DNA, proteínas e fenótipos

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Escola de Saúde e Medicina
Disciplina de Genética e Biotecnologia
Universidade Católica de Brasília 2/2017
Professores Fabrício Costa, Rinaldo Pereira, Robert Pogue e Sérgio Alencar
Tema 2 – Um genoma, muitas possibilidades
Aula 3 – DNA, proteínas e fenótipos
Problema central:
Em nossas aulas anteriores discutimos que o nosso genoma vem dos nossos pais por meio da segregação de cromossomos durante meiose, e essa é a base da produção das nossas características herdáveis. Nesta aula exploraremos como o genoma gera as manifestações (fenótipos) para características mendelianas. Ou seja, iremos estudar o funcionamento dos genes, aqui definidos como sequências de DNA localizadas nos cromossomos e que transcrevem para RNA mensageiro e este é traduzido em uma sequência de aminoácidos (peptídeos e proteínas). 
Como ferramenta de estudo e aprendizagem vamos utilizar a altura em seres humanos. Outros exemplos serão utilizados ao longo do texto. O crescimento de seres humanos é uma característica importante, e muito variável, - sendo que existe em qualquer população uma grande variabilidade na altura. A variabilidade que encontramos em termos populacionais e o grande número de genes envolvidos e que se somam a fatores ambientais, faz da altura uma característica que chamamos de complexa. No entanto, existem situações raras onde um único gene pode ter um papel determinante na característica altura. Nestas situações estamos diante da altura como uma característica mendeliana. Entre os genes que se apresentam para a determinação da altura em um contexto mendeliano podemos citar o gene do receptor do hormônio de crescimento (símbolo: GHR), o qual codifica uma proteína que, quando ativada pelo hormônio de crescimento (GH), induz o crescimento e divisão de células, e assim crescimento de tecidos.
Agora iremos estudar como as informações no DNA produzem um fenótipo no organismo, pelo intermediário de transcrição, tradução e funcionamento normal de proteínas. 
O gene
Vamos rever a estrutura básica do gene, lembrando que o gene é uma sequência de DNA (parte da dupla hélice, parte do cromossomo):
Esta figura esquematiza a localização do gene dentro do cromossomo. Em humanos os genes que codificam proteínas representam em torno de 2,5% do genoma. O genoma humano, definido como o componente haploide de 23 cromossomos tem aproximadamente 3,3 bilhões de pares de base (3,2 mega base). O tamanho dos cromossomos humanos e a densidade de genes é variável. O cromossomo 1 humano tem aproximadamente 250 milhões de pares de base e na última versão publicada estão anotados neste cromossomo 5078 genes.
	Você pode ir à página da figura acima e verificar os dados para cada cromossomo humano. Basta seguir este endereço https://goo.gl/Szv5vt. 
Lembre-se que tendo 2 cópias de cada cromossomo, temos 2 cópias de cada gene (com exceção dos cromossomos sexuais no homem). 
	
Nas figuras acima temos um esquema generalizado do gene, o qual está localizado no cromossomo. Neste caso, um exemplo genérico de um gene com 3 exons (2 introns). 
Cada região que é transcrita em mRNA em nosso genoma tem um conjunto de sequências em sua porção 5’ as quais denominamos aqui de maneira geral como região regulatória. Como a própria denominação aponta, estas regiões tem a função de regular onde, quando e sob quais estímulos um gene deve ser transcrito pela RNA polimerase. 
	As sequências de DNA do gene podem ser categorizadas em dois tipos: DNA codificante e DNA não-codificante. O DNA codificante é a parte que contém as instruções para a síntese de proteína, ou seja, para gerar as cadeias de aminoácidos. Apenas o exons contém DNA codante. *Porém, é importante saber que nem 100% da sequência de exons é codante, como nós vamos descobrir*. Os introns sempre são não-codificantes, e também o DNA entre os genes é não-codificante. Na maioria dos casos, a sequência codificante do gene começa no primeiro exon, e termina no último exon. Em termos da sequência da fita codificante, os primeiros 3 nucleotídeos sempre são 5´-ATG-3´. [Observe que na fita complementar teremos 5´-CAT-3´ nesta posição]. 
