando resfriados rapidamente da temperatura corpórea até temperaturas 
próximas a 50C, que tem como consequência um decréscimo irreversível 
da motilidade espermática, mudanças na bioquímica e no funcionamento 
das células espermáticas incluindo: diminuição da taxa da glicólise, da 
respiração celular e da frutólise, aumento na degeneração do ácido 
desoxirribonucléico e liberação de material intracelular (Amann e Graham, 
1993; Jasko, 1994; Zúccari, 1998; Holt, 2000; Watson, 2000). 
A maioria das alterações causada pelo estresse térmico 
se inicia na membrana espermática (Jasko, 1994, Holt, 2000). A alteração 
da temperatura, assim como alterações de osmolaridade, pressão ou pH 
podem determinar mudanças na estrutura e organização da bicamada de 
fosfolipídios (Gennis, 1989). 
A redução de temperatura de 37ºC a valores próximos de 
4-5ºC pode levar ao rearranjo de alguns fosfolipídios semelhantes dentro 
da bicamada, que podem agrupar-se e assumir configuração hexagonal 
do tipo II, na qual, as cabeças polares hidrofílicas dos fosfolipídios se 
agrupam formando micelas, com suas caudas hidrofóbicas voltadas para 
o lado externo. Com este rearranjo as propriedades básicas da membrana 
Introdução e Revisão Geral 
 
29
biológica, como permeabilidade seletiva e difusão lateral de proteínas, 
não são mantidas alterando a funcionalidade da membrana em questão 
(Watson, 1981; Gennis, 1989; Parks e Graham, 1992; Amann e Graham, 
1993; Jasko, 1994; Watson, 1995; Holt, 2000; Watson, 2000). 
Watson (2000) citou ainda que outros elementos da 
bicamada de fosfolipídios podem ser extremamente afetados pela queda 
da temperatura, um exemplo seria a mobilidade das proteínas integrais 
que poderá ser restrita pelo efeito da fase transicional dos lipídios, o que 
levará a uma alteração em suas atividades, especialmente aquelas 
proteínas dependentes de sua modulação estrutural para a manutenção 
de suas funções, como é o caso das proteínas formadoras dos canais 
iônicos. 
A regulação do influxo de cálcio é claramente afetada pelo 
resfriamento, sendo indiscutivelmente, uma das mais graves alterações 
em termos de função espermática, e, em alguns casos, esta alteração 
pode ser incompatível com a viabilidade espermática. A entrada de cálcio 
na célula durante o resfriamento, mimetizando o que ocorre 
fisiológicamente durante a capacitação, contribui para o inicio das reações 
fusogênicas entre a membrana plasmática e a membrana acrossomal 
externa. Watson (2000) relatou a existência de uma grande similaridade 
entre os danos verificados na MP durante a congelação e as alterações 
verificadas após a reação do acrossomo, este autor considerou uma a 
versão desorganizada da outra. 
Segundo a revisão de Watson (2000) existem ainda 
alguns elementos do citoesqueleto espermático sensíveis a alterações de 
temperatura, como é o caso dos filamentos de actina. O mesmo autor 
relatou que a despolimerização da F-actina é uma das etapas necessárias 
para permitir a aproximação da MP e da membrana acrossomal externa, 
promovendo a exocitose acrossomal e que, talvez, esta possa ser uma 
Introdução e Revisão Geral 
 
30
das explicações para a fusão desorganizada das membranas após o 
resfriamento e a criopreservação dos espermatozóides. 
Com o declínio constante da temperatura, as células 
estarão expostas à temperatura de congelação (abaixo de 0ºC), e com 
isto, as células espermáticas serão expostas a alterações de 
osmolaridade do meio que as circunda. A água presente no meio 
extracelular encontra-se sob a forma de solução, com a congelação de 
parte desta água, a saturação de solutos aumenta, tornando hipertônico o 
meio externo. Neste momento, para que um equilíbrio osmótico seja 
atingido, ocorre um efluxo de água da célula a ser congelada para o meio 
externo. Esta tentativa da célula em equilibrar o meio que a circunda pode 
levá-la a sofrer um efeito deletério devido a grande desidratação e a 
exposição a um meio extremamente saturado. Este efeito é chamado de 
Efeito de Solução e é considerado um dos pontos críticos no processo 
de congelação das células espermáticas (Mazur et al. 1972; Watson, 
1981; Watson, 1995; Holt, 2000). 
Quando se congela uma célula lentamente, existe tempo 
hábil para que uma grande quantidade de água migre da célula 
espermática para o meio extracelular, na tentativa de reverter os danos do 
efeito de solução. Neste caso, é imprescindível que a descongelação sefaça também lentamente, para que os volumes de água sejam 
reequilibrados antes da total descongelação, evitando que grandes 
alterações do volume celular provoquem lesão da membrana 
espermática, por outro lado, se a congelação se dá rapidamente não 
ocorre uma grande alteração no volume de água no interior da célula e 
microcristais de gelo serão ali formados. A descongelação neste caso 
deve ser realizada também de maneira rápida, pois, se esta é realizada 
de maneira lenta a água intracelular se descongela em um momento em 
que existe ainda temperatura baixa o suficiente para haver uma 
recristalização da água recém descongelada. Se isto acontecer, grandes 
Introdução e Revisão Geral 
 
31
cristais, advindos da recristalização se formarão, expondo a célula ao 
risco de sofrer perfurações por estes grandes cristais de gelo (Mazur et al. 
1972, Watson, 1981, Watson, 1995, Holt, 2000). 
Watson (1995) afirmou ainda que a habilidade em 
suportar o choque térmico é adquirida pelos espermatozóides durante sua 
passagem pelo epidídimo e que esta capacidade de suportar flutuações 
de temperatura está diretamente relacionada com as mudanças nos 
lipídios das membranas espermáticas que ocorrem neste momento. Este 
mesmo autor sugeriu ainda que alterações tanto na freqüência das 
ejaculações, como no tempo do trânsito epididimário e da exposição dos 
espermatozóides aos fluidos epididimários, podem ser uma explicação em 
potencial, para diferenças de congelabilidade entre ejaculados de um 
mesmo indivíduo. 
Um dos aspectos de maior questionamento dentro dos 
estudos da criopreservação é saber quando as alterações ocorrem, se 
durante o congelamento ou se no descongelamento. Existem evidências 
sugestivas de que células congeladas podem ser danificadas pela 
descongelação e este efeito tem sido atribuído, principalmente, à 
recristalização dos microcristais durante uma descongelação inapropriada 
(Watson, 1995). 
 
