AULA 9 TRANSCRIÇÃO, PROCESSAMENTO E SPLICING

Prévia do material em texto

13/08/2017 
1 
Fluxo da Informação Genética (parte I) 
Transcrição, Processamento e Splicing 
Profa. Dra. Jacqueline Braga 
Replicação 
Transcrição 
Tradução 
Proteína 
- Processo para 
síntese de todos 
os RNAs da célula 
- Reflete o estado 
fisiológico da 
célula 
- O conjunto de 
genes expressos 
em uma dada 
situação é variável 
- Processo 
catalisado pelas 
RNAs polimerases 
Transcrição Reversa 
Replicação de RNA 
Principais etapas envolvidas na expressão de um gene 
Adaptado de Alberts et al. (2002) Molecular Biology of THE CELL, 4nd edition, GS Garland Science Taylor & Francis Group. 
13/08/2017 
2 
Aspectos Comuns: 
 Polaridade 5’  3’; 
 Necessidade de um molde; 
 Inicia a partir de uma sequência específica – sequência de 
iniciação 
 3 fases: Iniciação (reconhecimento do promotor), elongação 
e terminação (acoplada ao processamento) 
 
Aspectos Diferenciais: 
 Não requer “primer” (iniciador); 
 Apenas um segmento de DNA é Transcrito; 
 Uma das fitas de DNA serve como molde; 
Transcrição X Replicação 
Síntese de RNA: formação 
da ligação fosfodiester 
A RNA polimerase não 
requer um iniciador 
(primer) para iniciar a 
síntese do RNA 
A RNA polimerase copia uma das fitas do DNA em 
RNA 
Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henriue Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001. 
13/08/2017 
3 
 5’-AUG AAG UUC UCC ACC UUU UUG GCA GUA GGG GCU GCC CUU GAA UAA-3’ 
5’-ATG AAG TTC TCC ACC TTT TTG GCA GTA GGG GCT GCC CTT GAA TAA-3’ 
 
3’-TAC TTC AAG AGG TGG AAA AAC CGT CAT CCC CGA CGG GAA CTT ATT-5’ 
DNA 
M K F S T F L A V G A A L E stop 
N-terminal C-terminal Proteína 
Síntese Protéica (Tradução) 
Transcrição 
mRNA 
A RNA polimerase e a direção 5’- 3’ da transcrição 
As RNA polimerases não 
tem mecanismo de 
correção de erro 
Direção da transcrição 
A “bolha” ou “forquilha” de transcrição 
13/08/2017 
4 
RNA polimerase de E.coli 
Início da Transcrição 
Reconhecimento e 
Ligação ao promotor 
Deslocamento do Fator 
sigma 
Terminação da transcrição 
através da formação do 
grampo de terminação 
13/08/2017 
5 
Terminação da transcrição 
dependente da proteína Rho 
(Procarioto) 
Rho (46kDa, ativa como hexâmero) 
move-se ao longo do RNA 
acompanhando a RNA polimerase 
Com a pausa da RNA polimerase na 
sequência de terminação, Rho alcança a 
enzima 
Rho desenrola o híbrido RNA-DNA 
Sequência de Terminação 
dependente de Rho 
A RNA Polimerase eucariótica:mais de 10 subunidades 
Adaptado de Lewin, B. (2000) Genes VII/Benjamin Lewin; trad. Henrique Ferreira ... [et al.]. - Porto Alegre: Artmed Editora, 2001. 
RNAs polimerases Eucarióticas 
RNA pol I Nucleólo rRNA Várias subunidades 
RNA pol II Nucleoplasma hnRNA 
(transcrito 
primário) 
snRNA 
Várias subunidades 
RNA pol III 
 
Nucleoplasma rRNA 5S 
tRNAs 
Várias subunidades 
RNA pol 
Mitocondrial 
Mitocondria 01 subunidade 
RNA pol de 
Cloroplastos 
Cloroplasto Similar às 
bacterianas 
Requerem proteínas auxiliares: fatores de transcrição 
13/08/2017 
6 
Estrutura típica de um gene transcrito pela RNApol II 
Promotor Enhancer Gene 
Visão geral do promotor de um gene eucariótico 
A maioria dos promotores possui a sequência TATA box a cerca de 25 
pb antes do sítio de início da transcrição 
 sequência curta e bem definida antes do sítio de início da 
transcrição, que é necessária para a síntese do mRNA; 
 sequência com localização relativamente fixa com respeito ao 
sítio de início da transcrição; 
 encontrada na grande maioria dos promotores eucarióticos 
Py2CAPy5 
Adaptado de Nelson, D. and Cox, M., M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry, 3nd edition, Worth Publishers. 
O “TATA box” 
13/08/2017 
7 
O complexo 
de 
Transcrição 
é montado 
pela adição 
seqüencial 
de fatores 
gerais de 
transcrição. 
Transcrição em Eucariotos 
A TBP (proteína ligante ao TATA) 
se liga ao TATA box, 
recrutando o 1º fator de 
transcrição (TFIID) 
Ocorre a atração de outros fatores 
Gerais de transcrição para o TATA 
box (TFIIA, TFIIB) 
 
