Malária - Artigo

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Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 41(4):381-385, jul-ago, 2008 ARTIGO/ARTICLE 
O diagnóstico laboratorial rotineiro da malária é realizado 
pelo método da gota espessa, consistindo na identificação 
dos parasitos no sangue periférico, por meio de microscopia 
óptica. O aperfeiçoamento da microscopia e a introdução de 
corantes biológicos que permitem identificar a espécie, estádio 
1. Gerência de Malária. Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Manaus, AM. 2. Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM. 3. Universidade Federal do Amazonas, 
Manaus, AM. 4. Centro Universitário Nilton Lins, Manaus, AM.
Órgãos financiadores: Superintendência da Zona Franca de Manaus (convênio nº 035/2002) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico 
(convênio n° 550260/2001-3).
Endereço para correspondência: Dr. Pedro Paulo Ribeiro Vieira. Gerência de Malária/FMT-AM. Av. Pedro Teixeira 25, D. Pedro I, 69040-000 Manaus, AM.
Tel.: 55 92 2127-3443; Fax: 55 92 3238-3762 
e-mail: pvieira@fmt.am.gov.br
Recebido para publicação em 14/05/2007
Aceito em 02/07/2008
Diagnóstico molecular da malária em uma unidade 
de atenção terciária na Amazônia Brasileira
Molecular diagnosing of malaria in a tertiary 
care center in the Brazilian Amazon region
Mônica Regina Farias Costa1,2, Pedro Paulo Ribeiro Vieira1,2, Cynthia de Oliveira Ferreira3, 
Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda1,2,4, Wilson Duarte Alecrim1,4 
e Maria das Graças Costa Alecrim1,2,4
RESUMO
O exame de rotina para o diagnóstico da malária continua sendo a gota espessa, apesar da comprovada diminuição da sensibilidade e especificidade 
em situações de densidade parasitária baixa e infecções mistas. A reação em cadeia da polimerase vem sendo cada vez mais utilizada para a detecção 
molecular e identificação das espécies de plasmódio, por apresentar maior sensibilidade e especificidade. Foi realizada a nested-PCR em amostras de 
sangue total de 344 pacientes com síndrome febril aguda que se apresentaram para o diagnóstico de malária, em uma unidade terciária de saúde, em 
Manaus (Amazonas). Nenhum caso de malária porNenhum caso de malária por Plasmodium malariae foi diagnosticado à gota espessa ou PCR. Observou-se co-positividade de 
96,7%, co-negatividade de 62,2% e coeficiente kappa de 0,44 entre PCR e gota espessa para Plasmodium falciparum. Para Plasmodium vivax, co-
positividade de 100%, co-negatividade de 78,1% e coeficiente kappa de 0,56. Na detecção da malária mista, co-positividade de 100%, co-negatividade 
de 84,9% e coeficiente kappa de 0,26. A reação em cadeia da polimerase detectou alto número de infecções mistas nas amostras analisadas, masreação em cadeia da polimerase detectou alto número de infecções mistas nas amostras analisadas, mas detectou alto número de infecções mistas nas amostras analisadas, mas 
seu uso rotineiro no diagnóstico da malária merece ainda ampla discussão.
Palavras-chaves: Malária. Diagnóstico. Biologia molecular. Reação em cadeia da polimerase..
ABSTRACT
The routine test for diagnosing malaria is still the thick blood smear, despite its known decreased sensitivity and specificity in situations of low parasite 
density and mixed infections. The polymerase chain reaction is increasingly being used for molecular detection and identification of Plasmodium species, 
due to its higher sensitivity and specificity. Nested PCR was performed on whole-blood samples from 344 patients with acute febrile syndrome who came 
to a tertiary healthcare center in Manaus (State of Amazonas) for diagnostic confirmation of malaria. No malaria cases caused by Plasmodium malariae 
were detected through the blood smear or PCR. Co-positivity of 96.7%, co-negativity of 62.2% and kappa coefficient of 0.44 were observed between PCR 
and thick blood smear for Plasmodium falciparum. For Plasmodium vivax, co-positivity of 100%, co-negativity of 78.1% and kappa coefficient of 0.56 
were observed. For mixed infection, co-positivity of 100%, co-negativity of 84.9% and kappa coefficient of 0.26 were observed. Polymerase chain reaction 
detected a high number of mixed infections in the samples analyzed, but its routine use for diagnosing malaria still deserves further discussion..