2.4. INTERAÇÕES DOS COMPONENTES DOS DILUIDORES 
COM A CÉLULA ESPERMÁTICA 
 
Um protocolo de preservação adequado deve manter o 
potencial fertilizante das células espermáticas que deverão, ao final de 
todo o processo, apresentar a vitalidade necessária para atingir o local da 
fertilização e estarem aptas a concluir a capacitação e a reação 
acrossômica, que constituem o estágio final de maturação espermática e 
Introdução e Revisão Geral 
 
32
possibilitam a fecundação de um oócito (Watson, 1995; Rota, 1998; Ström 
Holst, 1999; Peña, 2000). 
Tanto para a refrigeração como para a congelação do 
sêmen, diluidores são utilizados com o intuito de proteger os 
espermatozóides de todos os efeitos críticos do processo de congelação. 
Para tanto, deverão ser adicionadas, aos diluidores, macromoléculas 
como lipoproteínas e fosfolipídios que atuarão como estabilizadores da 
MP e como crioprotetores. Deveremos ainda fornecer fonte de nutrientes 
para o metabolismo espermático e meio tampão para a manutenção do 
pH. O desenvolvimento de um meio diluidor está sempre voltado para a 
obtenção de uma boa estabilização dos componentes da MP (Parks e 
Graham, 1992; Jasko, 1994). 
Holt (2000) em sua revisão afirmou existirem diferenças 
na composição lipídica da MP entre espécies, raças e ainda entre 
indivíduos da mesma espécie, sendo talvez, a explicação para que um 
mesmo meio diluidor confira maior ou menor proteção aos 
espermatozóides de um determinado indivíduo. Watson (2000) e Kirk 
(2001) consideraram os indivíduos como “bons congeladores” e “maus 
congeladores”, e estas duas classes se diferenciam pela capacidade dos 
indivíduos em tolerar os efeitos deletérios da criopreservação. 
 
9 Açúcares 
Os açúcares têm sido incluídos nos diluidores para 
conservação de sêmen a baixas temperaturas como substrato de energia 
endógena, como componente osmótico e como agente crioprotetor 
(Farstad, 1996; Peña, 1997; Holt, 2000; Johnston et al., 2001). 
 
Introdução e Revisão Geral 
 
33
O espermatozóide, como outras células, é capaz de 
metabolizar os hidratos de carbono mediante um mecanismo oxidativo ou 
aeróbico (do qual restam como resíduo CO2 e H2O), ou por mecanismo 
anaeróbico (de degradação incompleta), na qual a quebra dos 
carboidratos estaciona na fase do ácido lático, que se acumula (Pérez e 
Pérez, 1994). 
Rigau et al. (2001), partindo do princípio de que os 
espermatozóides podem metabolizar tanto a glicose como a frutose, 
avaliaram os efeitos destas duas hexoses sobre o padrão de motilidade 
espermática em cães. Os autores concluíram que a frutose induz um 
padrão de motilidade mais rápido e mais linear que a glicose e 
especularam ainda que a incubação em presença de glicose resultou em 
padrão de motilidade semelhante àquele verificado em espermatozóides 
caninos hiperativados. 
Os di e trissacarídeos, não metabolizáveis pelos 
espermatozóides, exercem ainda um efeito crioprotetor em função de seu 
alto peso molecular, contribuindo para o equilíbrio osmótico atuando como 
substitutos de eletrólito. Não possuem capacidade de penetrar a 
membrana quando a concentração de solutos é elevada e dão melhores 
resultados quando acrescidos à fração glicerolizada do extensor 
(Salisbury e Vandemark, 1978). 
Além de suas propriedades coligativas, os açúcares 
exercem efeito crioprotetor interagindo diretamente com a membrana. 
Estas interações envolvem ligações de hidrogênio dos grupos hidroxil dos 
açúcares com o grupo fosfato localizados na cabeça dos fosfolipídios. Por 
restaurar o percentual de água ao redor dos grupos polares da cabeça 
dos fosfolipídios, os açúcares podem prevenir os danos causados pela 
desidratação extrema que pode ocorrer com a congelação (Holt, 2000). 
Geralmente, os dissacarídeos (sucrose, trealose) são mais efetivos em 
estabilizar a bicamada do que os monossacarídeos (De Leeuw, 1993). 
 