A primeira etapa na expressão de qualquer gene é transcrição, definido como a síntese de uma molécula de RNA a partir de um molde de DNA. O processo de transcrição inicia quando um grupo de proteínas (fatores de transcrição) reconhece e liga nas regiões regulatórias e posicionam a RNA polimerase II na região promotora. 
Fatores de transcrição ligados nas sequências regulatórias e posicionando a RNA polimerase no promotor
-Nesta figura observamos um esquema básica do processo de transcrição. Na Iniciação (Initiation), um complexo de fatores de transcrição reconhece e se liga ao promotor, posteriormente atraindo o RNA polimerase II (RNAP). A dupla fita abre e o RNAP sintetiza o pré-mRNA usando a fita complementar como molde (Elongation). Na terminação (termination), o RNAP chega no final do gene, os complexos desassociam, RNAP saia, e o mRNA está liberado para as próximas etapas. 
Transcrição:
Após ligação dos fatores de transcrição no promotor, o RNA polimerase II cria uma cópia do gene (todos os exons e todos os introns). Essa cópia consiste em uma fita simples de RNA (com orientação 5´-3´) com a mesma sequência que a fita codificante do gene, só que tem o nucleotídeo U (uracila) em vez de T (timina). Esse processo de transcrição ocorre no núcleo da célula. Agora temos uma cópia do gene feito de RNA. Essa molécula é conhecida como pre-mRNA [mRNA = RNA mensageiro]. Só que esse ainda contém os introns, os quais são não-codificante. Esses têm de ser removidos.
-Nesta figura observamos uma região do cromossomo onde se encontra um gene. Para transcrição, as duas fitas da dupla hélice têm de separar-se para que o RNA polimerase consegue sintetizar RNA usando a sequência complementar do gene como molde. Desta maneira, a sequência do mRNA é idêntica à sequência da fita codificante do gene (a fita em cima neste desenho). *Observa as anotações de 5´ e 3´ no gene e no mRNA. Sempre importante!
Splicing:
Os introns são retirados da molécula de RNA por um processo chamado de splicing. Neste processo, um complexo chamado de ´spliceossomo´ liga no pré-mRNA e corta em todas as junções de exon-intron. Os introns são eliminados e os exons reunidos para formar a molécula de mRNA maduro consistindo apenas dos exons. Essa molécula também tem uma orientação 5´-3´. O processo de splicing depende das sequências curtas de nucleotídeos no início e no final de cada intron. As regiões de borda entre exons e introns são denominadas de sítios aceptores e doadores de splicing. Estas sequências (12-15 pb) são chamadas de sequências consensus de splicing, e variam pouco entre diferentes genes. O spliceossomo reconhece as sequências consensus para saber onde cortar o mRNA. Este ponto vai ser importante na próxima aula quando chegamos a discutir mutações.
-Nesta figura, temos um segmento do pré-mRNA, (inclusive o 5´-cap), mostrando exons 1 e 2, com o intron 1 entre os dois. Esse intron tem de ser eliminado. Um complexo que consiste de RNA + proteínas converge no intron por reconhecimento de sequências específicas. Esse complexo é o spliceossomo. Uma vez localizado no intron, o spliceossomo busca as sequências consensus de splicing, localizadas no início e no final do intron, e corta o mRNA nestas posições. O intron está eliminado, e o spliceossomo junta as sequências exônicas, antes de desassociar, liberando o mRNA maduro para sair do núcleo em preparação para tradução.
