Cadeia transportadora de elétrons e fosforilação oxidativa

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Cadeia transportadora de elétrons e fosforilação oxidativa
	Se compararmos os organismo anaeróbicos com os aeróbicos, observaremos que os últimos são capazes de captar uma proporção muito maior da energia livre disponível nos substratos respiratórios. A cadeia transportadora de elétrons e a fosforilação oxidativa são o ponto de convergência dos passos de oxidação anteriores de carboidratos, lipídeos e aminoácidos. A cadeia transportadora de elétrons é a última etapa do processo de respiração celular e a energia desta oxidação governa a síntese de ATP. Em eucariotos, estes eventos ocorrem na mitocôndria. Neste texto, serão abordados como as características das mitocôndrias e porque estes processos ocorrem nelas, bem como outras funções das mitocôndrias. A seguir, serão descritos as reações de transferência de elétrons e a síntese de ATP e como ocorre a regulação destes processos. Por fim, serão abordados os efeitos de fármacos e venenos que atuam como inibidores e desacopladores da cadeia transportadora de elétrons e da fosforilação oxidativa.
1. A mitocôndria
	A mitocôndria tem duas membranas como pode ser observado no esquema a seguir.
	A membrana mitocondrial externa é permeável a moléculas de até 5000 Da e a íons, que se movem através dos canais permeáveis, denominados porinas. Por outro lado, a membrana mitocondrial interna é impermeável à maioria das pequenas moléculas e íons e contém vários transportadores de membranas, entre eles os transportadores de elétrons da cadeia respiratória e a ATP-sintase (F1FO). Essa permeabilidade seletiva segrega os intermediários e as enzimas das vias metabólicas citosólicas daqueles dos processos metabólicos que ocorrem na matriz. A membrana mitocondrial interna apresenta convuluções ou cristas, que fornecem uma grande área de superfície. A matriz mitocondrial, delimitada pela membrana interna, contém o complexo da piruvato desidrogenase, várias enzimas, entre as quais, as do ciclo do ácido cítrico, das β-oxidação dos ácidos graxos, da oxidação dos aminoácidos, intermediários metabólicos solúveis, ATP, ADP, Pi, Mg2+, Ca2+ e K+. 
	O número e o tamanho de mitocôndrias, bem como e quantidade de cristas mitocondriais depende da demanda metabólica do tecido, sendo assim, tecidos com grande demanda metabólica como o dos músculos e o cérebro apresentam mais mitocôndrias e com mais densidade de cristas que na pele. 
	A principal função das mitocôndrias relaciona-se com a oxidação de substratos energéticos e a produção de ATP. Além desta função, em tecidos específicos ou sob condições específicas, outras funções são observadas. As mitocôndrias estão relacionadas com a produção de calor no tecido adiposo marrom, que recebe esse nome em virtude da grande quantidade de mitocôndrias, e consequentemente de citocromos que apresentam o grupo heme que absorvem a luz visível. Este tecido, que está presente principalmente em mamíferos recém-nascidos e hibernadores, possui a termogenina, ou proteína desacopladora (UCP1), que desacopla a cadeia transportadora de elétrons da síntese de ATP. Dessa forma, a energia do transporte de elétrons é dissipada na forma de calor, que contribui para a manutenção da temperatura corporal. Na membrana mitocondrial interna de mitocôndrias especializadas das células esteroidogênicas, está localizado o citocromo P-450, que é responsável pela hidroxilação de esteroides, produzindo os hormônios esteroides. Por fim, as mitocôndrias também são importantes para o início da apoptose. Quando um fator de estresse sinaliza a morte celular, as mitocôndrias ativam o complexo do poro de transição de permeabilidade, que permite que o citocromo c escape do espaço intramembrana para o citosol. No citosol, o citocromo c age como um gatilho para a apoptose, estimulando a ativação de caspases, que são proteases envolvidas na apoptose. 