Introdução e Revisão Geral 
 
34
9 Gema de ovo 
Desde que Phillips e Lardy (1940) descobriram os efeitos 
benéficos da gema de ovo na conservação dos espermatozóides, muitos 
estudos foram realizados para elucidar a origem da indiscutível “ação 
benéfica” que este produto oferece aos espermatozóides na condução da 
conservação “in vitro”. 
O principal efeito protetor da gema do ovo parece ocorrer 
pela diminuição dos efeitos negativos do choque frio estabilizando as 
membranas espermáticas (Holt, 2000). Watson (1979) demonstrou que 
uma lipoproteína de baixa densidade encontrada na gema de ovo é o 
fator ativo que protege a célula espermática do choque frio, porém o 
mecanismo pelo qual este efeito se dá permanece obscuro. 
Watson (1981) demonstrou que a gema de ovo pode 
conferir diversos graus de proteção aos espermatozóides de diferentes 
espécies animais, sendo que a explicação para esta observação seja 
devido, principalmente, à comprovação da existência de distintas 
composições lipídicas das MP entre as espécies animais. 
Devido às recentes necessidades de controle de doenças 
e ainda, para se evitar o uso de meios diluidores compostos por 
substância biológicas existe um crescente desejo dos pesquisadores em 
encontrar um substituto bioquimicamente estável para a gema de ovo, 
porém, até o presente, devido, principalmente, à falta de dados sobre o 
mecanismo exato de como a gema do ovo interfere na estabilização das 
membranas espermáticas, este substituto ainda não foi encontrado (Holt, 
2000). 
 
 
Introdução e Revisão Geral 
 
35
9 Leite 
O emprego do leite como meio diluente de sêmen foi 
primeiramente demonstrado por Donne em 1837. Segundo Hoffman 
(1905) o leite era um líquido orgânico com importante propriedade 
biológica para a conservação dos espermatozóides por possuir certa 
capacidadetampão, ação bactericida, viscosidade adequada para a 
manutenção dos espermatozóides no meio líquido com abundância de 
carboidratos que seriam utilizados pelos espermatozóides na produção de 
energia. 
Em 1950, Koelliker comprovou a eficácia do leite na 
criopreservação de sêmen e afirmou que duas substâncias eram 
responsáveis por esta característica: a lactose, que age como elemento 
energético, e proteínas que são substâncias capazes de potencializar a 
atividade cinética dos espermatozóides. 
Cunha (1997) e Johnston et al. (2001) verificaram a 
possibilidade da utilização de um diluidor a base de leite desnatado e 
glicose, rotineiramente utilizado na espécie eqüina, para a refrigeração e 
transporte do sêmen canino. 
 
9 Glicerol 
A adição de crioprotetores ao meio diluidor é essencial 
para a sobrevivência das células espermáticas após os processos de 
resfriamento, porém os crioprotetores podem acarretar danos às células 
(Parks e Graham, 1992). 
Muito são os compostos de ação crioprotetora que são 
tradicionalmente classificados como tendo ação intra ou extracelular. 
Dentro do grupo de ação intracelular, se incluem o glicerol, o 
Introdução e Revisão Geral 
 
36
dimetilsulfóxido (DMSO), etilenoglicol, propanodiol, butanodiol, metanol. A 
ação protetora destes crioprotetores é atribuída a suas propriedades 
coligativas e ligantes com água, diminuindo o ponto crioscópio 
intracelular, e, portanto, aumentando a quantidade de água que 
permanece no estado líquido sob baixas temperaturas, diminuindo a 
concentração intracelular de solutos e reduzindo os danos do efeito de 
solução (Peña, 1997; Holt, 2000). 
Desde que Polge et al. (1949) demonstraram a eficácia do 
glicerol, ele foi considerado o crioprotetor universal sendo a substância 
mais amplamente empregada na congelação de sêmen, incluindo a 
espécie canina (England, 1992). 
Durante o processamento do sêmen ocorrem bruscos 
movimentos de água e de crioprotetores em uma célula espermática, 
sendo possível que movimentos similares ocorram também em cada 
compartimento espermático. Este movimento de água através da 
membrana é influenciado, principalmente, pela existência de defeitos na 
membrana plasmática e pela composição e estrutura da bicamada lipídica 
(Hammersted e Graham, 1990; Peña, 1997). 
A primeira conseqüência da adição do glicerol em um 
meio isotônico é uma alteração de volume celular devido a uma rápida 
saída de água intracelular (enrugamento celular), seguido por um lento 
retorno ao volume original à medida que o crioprotetor penetra na célula 
(Hammersted e Graham, 1990; Peña, 1997). 
Hammersted e Graham, 1990, descobriram que a 
exposição de células a um meio diluidor com concentração de 0,5 M de 
glicerol pode criar uma concentração intramembrana de 1mM de glicerol, 
logo, por alterar a composição da membrana espermática, o glicerol pode 
ainda alterar as propriedades básicas da MP por induzir mudanças no 
Introdução e Revisão Geral 
 
37
acondicionamento de fosfolipídios e ainda alterar a estabilidade e a 
permeabilidade a água. 
A fusogenicidade da membrana e o padrão de respostas 
induzidas por sinais extracelulares podem ser alterados devido a estas 
mudanças causadas pela inclusão do glicerol à membrana espermática, 
podendo este fato contribuir para a diminuição da sobrevivência 
espermática posterior ao processo de congelação/descongelação e 
acelerar a capacitação espermática (Watson, 1995). 
Segundo England (1992) a concentração de glicerol 
utilizada para a congelação do sêmen de cão varia de 4 a 11%, sendo 
que, segundo Watson (1979), a concentração ótima de glicerol em um 
meio diluente representa um equilíbrio perfeito entre o efeito protetor e o 
efeito tóxico do glicerol. 
O grupo dos agentes extracelulares inclui as proteínas, 
açúcares de elevado peso molecular, polivinilpirrolidona, etc. Atuam 
através de mecanismo osmótico promovendo a desidratação celular 
durante a congelação e impedindo a formação de grandes cristais de gelo 
no interior da célula (Peña, 1997; Holt, 2000). 
 