Vamos olhar o mRNA maduro em um pouco mais de detalha. O mRNA tem 3 elementos (figura em baixo). Como dito anteriormente, os exons não são 100% codificantes. A primeira parte da molécula de RNA (amarela na figura em baixo) não é codificante, e é conhecido como UTR-5´ (UTR = região não traduzida). Similarmente, a parte final da molécula (rosa) é conhecido como UTR-3´. Entre os dois UTRs temos a sequência codificante (verde; sempre uma múltipla de 3 nucleotídeos). As funções dos UTRsincluem estabilizar a molécula de RNA, auxiliar no transporte dessa molécula para fora do núcleo, e ajudar no reconhecimento do mRNA pelo ribossomo, onde ocorrerá o processo de tradução. 
O Cap 5´ (vermelho) e o rabo Poly-A (preto) são adicionados após a transcrição e também auxiliam na estabilidade do transcrito. 
Poderemos dizer então que o Cap, os UTRs e o rabo Poly-A são elementos de apoio. A sequência codificante (em verde na figura em cima) é a parte que irá especificar a sequência da proteína. Essa parte (ainda sendo uma sequência de A, C, G e U) está organizada em trios de nucleotídeos chamados de códons. O primeiro códon sempre é 5´-AUG-3´ (ou que reflete o ATG do gene). 
Tradução:
E como está codificada a sequência de proteína?
Após sair do núcleo, o transcrito (mRNA) entra em uma molécula chamada de ribossomo (feito de outro tipo de RNA chamada de rRNA –RNA ribossomal). Esse ribossomo vai se ligar na parte codificante do mRNA, examinando códon por códon. O primeiro códon, tendo a sequência 5´-AUG-3´ atraia ao ribossomo outra espécie de RNA chamada de tRNA – RNA transportador. Existem vários tipos de tRNA na célula (20 em total). Especificamente, esse códon (5´-AUG-3´) chama o tRNA que tem o anti-códon 5´-CAU-3´ (complementar ao 5´-AUG-3´). Desse jeito o tRNA associa-se ao mRNA por complementariedade. Importantemente, cada tRNA também carrega um aminoácido, e o tRNA com anti-códon 5´-CAU-3´ carrega (sempre) o aminoácido metionina (Met). Assim, o primeiro códon do gene/mRNA sempre irá chamar o aminoácido Met para ser o primeiro aminoácido da proteína. Com isso feito, o ribossomo examine o segundo códon. Se o segundo códon for 5´-ACC-3´ (por exemplo), esse atrairá o tRNA com anti-códon 5´-GGU-3´, o que carrega o aminoácido treonina (Thr). Esse aminoácido estará acrescentado na sequência da proteína, e o ribossomo continua para o terceiro códon. Cada códon especifica um aminoácido, e desse jeito, a sequência do mRNA determine a sequência da proteína (e enquanto a sequência do gene determinou a sequência do mRNA, poderemos dizer que a sequência do gene determina a sequência da proteína). 
-Nesta figura observamos as primeiras etapas de tradução. O primeiro códon do mRNA é AUG, e chamou o tRNA com anti-codon CAU, o qual carregou Metionina. O segundo códon é UUU, chamou o tRNA com anti-códon AAA, o qual carregou Fenilalanina (Phe). Já o terceiro códon é CGA, o qual resultará na adição de Arginina à cadeia de aminoácidos. Esse processo continuará até que chegamos em um códon de terminação. Com isso, o complexo irá desassociar, liberando a proteína para realizar a sua função dentro (ou talvez fora!) da célula. 
O código genético:
E como sabemos qual aminoácido está especificado por qual códon? Está descrito na seguinte tabela, chamada de o código genético, o qual é comum entre a maioria dos organismos eucarióticos:
Observações importantes:
Cada códon especifica um (e apenas um) aminoácido. 
Porém, a maioria de aminoácidos podem ser especificados por mais de um códon. Por exemplo, fenilalanina (Phe) tem dois códons – 5´-UUU-3´ e 5´-UUC-3´. Leucina (Leu) tem 6 códons. Só Met e triptofano (Trp) têm apenas um códon cada. 