	Por apresentarem uma característica de dupla membrana, compartilhada apenas com os cloroplastos, acredita-se que as mitocôndrias tenham surgido de bactérias aeróbicas que entraram em relação endossimbiótica com eucariotos ancestrais. Além disso, a mitocôndria apresenta DNA próprio, extranuclear e circular, denominado DNA mitocondrial. Esse DNA sintetiza 13 proteínas, as demais proteínas mitocôndrias são sintetizadas a partir do DNA nuclear. As mutações no genoma mitocondrial se acumulam ao longo da vida do organismo. Mutações nos genes que codificam os componentes da cadeia respiratória, da ATP-sintase e do sistema de captura das espécies reativas do oxigênio podem causar uma variedade de doenças humanas que, com frequência, afetam mais gravemente o músculo, o coração, as células β pancreáticas e o encéfalo. 
2. A cadeia transportadora de elétrons
	A síntese de ATP nas mitocôndrias ocorre em duas etapas: a cadeia transportadora de elétrons e a fosforilação oxidativa. Na verdade, as duas etapas estão acopladas, sendo que a energia do fluxo de elétrons é conservada pelo bombeamento concomitante de prótons através da membrana, produzindo um gradiente eletroquímico, a força próton-motriz, que dirige a síntese de ATP. Esse processo ficou conhecido como teoria quimiosmótica. 
	Começaremos examinando a cadeia transportadora de elétrons. Nas etapas anteriores do metabolismo, as diferentes biomoléculas foram totalmente oxidadas e os elétrons foram transferidos para aceptores universais de elétrons por enzimas da classe das desidrogenases. Estas desidrogenases podem estar ligados a dois tipos de nucleotídeos, que são os aceptores de elétrons: os nucleotídeos de nicotinamida (NAD+ ou NADP+) recebem um íon hidreto (:H-) transformando-se em NADH ou NADPH, que são carregadores de elétrons solúveis em água, que se associam reversivelmente com as desidrogenases; existem também os nucleotídeos de flavina (FAD ou FMN) que se ligam as desidrogenasses denominadas flavoproteínas e podem aceitar um ou dois elétrons produzindo FADH2 ou FMN2, quando aceitam dois elétrons. 
	A membrana mitocondrial interna é impermeável a NADH e NAD+, mas equivalentes de NADH podem ser tranferidos do citosol para a matriz por duas lançadeiras. Equivalentes de NADH deslocados para dentro da mitocôndria pela lançadeira do malato-aspartato (encontrada nos fígado, rim e coração) entram na cadeia respiratória no complexo I enquanto aqueles movimentados para dentro pela lançadeira do glicerol-3-fosfato (encontrada no cérebro e músculos) entram na ubiquinona. 
	Os dois tipos de nucleotídeos transportam estes elétrons até a cadeia transportadora de elétrons. A cadeia respiratória mitocondrial consiste em uma série de carregadores que funcionam em ordem crescente de potencial de redução, isto é, os elétrons fluem de carregadores de E'° menores para carregadores de E'° maiores. Por esta razão é possível entender porque o O2 é o aceptor final de elétrons da cadeia respiratória, uma vez que ele apresenta um alto valor de E'°. A maioria destes carregadores são proteínas integrais com grupos prostéticos capazes de aceitar e doar um ou dois elétrons. Algumas destas proteínas contém o átomo de ferro em associação com átomos de enxofre inorgânico ou com átomos de enxofre dos resíduos de císteínas e são denominadas proteínas ferro-enxofre. Outra classe destas proteínas são os citocromos, proteínas que absorvem a luz visível devido a presença de grupos prostéticos heme contendo ferro. As mitocôndrias têm três classes de citocromos, designados a, b e c, que são distinguidos por diferenças em seus espectros de absorção da luz. Os citocromos a, b e alguns do tipo c são proteínas integrais de membrana, enquanto o citocromo c é uma proteína solúvel associada à face externa da membrana mitocondrial interna por meio de interações eletrostáticas. 