Key-words: Malaria. Diagnosis. Molecular biology. Polymerase chain reaction.Polymerase chain reaction.olymerase chain reaction..
de desenvolvimento, viabilidade e quantificação dos parasitos, 
tornaram o método simples, rápido e satisfatório quanto à 
sua sensibilidae e especificidade16. Entretanto, discute-se a 
baixa sensibilidade da técnica para o diagnóstico de baixas 
parasitemias (comum em portadores assintomáticos de 
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Costa MRF cols
plasmódio) e de infecções mistas13. Desde 1990, vários estudosDesde 1990, vários estudos 
têm ressaltado a aplicação da reação em cadeia da polimerase 
(polymerase-chain reaction – PCR) no diagnóstico molecular da 
malária12 26, nos inquéritos epidemiológicos28 30, no rastreamento 
de doadores infectados em bancos de sangue27, na determinação 
do portador assintomático de plasmódio1 29 e no monitoramento 
da resposta terapêutica5. Mas apesar das inúmeras experiências 
demonstrarem que a PCR apresenta maior sensibilidade que o exame 
microscópico2 4 18 24 25 31 32, sendo até utilizado com padrão-ouro no 
diagnóstico da infecção, por alguns autores20, o real desempenho 
da técnica em campo carece de mais evidências, em especial pelo 
alto custo e infra-estrutura sofisticada ainda necessários para sua 
execução. Pela escassez de dados referentes ao desempenho da PCR. Pela escassez de dados referentes ao desempenho da PCR 
em áreas endêmicas para malária, no Brasil, este trabalho teve aste trabalho teve a 
finalidade de analisar a experiência com o diagnóstico molecular da 
malária de uma unidade de atenção terciária para doenças infecciosas, 
em área hiper-endêmica para malária, na Amazônia Brasileira, 
comparando uma das mais reconhecidas técnicas de detecção de 
DNA genômico plasmodial com o tradicional diagnóstico pela gota 
espessa recomendado pela Organização Mundial da Saúde, tendo 
como objetivos secundários a estimativa da freqüência de infecções 
mistas e da infecção por Plasmodium malariae.
PACIENTES E MÉTODOS
Trata-se de um estudo de avaliação da co-positividade e da co-
negatividade da PCR com a gota espessa, na Fundação de Medicina 
Tropical do Amazonas (FMT-AM), em Manaus (Amazonas). O 
estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FMT-
AM (processo nº 2816/2002) e contou com o consentimento por 
escrito dos participantes.
Seleção dos pacientes. Foram selecionados aleatoriamente 
344 pacientes com síndrome febril aguda, que procuraram a 
FMT-AM para o diagnóstico de malária, no período de janeiro 
de 2001 a dezembro de 2002.
Gota espessa. Na FMT-AM, o diagnóstico de rotina da malária 
é realizado pelo exame da gota espessa (método de Walker), 
seguindo a padronização da Organização Mundial de Saúde eOrganização Mundial de Saúde e 
do Ministério da Saúde do Brasil16. O diagnóstico da espécie e a O diagnóstico da espécie e aO diagnóstico da espécie e a 
quantificação da parasitemia foram realizados por dois técnicos 
com reconhecida experiência no diagnóstico microscópico de 
malária, através da contagem do número de parasitas, em campos 
de grande aumento, por 100 leucócitos. A seguir, a densidade 
parasitária era convertida para mm3 de sangue, utilizando a 
leucometria de cada paciente, obtida a partir de hemograma 
automatizado.
Extração do DNA. O DNA genômico plasmodial foi extraído 
de amostras de sangue total, coletadas destes pacientes. Para a 
extração do DNA parasitário, foi utilizado o Kit QIAamp DNA Blood 
Mini Kit (QIAGEN Cat. n° 51106), seguindo as especificações do 
fabricante e o método que emprega o Chelex. O DNA genômico 
plasmodial foi armazenado em -20º C até a realização da PCR.