Existem 64 códons em total. 61 desses especificam aminoácidos, e 3 (5´-UAA-3´, 5´-UAG-3´, e 5´-UGA-3´) são chamadas de códons de terminação (Stop/Ter). A sequência codante sempre acaba com um códon de terminação, e quando o ribossomo chega neste códon, irá fazer exatamente isso – terminar! Após encontrar um desses códons, não será adicionado mais aminoácidos. O mRNA desliga-se do ribossomo, e a proteína está liberada para adoptar a sua forma três-dimensional, e realizar a sua função. 
Splicing alternativo
Antes de fechar o tema de expressão gênica, há mais um conceito importante para explorar, e é chamado de splicing alternativo. Um pouco de contextualização: o genoma humano contém na faixa de 25.000 genes codificantes. No entanto, é estimado que estamos capazes de produzir bem mais de 100.000 diferentes proteínas. Isso sugere que os genes estão capazes de produzir mais de uma proteína (chamado de isoformas da proteína). Isso é realizado em grande parte pelo processo de splicing alternativo. Quer dizer que em diferentes tecidos (ou em diferentes momentos), o gene consegue empregar diferentes combinações de seus exons, assim produzindo diferentes versões da proteína. Esquematizando: 
-Nesta figura temos um esquema de um gene com 4 exons, que sofre transcrição. No processo de splicing, a célula pode (em diferentes células, diferentes momentos, em resposta a fatores ambientais...) escolher diferentes combinações de exons, produzindo proteínas que são similares, mas que podem ter funções bem diferentes. 
O processo de splicing alternativo permite aumentar a diversidade de proteínas produzida pelos nossos genes, amplificando as funções dos genes, e em algumas situações, servindo como método de controle. É estimado que a grande maioria dos nossos genes estão capazes de experimentar esse processo. E, o processo não é igual entre todos os genes. Alguns genes têm poucas (2-3) variantes de splicing. Já outros têm muito mais. O gene DMD (que codifica a proteína distrofina), tem pelo menos 32 variantes do mRNA produzidas por splicing alternativo!
Exemplo de um gene expresso e fenótipo:
Vamos então voltar ao nosso exemplo de crescimento humano, e o receptor do hormônio de crescimento.
Esse gene (GHR) se encontra no braço curto do cromossomo 5 em seres humanos (localização: 5p13). Consiste de 11 exons (10 introns), e produz 13 variantes de splicing (13 diferentes tipos de mRNA maduro). A região genômica (5’UTR + exons + introns + 3ÚTR) do gene GHR está compreendida entre as posições 42.423.475 e 42.721.878 no cromossomo 5. Ou seja, um total de 298.404 pares de base. O mRNA mensageiro maduro da principal variante de splicing tem 4414 nucleotídeos (nt), sendo 43 nt de 5’UTR, 1917 nucleotídeos de exons (região codificante) e 2455 nt de 3’UTR. Os 1917 nucleotídeos da região codificante serão traduzidos em uma proteína de 638 aminoácidos (lembrando que o códon de terminação não é traduzido em aminoácido) O gene está expresso em vários tecidos, inclusive no fígado e na cartilagem durante crescimento da criança.
Para a expressão do gene, fatores de transcrição entram no núcleo da célula, e se ligam nas regiões regulatórias de ambas as cópias do gene (uma cópia em cada um dos cromossomos 5). O organismo precisa expressar ambas as cópias para ter um crescimento normal (*observam que isso não é o caso para todos os genes, - para alguns genes basta ser expresso a partir de uma única cópia).