	Na membrana mitocondrial interna são encontrados quatro complexos que formam a cadeia transportadora de elétrons, a ubiquinona e o citocromo c, que estão representados na figura abaixo. Embora os complexos atuem de forma individual, existem evidências de que os complexos respiratórios se associam firmemente uns com os outrosna membrana interna para formar respirassomos, que são combinações funcionais de dois ou mais complexos de transferência de elétrons diferentes.
Complexo I ou NADH-desidrogenase: proteína integral de membrana que é composta por 42 cadeias diferentes de polipeptídeos, incluindo uma proteína FMN e seis centros de ferro-enxofre. O par de elétrons do NADH passa para a proteína FMN e para uma série de centros Fe-S e, então, para a ubiquinona. Esta transferência de elétrons também governa a expulsão da matriz de quatro prótons por par de elétrons. A reação global para o transporte de cada parte de elétrons é mostrado na equação:
Complexo II ou succinato-desidrogenase: este complexo apresenta quatro subunidades. O par de elétrons do FADH2 é transferido para os centros Fe-S e então para o sítio de ligação da coenzima Q. Existe também um grupo heme b que não está na via principal da transferência de elétrons, mas protege contra a formação de espécies reativas do oxigênio. Os centros Fe-S não recebem prótons, os prótons presentes no FADH2 são devolvidos a matriz mitocondrial. 
Coenzima Q ou ubiquinona: é uma benzoquinona solúvel em lipídeos, com uma longa cadeia lateral isoprenoide. A ubiquinona é pequena e hidrofóbica, sendo assim capaz de se difundir dentro da bicamada da membrana mitocondrial interna e movimentar equivalentes redutores entre outros carregadores de elétrons. Além de receber elétrons e prótons do complexo I e elétrons do complexo II, a ubiquinona também pode receber elétrons de outras desidrogenases mitocondriais, que são a acil-CoA-desidrogenase e a glicerol-3-fosfato desidrogenase, que transferem elétrons a partir do acetil-CoA e do glicerol-3-fosfato, respectivamente. A ubiquinona reduzida é reoxidada pelo complexo III. 
Complexo III ou citocromo c-oxidorredutase bc1: é um dímero com três subunidades cada um, sendo que os elétrons da ubiquinona seguem para os grupos hemebH e hemebL do citocromo b, depois para a proteína Fe-S e a seguir para o hemec1 do citocromo c1. A seguir os elétrons são transferidos para o citocromo c. Concomitante ao transporte de elétron ocorre o bombeamento de quatro prótons da matriz para o espaço intermembranas, conforme mostrado na equação: 
Essa equação resumo o ciclo Q, que explica a passagem de életrons e prótons pelo complexo III. No ciclo Q, Q é reduzida a um radical semiquinona (apenas um elétrons) e depois a ubiquinol (QH2); simultaneamente duas moléculas QH2 são oxidadas a Q liberando quatro prótons para o espaço intermembranas. Os elétrons de QH2 são transferidos até o citocromo c, sendo um de cada vez, dessa forma, QH2 transfere um elétron para o centro Fe-S e um elétron para uma coenzima Q na forma oxidada, que se torna uma semiquinona. Através desse movimento complexo de elétrons, QH2 é oxidado a Q, duas moléculas de citocromo c são reduzidas, e prótons são movidos da matriz para o espaço intramembranas. 
Citocromo c: como discutido anteriormente, o citocromo c é uma proteína solúvel do espaço intermembranas. Ele recebe um elétrons no seu grupo heme do complexo III, move-se para o complexo IV para doar o elétron para um centro cobre. 