9 Tampões 
O contínuo metabolismo espermático, produzindo como 
resultado grandes quantidades de catabólitos tóxicos, acarreta num 
aumento do ácido lático no meio extracelular. Este acúmulo pode causar a 
morte dos espermatozóides devido a drásticas alterações do pH no meio 
extracelular. Daí a necessidade de adição de tampões ao meio diluidor 
(Pérez e Pérez, 1994; Farstad, 1996; Holt, 2000). 
Introdução e Revisão Geral 
 
38
O fosfato foi primeiramente testado para este fim, porém o 
citrato de sódio, introduzido por Salisbury em 1940, adaptou-se melhor a 
esta finalidade. O citrato de sódio aumenta a capacidade de diluição da 
gema de ovo ao meio líquido, fenômeno que favorece sobremaneira a 
ação da gema sobre os espermatozóides. Este fenômeno é 
particularmente notável no que diz respeito ao choque frio e, com o 
emprego do citrato de sódio, se obtém um aumento no tempo de 
sobrevivência dos espermatozóides (Pérez e Pérez, 1994). 
Tampões devem ser utilizados para a manutenção do 
balanço iônico e do pH no diluidor (Johnston et al., 2001). Substâncias de 
poder tampão, incluindo citrato de sódio, TRIS 
(trishidroximetilaminometano) ou TES, têm sido utilizados com sucesso na 
preservação de gametas de canídeos (Farstad, 1996, Rota, 1998, Holt, 
2000; Peña, 2000; Johnston et al., 2001). 
 
9 Aditivos 
Espécies reativas de oxigênio (H2O2; O2-,-OH, ROOH,...) e 
os antioxidantes têm demonstrado um importante papel na fertilidade e na 
infertilidade. Algumas evidências diretas ou indiretas levam a crer que em 
vários momentos da criopreservação do sêmen estas espécies são 
formadas. O controle do nível das espécies reativas de oxigênio pela 
inclusão de antioxidantes ou pelo uso de condições que reduzam a 
oxidação durante a congelação tem sido descrito (Papa et al., 1993; 
Bilodeau et al., 2001). 
Vários aminoácidos, entre eles a glicina, têm sido 
incluídos na preservação do sêmen (Papa et al., 1993; Ball, et al., 2001; 
Bilodeau et al., 2001). De acordo com Papa et al. (1993) a ação da glicina 
ainda não está totalmente esclarecida, mas sabe-se, que esse 
Introdução e Revisão Geral 
 
39
aminoácido participa na síntese de enzimas antioxidantes (Gluthation 
Peroxidase), inibindo a formação de radicais livres e, conseqüentemente, 
protegendo a membrana celular da oxidação. 
Segundo Bicudo (1993), a adição de glicina e OEP ao 
meio citrato-gema melhorou o vigor espermático assim como aumentou a 
retenção de acrossomo após a congelação do sêmen bovino. 
A adição de diferentes compostos detergentes, como o 
Equex STM paste ou o Orvus ES paste ambos tendo como fração ativa o 
SDS (dodecil sulfato sódico) em diluentes de congelação parece ser 
benéfica para várias espécies, incluindo a espécie canina (Rota et al., 
1997; Holt, 2000; Peña, 2000). 
O SDS é um detergente aniônico do grupo alquil iônico, 
solúvel em água, que age desnaturando proteínas de membrana, e que, 
quando em altas concentrações, pode solubilizar completamente 
membranas biológicas. A natureza da proteção exercida pelo SDS não é 
completamente conhecida, sugere-se que o efeito do SDS possa ser 
exercido diretamente no meio extracelular, solubilizando as lipoproteínas 
da gema do ovo e aumentando, desta forma, seu potencial de proteção 
(Holt, 2000; Peña, 2000). 
Rota et al. (1997) incluíram o Equex STM paste ao seu 
diluidor para o sêmen de cão e constataram sua ação benéfica aos 
espermatozóides. Os mesmos autores, em acordo com o citado 
anteriormente, sugeriram que a fração ativa do Equex, o SDS, deve estar 
envolvida com asolubilização e a ativação de componentes da gema de 
ovo. 
Peña (2000) constatou que o Equex, quando utilizado em 
diluidores para o sêmen canino, exerceu um efeito protetor sobre as 
membranas espermáticas e sugeriu que o SDS possa ter reduzido a fase 
Introdução e Revisão Geral 
 
40
de transição lipídica e/ou protegido o funcionamento de bombas iônicas 
dos espermatozóides. 
Peña (2000) alertou para o fato de que a exposição 
prolongada dos espermatozóides ao SDS ou às lipoproteínas da gema de 
ovo tratadas pelo SDS, pode conferir um excesso de fluidez às 
membranas espermáticas indicando que seu efeito benéfico é 
dependente do tempo de exposição e da concentração deste no meio 
diluidor. 
 
 
 
 
 
 
Experimento I 
 
41
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. Experimento I 
 
Experimento I 
 
42
EFEITO DO PROCESSO DE CENTRIFUGAÇÃO SOBRE A 
QUALIDADE DO SÊMEN CANINO 
 
 
1. REVISÃO DE LITERATURA 
 
Os ejaculados caninos apresentam oscilações 
significativas de volume e concentração espermática devido, 
principalmente, a grandes variações de tamanho entre animais e entre as 
diferentes raças (Cunha, 1998). 
Para que se determine um protocolo de congelação na 
espécie canina, onde alguns fatores como: a concentração espermática 
por palhetas e a concentração de crioprotetor por célula espermática 
sejam constantes, faz-se necessário que esta variação de volume do 
ejaculado canino seja minimizada. 
A centrifugação é uma das formas propostas na literatura 
para se padronizarem essas variações e manter constantes o volume e a 
concentração espermática sem que se verifique influencia negativa sobre 
as células espermáticas (Papa, 1987; Lopes e Papa, 1998; Kirk, 2001). 
 