A ativação do promotor resulta em produção do pré-mRNA, o qual passa pelo processo de splicing para remover os introns. Depois, o mRNA maduro passa para o citoplasma, onde está traduzida para produzir a molécula (proteína) de GHR. Igual todas as proteínas, o GHR tem um lugar específico para executar a sua função. Neste caso, a proteína GHR está pareada com outra molécula idêntica de GHR (isso ocorre no complexo de Golgi), e este dímero se insere na membrana da célula. Desta maneira, o receptor GHR tem uma parte fora da célula, e uma parte dentro (vide figura em baixo). Isso faz sentido se lembramos que é o receptor do hormônio de crescimento, uma molécula que é produzida pelo cérebro, e que viaja no sangue até chegar no fígado ou cartilagem. Com isso, o hormônio se liga na parte do GHR fora da célula, e o receptor transmite uma mensagem para dentro que resulta em eventos tais como alteração de expressão gênica para causar divisão celular. Desta maneira poderemos enxergar que as duas cópias deste gene têm um papel muito importante no crescimento do organismo. Como descobriremos em outra aula, alterações no DNA do gene GHR resultam em problemas do crescimento da pessoa.
Na figura em baixo: Parte 1: Dentro do núcleo, fatores de transcrição se ligam no promotor do gene GHR (ambas as cópias). Isso resulta em produção de mRNA, o qual experimenta splicing, antes de sair do núcleo(2). No citoplasma, o mRNA entra no ribossomo (3), onde o processo de tradução produza as moléculas da proteína GHR (4). Estas moléculas se inserem na membrana em pares (dímeros), formando o GHR maduro, que pode ser estimulado pelo hormônio de crescimento – GH (5). Este estímulo pelo GH resulta em uma cascada de reações dentro da célula (6), eventualmente resultando em indução (ou às vezes repressão) de expressão de outros genes (7). As proteínas codificadas por estes outros genes efetuam processos tais como divisão celular, crescimento de tecidos, metabolismo, etc, assim contribuindo para o crescimento do indivíduo. 
Conectando o receptor de GHR com Mendel
Finalmente, vamos relacionar o papel do GHR na característica altura ao que aprendemos sobre a segregação mendeliana. Como já mencionamos neste texto, a variação da altura na população em geral (verifique sua altura em relação à altura de seus colegas) é o que chamamos de uma característica complexa (assunto para o futuro em nossa disciplina). No entanto, há situações onde fenótipos associados a altura está fortemente associado a um único gene. É o que podemos exemplificar com a Síndrome de Laron. Os pacientes com esta síndrome apresentam nanismo em decorrência de não codificarem o GHR em nenhum dos membros do par de cromossomo 5. Ou seja, indivíduos com a Síndrome de Laron são homozigotos recessivos (aa). Volte a figura acima e formule qual a consequência para estes indivíduos em termos de ação do hormônio do crescimento. Vamos supor, por exemplo, que em uma determinada posição dentro do gene GHR, existe o nucleotídeo G em uma cópia do genoma, enquanto em outra cópia do genoma, há nucleotídeo T na mesma posição. O mRNA transcrito a partir do cromossomo que tem o nucleotídeo T é traduzido para uma proteína não funcional. Essas diferentes versões do mesmo gene são os alelos. 
Neste exemplo, indivíduos que carreguem as duas cópias dos cromossomos com o nucleotídeo G transcreverão mRNA que será traduzido em um receptor do hormônio do crescimento funcional. Ou seja, terão altura dentro do espectro da variação normal. Já indivíduos que possuem um cromossomo com nucleotídeo G e o outro cromossomo com alelo T, transcreverão dois tipos de mRNA. Um que será traduzido em GHR funcional e outro que será traduzido em GHR não funcional. Neste caso uma única cópia de GHR permitirá que o GH desempenhe seu papel e o indivíduo tenham sua altura no espectro da variabilidade normal.
E os indivíduos que possuem a sequência de DNA em ambos os cromossomos 5 com o nucleotídeo T, transcreverão mRNAs que não serão traduzidos em GHR funcional. Ou seja, o GH não ativará a transcrição de outros genes importantes para o crescimento (ver figura acima). Estes indivíduos terão sua altura dentro do espectro patológico da Síndrome de Laron (Figura abaixo)
Dr. Jaime Guevara-Aguirre (atrás na esquerda) e Dr. Valter Longo (atrás na direita) com alguns pacientes com a Síndrome de Loran no Equador.