Complexo IV ou citocromo-oxidase: este complexo apresenta 13 subunidades em eucariotos e 3 ou 4 em bactérias. O elétron do citocromo c é transferido para um centro binuclear, que consiste em íons cobre ligados aos grupos SH de resíduos de cisteína; a seguir, o elétron é transferido para o heme a, para o centro de heme a3-Cu e, finalmente para o O2, formando água quando quatro elétrons são transferidos. Dessa forma quatro prótons da matriz são consumidos para formar a molécula de água e para cada elétron transportado, um próton é bombeado para fora, contribuindo para a geração do potencial eletroquímico. A equação da reação global é: 
O transporte de dois elétrons do NADH até o oxigênio molecular é um processo altamente exergônico e a maior parte desta energia é usada para bombear prótons, como visto na equação vetorial do processo:
Essa energia eletroquímica inerente a essa diferença na concentração de prótons e separação de cargas representa uma conservação de grande parte da energia de transferência de um par de elétrons (cerca de 200 kJ). Esse gradiente gera uma energia denominada de força próton-motriz, que tem dois componentes: a energia potencial química, devido à diferença de concentração de prótons nas duas regiões separadas pela membrana; e a energia potencial elétrica, que resulta da separação de cargas quando um próton se move através da membrana sem um contra-íon. 	
	Diversas etapas do transporte de elétrons podem produzir radicais livres reativos, que podem danificar as células, reagindo com enzimas, lipídeos de membrana e ácidos nucleícos. Quando a taxa de entrada de elétrons na cadeia respiratória e a taxa de transferência de elétrons ao longo da cadeia não são coordenados, a produção desses radicais livres é aumentada. Estas espécies reativas de oxigênio potencialmente danosas são inativas por um conjunto de enzimas protetoras, incluindo a superóxido-dimutase que atua sobre o radical superóxido e a glutationa-peroxidase que inativa o peróxido de hidrogênio. 
	Plantas, fungos e unicelulares têm, além da via típica para a transferência de elétrons, uma via de oxidação de NADH alternativa, resistente ao cianeto. Nessa via, serina é produzida a partir da glicina e o NADH formado entrega seus elétrons diretamente para a ubiquinona e esta para o oxigênio, dissipando a energia como calor.
3. Fosforilação oxidativa 
	A energia do transporte de um par de elétrons é conservada na forma de força próton-motriz é suficiente para impulsionar a formação de um mol de ATP. A síntese de ATP e a força próton-motriz são acoplados por um mecanismo denominado modelo quimiosmótico. Neste modelo, a energia eletroquímica inerente à diferença de concentração de prótons e à separação de cargas através da membrana mitocondrial interna impulsiona a síntese de ATP, à medida que os prótons fluem passivamente de volta à matriz, por meio de um poro para prótons na ATP-sintase. Esse acoplamento é obrigatório, sendo que nenhum dos dois processos pode prosseguir sem o outro. Isso pode ser verificado nos gráficos a seguir. A adição isolada de ADP e Pi resulta em pouco ou nenhum aumento no consumo de oxigênio ou da síntese de ATP. Quando um substrato oxidável como o succinato é adicionado, a respiração inicia e ATP é sintetizado. O mesmo é observado se o succinato for adicionado primeiro, só ocorre síntese de ATP e respiração, se for adicionado ADP e Pi. 