1.1. O ejaculado canino 
Segundo Heidrich (1977), foi Freiberg em 1935 o pioneiro 
a identificar o fracionamento no ejaculado do cão. Chamou a primeira 
fração de uretral ou pré-espermática, a segunda, de fração rica em 
espermatozóides, e a terceira, de fração prostática ou pós-espermática. 
A primeira fração ou pré-espermática apresenta um 
aspecto aquoso, cujo pH varia de 6,2 a 6,5 e um volume entre 2,4 ± 1,8ml 
Experimento I 
 
43
(Johnston, 1991; Silva et al., 1996, Peña, 1997). England e Allen (1992) 
sugeriram que as frações pré-espermática e pós-espermática são 
originadas na próstata. 
A segunda fração ou espermática apresenta um aspecto 
de cremoso a aquoso e sua coloração fisiológica varia de branco 
opalescente ao marfim, o pH situa-se entre 6,3 a 6,6 e o volume médio 
varia de 0,5 a 3,5 ml (Gunzel-Apel, 1994). 
A última fração do ejaculado é de origem prostática e 
apresenta um aspecto aquoso e seu pH oscila entre 6,5 e 7,0. O volume é 
diretamente proporcional à atividade secretória da glândula prostática e 
sua média é de 6,48 ± 4,32ml (Morton e Bruce, 1989; Aguiar et al., 1994). 
O fluido prostático é produzido continuamente nos machos 
caninos não castrados e reflui retrógradamente para a bexiga ou é 
eliminado pelo orifício externo da uretra em quantidades variando de 
pequenas gotas até muitos mililitros, dependendo do tamanho prostático 
(Johnston et al., 2000) 
A próstata é a única glândula acessória em cães, e seu 
tamanho e seu peso são dependentes da idade, raça e peso corpóreo (Di 
Santis et al., 2001). 
O volume de um ejaculado canino está diretamente ligado 
à quantidade de líquido prostático. A próstata canina, assim como a 
humana, tende a aumentar com o avanço da idade, como resultado de 
uma Hiperplasia Prostática Benigna. A maioria dos animais não castrados 
e com mais de cinco anos apresentam a próstata aumentada de volume e 
posicionada na região abdominal (Johnston, 2000; Di Santis, 2001). 
Rota et al. (1995) descreveram os efeitos prejudiciais do 
plasma seminal sobre a membrana plasmática dos espermatozóides 
bovinos e em seu estudo com sêmen canino, concluíram que a adição de 
Experimento I 
 
44
extensores aumentaria o número de células espermáticas com membrana 
plasmática íntegra. 
A freqüência de coletas apresentada por Feldman e 
Nelson (1996) é de uma coleta a cada 48 horas, ou de uma coleta ao dia 
durante 3 dias consecutivos e um repouso de 2 dias, ou, ainda, duas 
coletas ao dia e repouso de 2 dias, podendo ocorrer um aumento na 
concentração total de espermatozóides após alguns dias de repouso 
sexual. 
Alguns experimentos de congelação do sêmen canino, 
sem a eliminação da primeira e da terceira fração, têm sido propostos. 
Porém os dados obtidos até o presente sugerem que a utilização 
unicamente da fração espermática gera melhores resultados (Peña, 
1997). A utilização da centrifugação como forma de eliminar a primeira e a 
terceira fração tem sido realizada em alguns protocolos de preservação 
do sêmen canino (Lopes e Papa, 1998; Held, 1997). 
 
1.2. A centrifugação 
England e Allen (1992) citaram um efeito deletério da 
primeira e da terceira fração do ejaculado canino sobre as características 
espermáticas. Explicaram ainda que, na cobertura natural, o tempo de 
contato do espermatozóide com estas frações é reduzido, diminuindo este 
efeito. Os mesmos autores pesquisaram o efeito da incubação dos 
espermatozóides caninos diluídos na primeira e terceira frações do 
ejaculado e afirmaram existir um declínio no número de espermatozóides 
morfologicamente normais, decorrentes dos efeitos deletérios dessas 
frações. 
Papa et al. (1981) demonstraram que a centrifugação é 
um método adequado para o nivelamento da grande variação de 
Experimento I 
 
45
qualidade e quantidade de ejaculados eqüinos, e que diversas forças e 
tempos de centrifugação não apresentaram efeito negativo sobre a 
motilidade espermática, nem sobre a sobrevivência dos espermatozóides, 
avaliada por meio de coloração supra vital. Estes autores observaram 
efeito positivo da centrifugação sobre a motilidade espermática, além de 
que sua intensificação não depreciou a qualidade do sêmen “in vitro” 
durante o teste de termorresistência a 5ºC e a 37ºC. 
Vários autores têm sugerido com êxito a centrifugação de 
sêmen canino antes da criopreservação (Held, 1997; Rota, 1998; Strom 
Holst, 1999; Peña, 2000). Lopes e Papa (1998) verificaram uma melhora 
da qualidade espermática do sêmen de cão descongelado no grupo onde 
foi realizada a centrifugação prévia ao processo de congelação. 
Jasko (1994) sugere ainda que vários diluidores podem 
ser utilizados para pré-diluir o sêmen durante a centrifugação e que este 
passo garante uma boa proteção à célula espermática durante este 
processo. O mesmo autor sugere a utilização de um meio diluidor à base 
de leite desnatado para a realização de tal procedimento. 
O leite pasteurizado foi o primeiro diluidor descrito para a 
refrigeração do sêmen em cães (Harrop, 1954). Devido a sua composição 
e capacidade tampão, diluidores à base de leite, assim como aqueles à 
base de gema de ovo têm sido amplamente difundidos para conservação 
do sêmen em todas as espécies animais (Cunha, 1997). 
A lavagem dos espermatozóides remove fatores inibidores 
da capacitação e prostaglandinas, sendo a técnica mais comumente 
utilizada no preparo dos espermatozóides humanos para inseminação 
artificial. Técnicas avançadas de preparo dos espermatozóides, incluindo 
o swin-up, swin-down, diferentes gradientes de centrifugação com Percoll, 
colunas de Sephadex e de Ficoll têm sido utilizados para eliminar 
espermatozóides imóveis, células brancas ou debrís dos ejaculados 
Experimento I 
 