Amplificação do DNA. A PCR foirealizada conforme técnica 
utilizada na FMT-AM, desde 1999, com amplificação de uma amplificação de uma 
região específica do DNA, utilizando-se iniciadores (primers) 
pré-desenhados e descritos por Snounou e cols25, objetivando a 
amplificação de regiões do gene codificante para a subunidade 
menor do RNA ribossomal do Plasmodium (ssurRNA). O método 
consiste em uma PCR aninhada (nested-PCR), com primers 
gênero-específicos na reação primária, e espécie-específicos na 
reação secundária (Tabela 1). As amplificações foram realizadas 
em termociclador Eppendorf-Master Cycler Gradient, com total 
de 30 ciclos, com as seguintes temperaturas: desnaturação: 
95°C/5′; anelamento: 55°C/2′; e extensão: 72°C/2′.
Tabela 1 - Seqüência de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para 
o diagnóstico molecular da malária.
Seqüência de oligonucleotídeos iniciadores Segmento ssurRNA (pb)
Plu5 – 5’CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC 3’ 1.200
Plu6 – 5’ TTAAAATTGTTGCAGTTAAAA 3’ 
Fal1 – 5’TTAAACTGGTTTGGGAAAACCAAATATATT 3’ 205
Fal2 – 5’ACACAATGAACTCAATCATGACTACCCGTC 3’ 
Viv1 – 5’CGCTTCTAGCTTAATCCACATAACTGATAC 3’ 120
Viv2 – 5’ACTTCCAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCCTTA 3’ 
Mal1 – 5’ATAACATAGTTGTACGTTAAGAATAACCGC 3’ 144
Mal2 – 5’AAAATTCCCATGCATAAAAAATTATACAAA 3’ 
Plu: Plasmodium sp, Fal: Plasmodium falciparum, Viv: Plasmodium vivax, 
Mal: Plasmodium malariae, pb: pares de bases
Análise de amplicons. Após a amplificação, o produto da 
PCR foi aplicado em gel de agarose 2%, corado com brometo de 
etídeo (10µg/µL), e submetido à eletroforese com tampão TEB 
1x. A observação dos segmentos de DNA amplificados foi feita 
em transiluminador, sob luz ultravioleta, e registrado em sistema 
digital para documentação de gel.
Análise dos resultados. Foram calculadas a co-positividade 
(equivalente à sensibilidade) e a co-negatividade (equivalente à 
especificidade) entre os testes, além da avaliação da concordância, pelo 
coeficiente kappa. A diferença entre médias de densidade parasitária 
foi estimada pelo teste não-paramétrico de Mann-Whitney.
RESULTADOS
A positividade global para infecção malárica à gota espessa foi 
35,7%. Pela PCR, esta positividade foi 68,3%. Os resultados de gota 
espessa e PCR estão discriminados na Tabela 2. A ocorrência de 
infecção mista (Plasmodium falciparum + Plasmodium vivax) 
foi 1,1% (4/344) pela gota espessa e 14,8% (51/344) pela PCR. 
Na Figura 1A, observa-se um campo de grande aumento (1.000x) 
de gota espessa de paciente com malária mista, evidenciada 
pela presença de gametócitos de Plasmodium falciparum e 
trofozoítos amebóides (formas irregulares) de Plasmodium 
vivax. Em outra amostra, cuja gota espessa foi positiva 
apenas para Plasmodium vivax, o gel de eletroforese da PCR 
(Figura 1B) confirmou o diagnóstico de infecção mista 
(colunas 4 e 5). A PCR, portanto, detectou 13,4 vezes mais casos 
de infecção mista, em comparação com a gota espessa. Nenhum 
caso de malária por Plasmodium malariae foi diagnosticado 
pela gota espessa ou pela PCR. Comparando gota espessa 
e PCR na detecção de Plasmodium falciparum, observou-se 
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co-positividade de 96,7%, co-negatividade de 62,2% e coeficiente 
kappa de 0,44. Para Plasmodium vivax, co-positividade de 
100%, co-negatividade de 78,1% e coeficiente kappa de 0,56. 
Na detecção da malária mista, co-positividade de 100%, co-
negatividade de 84,9% e coeficiente kappa de 0,26. 
Nos casos em que a PCR detectou infecção mista, quando 
o paciente apresentava gota espessa positiva apenas para 
Plasmodium vivax, a média da parasitemia (à gota espessa) 
foi semelhante à média dos casos com infecção exclusiva por 
Tabela 2 - Descrição do diagnóstico microscópico pela gota espessa e diagnóstico molecular pela nested-PCR.