	Como dito anteriormente, a síntese de ATP ocorre na ATP-sintase localizada na membrana mitocondrial interna e muitas vezes denominada de complexo V da cadeia respiratória. A ATP-sintase é uma F-ATPase, que apresenta dois componentes distintos: F1, proteína periférica de membrana, onde ocorre a síntese de ATP e FO, integral à membrana, que contém um poro para prótons. Na superfície da F1, o ATP é estabilizado em relação ao ADP, ou seja, o ATP está ligado mais firmemente, liberando energia suficiente para contrabalançar o custo da sua produção. Entretanto, esse ATP é incapaz de ser liberado da superfície da F1, é necessário o gradiente de prótons para que ocorra esta liberação. A porção F1 tem nove subunidades de cinco tipos diferentes (α3β3γδε) e cada uma das três subunidades β tem um sítio catalítico para a ligação do ATP. Entretanto, cada uma das três subunidades β diferem quanto a conformação e consequentemente apresentam diferença na ligação ao nucleotídeo, sendo denominadas β-ATP, β-ADP e β-vazio. O complexo FO, é composto por três subunidades na proporção ab2cn, onde n varia de 8 a 15, dependendo da espécie. A subunidade c é um polipeptídeo pequeno e hidrofóbico que forma um anel, que junto com a subunidade a interagem pra promover a rota transmembrana para prótons. Cada subunidade c tem um resíduo de Asp, o qual pode ligar ou liberar um próton. A interação desse resíduo de Asp com um resíduo de Arg da subunidade a e com o prótonpromove o transporte uniderecional de prótons. O mecanismo de alteração na ligação durante a síntese de ATP é explicado pela catálise rotacional. Neste mecanismo, uma dada subunidade β começa na conformação β-ADP, que liga ADP e Pi. A subunidade sofre uma mudança conformacional, assumindo a forma β-ATP, que se liga firmemente e estalibiza o ATP. Finalmente, a subunidade muda para a conformação β-vazio, que tem baixa afinidade pelo ATP, e o ATP recém-sintetizado deixa a superfície da enzima. As mudanças conformacionais que ocorrem nesse mecanismo são desencadeadas pela passagem de prótons pela porção FO. A corrente de prótons através do poro de FO faz o cilindro de subunidade c e subunidade γ a ele encaixada rodar ao longo do eixo de γ, que é perpendicular ao plano da membrana. As três subunidades β interagem de modo que, quando uma assume a conformação β-vazio, sua vizinha em um dos lados precisa assumir a forma β-ADP e a outra vizinha a forma β-ATP. 
	A equação da reação global da fosforilação oxidativa acoplada é:
	Nessa equação, a razão entre ATP sintetizado por 1/2O2 reduzido (a razão P/O) é de cerca de 2,5 quando os elétrons entram na cadeia respiratória no complexo I, e 1,5 quando os elétrons entram na ubiquinona ou pelo complexo II. Essa razão pode variar um pouco em diferentes organismos com base no número de subunidades c do complexo FO. Para se chegar a esta razão deve-se considerar que 10 e 6 prótons são bombeados para fora por par de elétrons, que entram pelo complexo I e complexo II, respectivamente; e que 4 prótons são necessários para a síntese de uma molécula de ATP. Cabe aqui também lembrar que existem dois sistemas de lançadeiras de NADH citosólico conforme descrito anteriormente, e que a lançadeira do malato-aspartato produz uma razão P/O de 2,5 enquanto que a lançadeira do glicerol-3-fosfato gera uma razão P/O de 1,5.
	A oxidação completa de uma molécula de glicose a CO2 produz 30 ou 32 ATP, conforme mostrado nos cálculos a seguir, demonstrando que a fosforilação oxidativa é responsável pela maior parte do ATP produzido no catabolismo.
	Além de fornecer energia para a síntese de ATP, a força próton-motriz pode propiciar o transporte de solutos contra o gradiente através da membrana. A adenina-nucleotídeo-translocase liga ADP3- no espaço intermembrana e o transporta para a matriz, em troca de uma molécula de ATP4-, simultaneamente transportada para fora. A fosfato translocase promove o simporte de um H2PO4- e um H+ para a matriz. Em ambas as situações a baixa concentração de prótons na matriz favorece o movimento de H+ para dentro. 
4. Regulação da fosforilação oxidativa
	A fosforilação oxidativa é regulada pelas demandas energéticas celulares. A [ADP] intracelular e a razão massa-ação [ATP]/[ADP] [Pi] são medidas do estado energético de uma célula e regulam a velocidade da fosforilação oxidativa. Dessa forma, a taxa de consumo de oxigênio nas mitocôndrias é limitada pela disponibilidade de ADP como substrato para a fosforilação e, em virtude da razão massa-ação, quando aumenta a taxa de consumo de energia, essa razão diminui, disponibilizando mais ADP para fosforilação e aumentando a respiração para regenerar o ATP. 