46
humanos, e têm sido relacionadasao aumento da porcentagem de 
espermatozóides móveis no sêmen (Carrell, 1998). 
Lopes e Papa (1998) afirmaram que a centrifugação do 
sêmen canino em Ficoll-Paque melhora significativamente os resultados 
de congelação e de descongelação em meio à base de glicina-gema para 
a espécie. 
O Percoll é uma suspensão coloidal de polivinilpirrolidina 
(PVP) ligada a sílica e esta coligação alivia as propriedades tóxicas do gel 
de sílica. A maior vantagem do Percoll é não penetrar em membranas 
biológicas, além disso, suas soluções possuem baixas viscosidade e 
osmolaridade. Devido ao grande tamanho de suas partículas, a 
centrifugação em velocidades moderadas pode gerar um gradiente de 
densidade próprio, sendo desta forma a separação desejada realizada 
rapidamente (Gennis, 1989). 
Amann e Graham (1993) citaram que o processo de 
centrifugação do sêmen pode aumentar a peroxidação lipídica das 
membranas espermáticas, porém, segundo Prakash (1998), a exposição 
ao Percoll protege os espermatozóides da produção excessiva de radicais 
livres, que podem causar alterações nas funções da membrana induzindo 
a peroxidação lipídica. 
Tendo-se em vista o exposto, o objetivo do presente 
trabalho foi testar os efeitos do processo de centrifugação no sêmen 
canino e comparar a pré-diluição do sêmen em meio à base de leite 
desnatado e glicose, Percoll ou plasma seminal autólogo na realização 
deste procedimento. 
Experimento I 
 
47
2. MATERIAL E MÉTODO 
 
2.1. Animais 
Após realização de exame clínico detalhado, coleta de 
sangue para hemograma, pesquisa de Brucelose e Leptospirose, e de 
sêmen para o exame andrológico foram selecionados cinco (5) cães 
adultos, SRD, pesando entre 10 e 20 kg, provenientes do Biotério Central 
da Unesp de Botucatu, e cinco (5) cães adultos, da raça Cocker Spaniel, 
pesando entre 15 e 20 kg, provenientes de criatórios particulares da 
cidade de Botucatu-SP. 
Os animais provenientes do Biotério foram mantidos em 
canis com solário durante a fase de coleta do sêmen, os cães de 
criatórios particulares permaneceram em seus respectivos canis, com 
boas condições de higiene e alimentação durante a fase experimental. 
O sêmen foi coletado no próprio criatório ou no canil da 
Pós Graduação e transportado imediatamente até o laboratório da Área 
de Reprodução Animal da FMVZ-UNESP- Botucatu, para análise e 
manipulação. 
 
2.2. Coleta do Sêmen 
O ejaculado completo foi coletado por meio de massagem 
peniana e recolhido em um funil plástico acoplado a um tubo de coleta 
graduado. Este conjunto era mantido a 37ºC acoplado a uma mamadeira 
dentro de uma garrafa de isopor. 
 
Experimento I 
 
48
2.3. Exame do Sêmen 
 
9 ANÁLISE MACROSCÓPICA DO SÊMEN 
 
Volume: Através de tubo coletor graduado. 
 
Odor, cor e aspecto: Através de análise subjetiva. 
 
 
9 ANÁLISE MICROSCÓPICA DO SÊMEN 
Motilidade e vigor espermático: As avaliações foram 
realizadas segundo método descrito por Krause (1966), onde uma gota de 
sêmen é colocada sobre lâmina aquecida (38-40ºC) e recoberta por 
lamínula. O exame foi realizado através de microscopia de contraste de 
fase e o resultado obtido expresso em porcentagem (0-100) para a 
motilidade e através de um escore variando de zero a cinco (0-5) (Colégio 
Brasileiro de Reprodução Animal -CBRA, 1996) para o vigor. 
Aglutinação espermática: Foi descrita como aglutinação a 
observação visual e subjetiva, sob microscopia de contraste de fase, de 
grupos de células espermáticas aderidas cabeça-cabeça. O resultado foi 
descrito através de um escore variando de zero a três, onde: 
0- não se observa aglutinação. 
1- aglutinações esparsas, visualizadas em campos 
isolados. 
2- aglutinações esparsas, observadas em todos os 
campos. 
3- aglutinações muito freqüentes, em todos os campos. 
 
Experimento I 
 
49
Concentração espermática: Foi determinada através de 
contagem das células em Câmara de Neubauer, após diluição de 1:20 em 
água e o número de espermatozóides expresso por ml.. 
Espermiograma: Foi realizado na fase de seleção de 
animais a partir de esfregaços fixados em formol salino aquecido por 10 
minutos (Cunha, 1997) e corados pelo método Karras modificado (Papa et 
al, 1986) foram avaliadas 200 células espermáticas de cada esfregaço e 
os resultados expressos em porcentagem, registrados individualmente. A 
classificação da patologia espermática foi feita segundo Oetllé (1988). 
Integridade de Membrana: Para avaliação da integridade 
das membranas, recorreu-se à coloração fluorescente utilizando-se iodeto 
de propídio e carboxifluoresceina, de acordo com a técnica descrita por 
Harrison e Vickers (1990), e modificada por Cunha et al. (1996) (ANEXO 
I). A avaliação foi realizada entre lâmina e lamínula em microscópio de 
epifluorescência com objetiva de 40x (Nikon- Episcopic Fluorescence 
Attchment “EFA” HalogenLamp Set) e contadas 200 células classificadas 
como: células íntegras - células emitindo fluorescência verde, células 
lesadas - possuem o núcleo emitindo fluorescência vermelha. 
 