A TFIIF, ligada à RNA pol II, 
é recrutada para o promotor 
 
Os últimos fatores de 
transcrição 
(TFIIE e TFIIH) se ligam à RNA 
pol II 
O último fator de transcrição 
(TFIIH) tem uma subunidade, 
com função enzimática (kinase) 
que fosforila a “cauda” da RNA 
pol II ativação 
Transcrição em Eucariotos 
13/08/2017 
8 
Enhancer: sequência regulatória da transcrição 
Montagem de Proteínas 
Regulatórias Silenciadoras 
Montagem de Proteínas 
Fortemente Ativadoras 
Proteínas 
Fortemente 
Inibitórias 
Montagem 
de 
Proteínas 
Fracamente 
Ativadoras 
RNA Pol II e os fatores gerais 
de transcrição 
A fosforilação é acoplada à ação do 
Enhancer (complexo mediador/ativador) 
 
Após a ação do 
Enhancer, o 
complexo 
desacopla-se 
e a RNA pol II, se 
desloca do promotor 
iniciando a 
transcrição. 
Elongação pela RNA 
Pol II 
Início da Transcrição em Eucariotos 
P
ro
c
a
ri
o
to
s 
E
u
c
a
ri
o
to
s 
Splicing 
13/08/2017 
9 
Alterações Pós-Transcricionais 
 e Splicing 
Adaptado de Alberts et al. (2002) Molecular Biology of THE CELL, 4nd edition, GS Garland Science Taylor & Francis Group. 
mRNA maduro Pré-mRNA 
Processamento/ splicing 
Modificações pós-transcricionais no pré-RNAm 
13/08/2017 
10 
• Adição da estrutura CAP na extremidade 5’ 
 
• Adição da cauda poli(A) na extremidade 3’ 
 
• Splicing nuclear do pré-mRNA : retirada dos ÍNTRONS 
(não codificantes) e união dos ÉXONS (codificantes) 
 - cis-splicing (na mesma molécula) 
 - trans-splicing (partes de moléculas diferentes) 
Modificações pós-transcricionais no pré-RNAm 
Adição da estrutura 5’ Cap dos mRNAs: 
Guanina metilada 
“Capeamento” do mRNA 
Estabilidade ao RNAm 
Iniciação da tradução 
5´ 5´!!! 
13/08/2017 
11 
Poliadenilação: adição de cauda poli-A 
Visão geral do processamento de um 
pre-mRNA eucariótico 
Requerimentos para o splicing nuclear do pré-mRNA 
Sequência conservada nas junções exon-intron (regra GU-AG) 
 
Fatores protéicos e ribonucleoprotéicos (snRNPs) 
 
Spliceosoma 
Sequências conservadas nas junções exon-intron 
(regra GU-AG) e no sítio de ramificação 
13/08/2017 
12 
O splicing ocorre em dois estágios, nos quais o Exon 5’ é separado 
e então unido ao Exon 3’ 
Cis- Splicing 
2 reações de 
transesterificação 
1) Um grupo OH livre 
ataca a junção exon-
intron1 
 
2) O OH criado na 
extremidade do exon1 
ataca a junção intron-
exon2 
Splicing de íntrons do Grupo 1 
ÍNTRONS DO GRUPO 1: 
Genomas de organelas 
(mitocôndria) e alguns 
 genes do núcleo 
• Realizam sua própria 
Remoção (Self Splicing) 
13/08/2017 
13 
SPLICEOSSOMO: 
Pequenos RNAs nucleares 
(snRNAs) complexados 
com proteínas 
específicas: snRNPs 
(lê-se snurps) + 
diversos fatores 
protéicos 
Spliceossomo 
ÍNTRONS DO GRUPO 2: 
Todos os outros RNAm 
nucleares utilizam 
spliceossomo 
Complexos catalíticos 
RNA-proteínas (ATPases) 
Splicing de íntrons do Grupo 2 
Splicing Alternativo 
• Mais de 55% dos genes humanos sofrem splicing alternativo, o que resulta 
 na regulação da expressão gênica e aumento da diversidade de proteínas 
13/08/2017 
14 
Splicing AlternativoSplicing Alternativo: gene da α-Tropomiosina 
AAAAAAA 
Representação esquemática da 
estrutura geral de um mRNA 
eucariótico maduro 
5´ UTR 3´ UTR CAP 
5´ 3´ 
ORF 
Região Codificadora 
UTR: do inglês Untranslated Region (Região não traduzida) 
ORF: do ingês Open Reading Frame (fase aberta de leitura) 
13/08/2017 
15 
Obrigada!