 Gota espessa
 P.f. P.v. P.f. + P.v. negativa total
PCR no % no % no % no % no %
P.f. 59 79,7 0 0,0 0 0,0 65 29,4 124 36,0
P.v. 0 0,0 30 66,7 0 0,0 30 13,6 60 17,5
P.f.+P.v. 13 17,6 15 33,3 4 100,0 19 8,6 51 14,8
negativa 2 2,7 0 0,0 0 0,0 107 48,4 109 31,7
Total 74 100,0 45 100,0 4 100,0 221 100,0 344 100,0
P.f.: Plasmodium falciparum, P.v.: Plasmodium vivax, PCR: reação em cadeia da polimerase.
Plasmodium vivax, à PCR (3.555 parasitas/mm3 x 3.881 
parasitas/mm3; teste de Mann-Whitney, p=0,23).
DISCUSSÃO
A gota espessa é um método sensível capaz de detectar 0,001% 
de parasitemia, ou seja, acima de 1 parasita/µL de sangue31. 
Contudo, o método torna-se pouco sensível quando os parasitas 
estão presentes em número muito reduzido (< 1/µL de sangue) 
ou quando o indivíduo está infectado por mais de uma espécie de 
plasmódio. Inúmeros estudos têm relatado a maior sensibilidade 
da PCR na detecção de baixas parasitemias3 4 19.
Sabe-se que a ocorrência de infecções por mais de uma 
espécie de plasmódio pode ser ainda maior14. Estudos realizados 
com PCR na Tailândia26, Venezuela17 e Brasil5 demonstraram 
a ocorrência de infecção mista em proporções acima das 
evidenciadas à gota espessa.
Estudo realizado na Venezuela demonstrou que 29% das 
infecções diagnosticadas à gota espessa como Plasmodium vivax, 
quando analisadas pela PCR, foram identificadas como infecções 
mistas por Plasmodium vivax e Plasmodium falciparum17. No Irã, 
estudo recente também demonstrou alta freqüência de infecções 
mistas não-identificadas à gota espessa7. Aproximadamente um 
terço das amostras positivas para Plasmodium vivax, à gota 
espessa, na nossa casuística, foram positivas para ambas espécies 
(Plasmodium falciparum/Plasmodium vivax) à PCR. A validade 
externa dos resultados encontrados, entretanto, é baixa, pois a 
freqüência de infecções mistas depende em grande parte das 
condições epidemiológicas de cada área endêmica e da época 
em que o estudo foi realizado.
A FMT-AM é uma das unidades de diagnóstico de malária de 
Manaus, tendo notificado em média 35% dos casos de malária do 
município, nos últimos 10 anos. Em 2003, a instituição registrou 
30.017 casos de malária, sendo 125 (0,41%) de infecção mista. 
Se utilizarmos a PCR como padrão-ouro para o diagnóstico da 
infecção mista, de acordo com os resultados apresentados neste 
estudo, estimar-se-ia uma freqüência de infecção mista de 5,3% 
neste centro da Amazônia Ocidental Brasileira. Considerando 
que os resultados apresentados são oriundos de uma unidade de 
referência para o diagnóstico da malária no Estado do Amazonas, 
é possível que a quantidade de infecções mistas seja ainda mais 
sub-notificada na rede descentralizada de diagnóstico.
É necessário, entretanto, questionar se os parasitas detectados 
pela PCR são da fato implicados no quadro clínico agudo do 
Figura 1B - Gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo (10μg/μL), 
evidenciando infecção mista (P.f./P.v.) após reação de nested-PCR.
PM: peso molecular; 1: Infecçao mista (Pf+Pv), 2: controle positivo 
de Plasmodium vivax (Sal I); 3: controle negativo; 4: amostra positiva 
para Plasmodium vivax; 5: controle positivo de Plasmodium falciparum (W2); 
6) Diagnóstico molecular negativo, 7) amostra positiva para Plasmodium 
falciparum, pb: pares de bases. (W2 e Sal I – amostras controle da 
Indochina e El salvador respectivamente, fonte: MR4).
Figura 1A - Lâmina de gota espessa desemoglobinizada com azul 
de metileno, e corada com Giemsa (1.000x de aumento), utilizada 
na rotina de diagnóstico de malária. A infecção mista (Plasmodium 
falciparum/Plasmodium vivax) é evidenciada pela observação de gametócitos 
de Plasmodium falciparum (seta fina) e formas irregulares de Plasmodium 
vivax (seta grossa).