2.4. Procedimentos experimentais 
Foram utilizados dez (10) ejaculados completos de dez 
(10) cães diferentes (n=10). Após a avaliação inicial dos parâmetros 
espermáticos, o ejaculado foi dividido em três partes iguais e transferido 
para tubos plásticos de centrífuga graduados e centrifugados a 800g por 
15 minutos, formando os seguintes grupos (figura 1): G1 (n=10): 1\3 do 
sêmen não foi centrifugado. O sêmen foi mantido em banho Maria a 37ºC, 
durante a centrifugação dos outros grupos; G2 (n=10): 1\3 do sêmen foi 
centrifugado em plasma seminal autólogo (PSA); G3 (n=10): 1\6 do 
Experimento I 
 
50
sêmen foi diluido 1:1 em meio à base de leite desnatado e glicose (LG) 
(Kenney et al., 1975) (ANEXO II); G4 (n=10): 1\6 do sêmen foi 
centrifugado sobre diferentes gradientes de Percoll® (Sigma) (ANEXO III) 
(figura 1). 
 
Diluidor 
 
 
Protocolo 
Plasma seminal 
autólogo (PSA) 
Leite desnatado e 
glicose (LG) Percoll 
Não 
centrifugado 
G1 
(1/3 do sêmen) 
Centrifugado G2 (1/3 do sêmen) 
G3 
(1/6 do sêmen) 
G4 
(1/6 do sêmen) 
 
FIGURA 1 – Esquema de formação dos grupos experimentais. 
 
Após a centrifugação, foi descartado o sobrenadante de 
todos os grupos centrifugados. Foram retirados 10µl do “pellet” para 
avaliação da integridade das membranas espermáticas, através do teste 
fluorescente, descrito por Cunha et al. (1996) onde os espermatozóides 
foram incubados junto aos corantes fluorescentes e avaliados sob 
iluminação epifluorescente (400x). 
Os “pellets” foram então ressuspendidos em 2ml de LG. A 
mesma quantidade do mesmo diluidor foi acrescida ao G1. Todos os 
grupos foram avaliados quanto a motilidade e vigor espermático (M1). 
As amostras foram mantidas em banho Maria a 37ºC. 
Decorridos 30 minutos de incubação (M2), as amostras foram novamente 
avaliadas quanto à motilidade e o vigor espermático. 
Experimento I 
 
51
2.5. Métodos Estatísticos Utilizados 
Para as variáveis motilidade e vigor, foi utilizada a análise 
de perfil, visando comparar os 4 grupos caracterizados por: G1- grupo 
controle da centrifugação, G2- grupo controle dos diluidores, G3- grupo 
Kenney, G4 - grupo Percoll, em cada um dos dois momentos: M1- logo 
após a centrifugação, M2- após imersão das amostras centrifugadas em 
banho Maria a 37ºC por 30 minutos. Também pela análise de perfil pôde-
se comparar cada grupo, os momentos através dos valores médios 
observados nas amostras. 
Para a variável aglutinação a comparação entre os grupos 
foi feita pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, em cada momento, 
e peloteste de Friedman, utilizando os valores medianos amostrais, 
compararam-se para cada grupo os momentos. 
Para a variável porcentagem de células íntegras, foi 
utilizada a análise de variância de um delineamento inteiramente 
casualizado com 4 tratamentos (grupos) e 10 repetições. Nesta análise, 
utilizou-se a transformação arc sen√% visando a normalização da 
distribuição dos dados amostrais. 
 
 
 
 
 
 
 
Experimento I 
 
52
3. RESULTADOS 
 
 
Imediatamente após a centrifugação não houve diferença 
estatística significativa quanto à motilidade espermática entre os grupos. 
Porém, após 30 minutos de incubação em banho Maria a 37ºC os grupos 
centrifugados apresentaram-se significativamente superiores ao grupo 
onde não houve centrifugação (G2=G3=G4>G1) quanto à motilidade 
espermática (tabela 1). 
 
TABELA 1- Valores médios de motilidade espermática (%) do sêmen de 
cães, nos os 4 grupos estudados, após o processo de 
centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002. 
 
 
 M1 M2 
G1 71aA 47aB 
G2 79aA 61bB 
G3 79aA 67bB 
G4 74aA 63bB 
 
ƒ para cada grupo, medias de momentos seguidas de letras maiúsculas iguais não diferem 
estatisticamente (p>0,05) 
ƒ para cada momento, medias de grupos seguidas de letras minúsculas iguais não diferem 
estatisticamente (p>0,05) 
 
Em todos os grupos estudados, verificou-se diminuição 
significativa da motilidade espermática após a incubação (M2< M1) 
(tabela 1). 
 
 
Experimento I 
 
53
TABELA 2- Valores médios de vigor espermático (escore de 0-5) do 
sêmen de cães, nos 4 grupos estudados, após o processo 
de centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002. 
 
 
 M1 M2 
G1 3,2aA 2,aB 
G2 3,7aA 2,7abB 
G3 3,8aA 3,1bB 
G4 3,5aA 3bA 
 
ƒ para cada grupo, medias de momentos seguidas de letras maiúsculas iguais não diferem 
estatisticamente (p>0,05) 
ƒ para cada momento, medias de grupos seguidas de letras minúsculas iguais não diferem 
estatisticamente (p>0,05) 
 
O vigor espermático imediatamente após a centrifugação 
(M1) não diferiu significativamente entre os grupos (G1=G2=G3=G4). 
Porém, quando se comparou o vigor espermático dos grupos decorridos 
30 minutos de incubação, verificou-se superioridade dos grupos 
centrifugados em diluidor LG (G3) e em diferentes gradientes de Percoll 
(G4) (tabela 2). 
Decorridos os 30 minutos de incubação não foi observada 
diminuição significativa do vigor espermático no grupo centrifugado em 
diferentes gradientes de Percoll (M1=M2) (tabela 2). 
 