	Em células desprovidas ou com pouca disponibildade de oxigênio (hipóxia), um inibidor proteico conhecido como IF1 bloqueia a hidrólise de ATP pela atividade reversa da ATP-sintase, impedindo uma queda drástica na [ATP]. Além disso, uma outra resposta à hipóxia consiste na redução da transferência de elétrons para a cadeia respiratória e modificação do complexo IV para que ele atue de maneira mais eficiente sob condições de baixo oxigênio e evitando a formação de espécies reativas de oxigênio. 
	As concentrações de ATP e ADP bem como de AMP e NADH estabelecem a velocidade de transporte de elétrons pela cadeia respiratória, por uma série de controles interconectados sobre a respiração, a glicólise e o ciclo do ácido cítrico. A glicólise e o ciclo do ácido cítrico apresentam enzimas que são inibidas alostericamente pelo ATP ou estimuladas alostericamente pelo ADP, e a interligação da glicólise e do ciclo do ácido cítrico pelo citrato, o qual inibe a glicólise (fosfrutoquinase-1), suplementa a ação dos nucleotídeos. 
5. Inibidores e desacopladores
	Existem agentes que são capazes de atuar especificamente sobre cada um dos complexos da cadeia transportadora de elétrons ou da ATP-sintase, sendo denominados inibidores. No caso dos inibidores dos complexos da cadeia transportadora de elétrons, o resultado é similar para qualquer um deles, ou seja, primeiramente ocorre a paralisação do transporte de elétrons e das vias metabólicas que dependem da cadeia para a reoxidação de coenzimas. Em seguida, os complexos anteriores permanecem reduzidos pois não podem transferir os elétrons e não são capazes de receber novos elétrons e a cadeia torna-se inoperante. Sem o transporte de elétrons não se forma o gradiente de prótons, e assim, não há síntese de ATP. Os principais inibidores dos complexos da cadeia transportadora de elétrons são: amital, rotenona e piercidina bloqueiam o complexo I; malonato inibi o complexo II; antimicina A bloqueia o complexo III e o cianeto e monóxido de carbono inibem o complexo IV.
	Os inibidores que atuam sobre a ATP-sintase são a oligomicina, aurovertina e venturidicina e tem efeito semelhante aos inibidores anteriormente descritos, isto é, neste caso ocorre a manutenção do gradiente de prótons e/ou bloqueio da síntese de ATP e consequentemente cessa a cadeia de transporte de elétrons e o consumo de oxigênio. 
	Por outro lado, existem os chamados desacopladores, que recebem este nome porque permitem que ocorra transporte de elétrons sem síntese de ATP. Isso é possível porque, estes desacopladores como o 2,4-dinitrofenol (DNP) são ácidos fracos hidrofóbicos que podem se difundir pelas membranas mitocondriais. Como é um ácido fraco, ele associa-se a prótons no exterior da membrana interna, onde o pH é menor. Assim, estes desacopladores carregam prótons através da membrana mitocondrial interna, dissipando o gradiente de prótons. A energia do transporte de elétrons é dissipada na forma de calor. Existem também os inóforos como a valinomicina, que permitem que íons inorgânicos passem facilmente através da membrana, desacoplando os dois processos por dissipar a contribuição elétrica ao gradiente eletroquímico através da membrana mitocondrial. O efeito distinto dos desacopladores e inibidores pode ser observado na representação a seguir:
Conclusão:	A mitocôndria apresenta uma dupla membrana, sendo que a membrana mitocondrial interna abriga os transportadores de elétrons, que geram um gradiente eletroquímico de prótons que impulsiona a síntese de ATP pela ATP-sintase. O acoplamento deste dois processos é regulado pela disponibilidade de ADP e existem inibidores que paralisam os dois processos, e compostos conhecidos como desacopladores que permitem o transporte de elétrons sem a síntese de ATP.