384
paciente. Em função dos estudos que demonstram ocorrência 
de até 49,5% de portadores assintomáticos de plasmódio em 
Rondônia1, existe a possibilidade de que estesportadores crônicos 
de uma espécie se infectem por outra espécie responsável pelos 
sintomas clínicos, já que não há proteção clínica cruzada conferida 
por espécies diferentes. Observou-se também em Rondônia seis 
vezes mais casos de infecção mista à PCR, em relação à gota 
espessa, tendo sido esta freqüência menor em outra localidade 
com menos portadores assintomáticos de plasmódio1.
A PCR detectou 10% de infecções causadas pelo Plasmodium 
malariae, não identificadas pela microscopia, também em 
Rondônia, o que foi diferente de nossos resultados5. A ocorrência 
da infecção por esta espécie, em Mato Grosso, chegou a 11,9%, 
por PCR22. É possível que a distribuição desta espécie não seja 
homogênea em toda a Amazônia Brasileira.
A evidência de que amostras com infecção mista à PCR não 
apresentaram maior densidade parasitária em comparação às 
amostras com monoinfecção reforça a idéia de que nem sempre 
as gotas espessas positivas para Plasmodium vivax, com alta 
parasitemia devem ser interpretadas sistematicamente como 
lâminas de infecção mista, como orientado no passado aos 
microscopistas de áreas endêmicas. 
A padronização de um protocolo único de PCR é um 
primeiro passo na tentativa de se avaliar o desempenho desta 
ferramenta da biologia molecular para o diagnóstico da malária, 
permitindo a comparação dos resultados obtidos em diferentes 
áreas endêmicas.
A realização da técnica com amostra de sangue total ou com 
amostra de sangue total em papel de filtro parece não interferir 
de maneira importante nos resultados, sendo que os trabalhos de 
campo, em geral, se beneficiam da coleta da amostra em papel 
de filtro, pela simplicidade de armazenamento e transporte até o 
laboratório onde o exame será realizado23.
Mais recentemente, a técnica de PCR em tempo real mostrou 
poder contribuir não apenas para diminuir as chances de 
contaminação das amostras, mas também para diminuir os custos 
e o tempo para a obtenção dos resultados9.
A alta co-positividade da PCR com a gota espessa na detecção de 
infecção malárica reforça sua utilidade em estudos epidemiológicos 
de prevalência, estudos de eficácia terapêutica e vacinal, detecção 
de portadores assintomáticos de plasmódio e na avaliação de novos 
métodos diagnósticos para malária10 15 21. Em bancos de sangue, o 
emprego da PCR pode ser de suma importância para o controle da 
malária transfusional8. Finalmente, o uso da PCR em unidades de 
referência pode ter alguma utilidade na avaliação do desempenho 
de microscopistas considerados experientes6.
A busca de novas alternativas diagnósticas para a malária é 
uma das metas do Programa Nacional de Controle da Malária 
(PNCM) do Ministério da Saúde, mas é preciso cautela ao escolher 
a PCR como teste padrão-ouro na comparação com outros testes 
diagnósticos da doença clínica, já que amplificando DNA, a PCR 
pode diagnosticar, p. ex., a presença apenas de formas sexuadas 
(gametócitos), não se prestando, portanto, para o diagnóstico 
exclusivo das formas consideradas patogênicas.
Os resultados apresentados sugerem que as infecções mistas 
na Amazônia Brasileira podem estar subestimadas e que a PCR 
pode ser uma importante ferramenta de diagnóstico da infecção 
pelo plasmódio, especialmente em condições nas quais a gota 
espessa apresenta pior desempenho. Não foram identificadas 
infecções por Plasmodium malariae nesta amostra estudada, 
em Manaus.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Programa de Pós-Graduação em 
Doenças Tropicais e Infecciosas da Universidade do Estado do 
Amazonas, aos técnicos da Gerência de Malária da Fundação 
de Medicina Tropical do Amazonas, especialmente ao Sr. José 
Eckner Lessa, Sr. Jubal Gonzaga Simões, pela revisão das gotas 
espessas, e à Sra. Raimunda Ericilda Soares de Araújo, pela coleta 
de amostras e extração de DNA.
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