TABELA 3- Valores medianos da aglutinação espermática do sêmen de 
cães, nos 4 grupos estudados, após o processo de 
centrifugação (M1) e (M2). Botucatu, 2002. 
 
 
 M1 M2 
G1 0A 0A 
G2 0A 1,5B 
G3 0A 0A 
G4 0A 1,5B 
 
 
 
 
 
 
ƒ em cada grupo, mediana de momentos seguidas de letras maiúsculas iguais não diferem 
estatisticamente (p>0,05) 
Experimento I 
 
54
Verificou-se aumento significativo de aglutinação 
espermática após a incubação em banho Maria a 37ºC nos grupos 
centrifugados em PSA (G2) e naqueles centrifugados em diferentes 
gradientes de Percoll (G4). Não houve diferença estatística significativa 
entre os grupos em nenhum dos momentos (tabela 3) 
 
TABELA 4- Porcentagem média de células espermáticas íntegras 
transformadas em arc sen √x (em rad) do sêmen de cães, 
nos 4 grupos estudados, após as centrifugações (M1). 
Botucatu, 2002. 
 
 média desvio padrão 
médias 
originais 
G1 1,38a 0,155 98,2 
G2 1,43a 0,141 99,0 
G3 1,41a 0,190 98,7 
G4 1,38a 0,151 98,2 
 
ƒ médias de grupos seguidos de letras iguais, não diferem estatisticamente (p>0,05). 
 
Não se verificou diferença estatística significativa quanto à 
integridade das membranas espermáticas entre os grupos estudados 
imediatamente após as centrifugações (tabela 4). 
Experimento I 
 
55
4. DISCUSSÃO 
 
Os ejaculados caninos apresentam grande variação em 
seu volume devido, principalmente, à diferenças individuais. Entre 
animais, esta variação deve-se à diferença de tamanho entre raças ou 
mesmo devido a características individuais, como a idade ou tamanho da 
próstata. Individualmente pode-se verificar diferenças de volume entre 
dois ejaculados devido à atividade sexual no período da coleta ou mesmo 
em conseqüência do envelhecimento deste animal. Todas as diferenças 
de volume acima descritas devem-se, exclusivamente, a alterações 
fisiológicas comuns e inerentes à espécie canina (Cunha, 1998). 
Para que um protocolo de congelamento de sêmen seja 
estabelecido, estas diferenças de volume que, conseqüentemente, 
levarão a uma diferença de concentração espermática por mililitro de 
ejaculado, devem ser eliminadas, possibilitando desta forma um 
tratamento semelhante a cada célula espermática, no que diz respeito à 
diluição, à concentração de crioprotetor no meio que a circunda, ao 
envase e ao volume da dose inseminante (Papa, 1987; Lopes e Papa, 
1998; Dell’aqua Junior, 2000). 
Vários autores (Held, 1997; Lopes e Papa, 1998; Rota, 
1998; Strom Holst, 1999; Peña, 2000) têm descrito metodologias de 
criopreservação do sêmen canino utilizando a centrifugação como forma 
de eliminar plasma seminal e padronizar o volume do ejaculado. Os dados 
encontrados neste experimento concordam com estes autores, já que 
verificamos que a centrifugação não alterou a qualidade espermática no 
que diz respeito à motilidade e vigor espermático e à integridade das 
membranas espermáticas. 
Experimento I 
 
56
A associação da retirada do plasma seminal através da 
centrifugação com a adição de uma solução de centrifugação, com 
propriedades protetoras e ação de tampão, pode ser uma alternativa 
viável para a eliminação do plasma seminal, sabidamente deletério ao 
espermatozóide canino, prolongando a sobrevida dos espermatozóides. 
Após a cobertura natural o metabolismo espermático no trato genital 
feminino é intenso, este acontecimento fisiológico pode ser mimetizado 
em condições laboratoriais incubando-se o sêmen a uma temperatura de 
37ºC por um determinado período, este aumento de metabolismo é 
responsável pelo aumento da produção de catabólitos tóxicos que, em 
contato com a célula espermática, induzirem danos à integridade 
funcional e morfológica da célula espermática (Amann e Graham, 1993). 
Verificamos que o sêmen centrifugado em Percoll ou em 
LG, após incubado em LG por 30 minutos, apresentou melhor vigor 
espermático que o sêmen incubado em mesmas condições e previamente 
centrifugado sem solução de centrifugação ou não centrifugado. 
Provavelmente, substâncias presentes nos diluidores de centrifugação 
proporcionaram maior atividade tampão, antioxidante e substrato para 
metabolismo (G3) ou uma melhor “lavagem” das substâncias nocivas 
presentes no plasma seminal (G4) fazendo que o vigor fosse mantido por 
um período mais longo. 
Verificamos, porém, que, após a centrifugação em 
diferentes gradientes de Percoll e a completa eliminação do plasma 
seminal houve também um aumento a aglutinação cabeça-cabeça das 
células espermáticas, mesmo tendo sido estes espermatozóides 
acrescidos de um diluidor durante a incubação a 37ºC. 
Sabendo-se que o potencial de membrana, que se reflete 
como uma característica de carga elétrica positiva ou negativa à 
membrana externa do espermatozóide, pode ser alterado pelos radicais 
Experimento I 
 
57
de hidrato de carbono ligados a lipídios e proteínas constituintes da 
membrana (Amann e Graham, 1993) e, lembrando-se ainda, que estas 
ligações podem se desfazer com certa facilidade (Gennis, 1989), 
sugerimos que o Percoll possa ter realizado uma lavagem de radicais 
glicosilados ligados