RELATORIOS DE AULA PRATICA DE MICROBIOLOGIA GERAL

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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
BACHARELADO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS
LUCAS DALAQUA RIBEIRO
RELATORIOS DE MICROBIOLOGIA DAS AULAS PRATICAS 1 A 6
FRANCISCO BELTRÃO
2017
LUCAS DALAQUA RIBEIRO 
AULA 1: APRESENTAÇÃO DO LABORATÓRIO 
AULA 2: PRESENÇA DE MICROORGANISMOS NO AMBIENTE
AULA 3: MÉTODO DE ISOLAMENTO ATRAVÉS DE ESTRIAS
AULA 4: COLORAÇÃO DE GRAM.
AULA 5: PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA E ESTERILIZAÇÃO EM AUTOCLAVE 
AULA 6: CONTAGEM ATRAVÉS DE PLACA COM INOCULO DE ALIMENTOS 
Relatório de aula pratica da matéria de microbiologia, tendo como foco principal obter uma nota parcial na disciplina. Engenharia de Alimentos.
Prof. Dr Eder Santos 
FRANCISCO BELTRÃO
2017
INTRODUÇÃO:
Introdução 1:
Em um laboratório de microbiologia, as condições de trabalho quanto aos materiais, equipamentos e, principalmente, a limpeza do local devem ter seus cuidados redobrados porque é neste espaço que se manipulam muitos agentes biológicos (microrganismos), os principais tipos de contaminações que ocorrem são causados pela falta de assepsia, por isso seguir as normas do laboratório é essencial para obter-se o resultado desejado.
Introdução 2: 
Segundo Vermelho et.al (2006, p.1) “os microrganismos são definidos, em princípios, como seres microscópicos, individualmente invisíveis a olho nu. Apesar de ser uma visão bastante simplificada, pode-se dizer que, de maneira geral, esta é uma definição correta”. 
Além de ter estruturas bem organizadas são capazes de crescer e se reproduzir através de sua alta capacidade de se adaptar a ambientes extremos. São classificados de acordo com sua organização celular e estrutural, em procariotos e eucariotos.
Estes pequenos seres normalmente são vistos pela sociedade como algo ruim, carregando vírus de doenças contagiosas e relacionados a deterioração dos alimentos, mas a ciência a cada dia mostra o quão benéfico eles também podem ser, como, por exemplo, alguns deles realizarem o processo da fotossíntese, produzindo, dessa forma, oxigênio para seres humanos e alimento para eles
Segundo Madigan (2004, p. 96) “uma característica chave dos microrganismos corresponde à sua capacidade de realizar reações químicas e de organizar as moléculas em estruturas especificas. ” 
Através de anos de evolução os microrganismos estão presente em todos os ambientes do planeta e até áreas extremas de temperatura, a maioria está presente na nossa vida cotidiana.
Introdução 3:
A necessidade de se obter microrganismos é de extrema importância para todas as áreas de conhecimento, normalmente ao se trabalhar em laboratório acontece eventuais contaminações em etapas, e pode acontecer de crescer mais de uma espécie de microrganismo, e para conseguir isolar um determinado microrganismo são utilizados técnicas de isolamentos.
Segundo Pelczar (2009, p.76) “Ao determinar as características de um microrganismo, ele deve estar em cultura pura, em que todas as células na população são idênticas no sentido de que elas se originaram de uma mesma célula parental. Os microrganismos na natureza normalmente existem em culturas mistas, com muitas espécies diferentes ocupando o mesmo ambiente. Portanto, o primeiro passo é isolar as diferentes espécies contidas em um espécime. ”
Introdução 4: 
“Dos mais diferentes microrganismos existentes, quando colocados sobre a luz de um microscópio óptico padrão, possuem aparência quase incolor, por isso, é necessário realizar um procedimento para melhor visualização chamado de coloração. Esse processo consiste em corar um microrganismo enfatizando algumas partes de sua estrutura” (CASE, FUNKE, TORTORA, 2012).
Para identificar uma bactéria em laboratório é utilizado um método desenvolvido por Christian Gram - atribuída como Coloração de Gram- usando dois corantes em um mesmo processo, possibilitando dividir as bactérias em dois outros grupos, as bactérias gram-positivas absorvem a cor do primeiro corante (cristal violeta), já as gram-negativas absorvem a cor do segundo corante (safranina).
Introdução 5: 
Para o estudo de microrganismos em laboratório deve se preparar um cultivo para que haja crescimento, existem várias maneiras de fazer um cultivo como meios de culturas sólidos ou líquidos, em placas de Petri ou em tubos de ensaio, além disso alguns microrganismos necessitam de meios com nutrientes específicos para seu crescimento. 
Segundo Madigan (2004. p.100) “existem duas grandes classes de meios de cultura utilizados em microbiologia: os quimicamente definidos e os indefinidos (complexos). Os meios quimicamente definidos são preparados pela adição de quantidades precisas de compostos químicos inorgânicos ou orgânicos altamente purificados a uma determinada quantidade de água destilada”. Já os meios complexos não se têm a definição completa dos compostos adicionados, então a limitação do meio complexo é a perda do controle em relação a composição dos nutrientes.
OBJETIVO GERAL:
Objetivo geral 1: 
Demostrar como utilizar o laboratório de microbiologia seguindo as normas de segurança.
Aprender o procedimento correto de lavagem das mãos.
Apresentar os materiais que serão utilizados durante as aulas.
Objetivo geral 2:
Verificar a presença dos microrganismos em nosso meio.
Mostrar que os microrganismos estão no ar que respiramos, nas nossas mãos e cabelos.
Objetivo geral 3:
Isolar um determinado microrganismo através do método de estrias, para a utilização do mesmo.
Objetivo geral 4:
Identificar microrganismos Gram positivos e negativos, através da técnica de coloração de Gram.
Objetivo geral 5:
Preparar meios de cultura para que os microrganismos possam ser inoculados.
Esterilizar materiais utilizando o calor úmido da autoclave.
Objetivo geral 6:
Realizar uma diluição seriada e inocular em placa de Petri uma amostra de alimento, para que cresça microrganismo para realizar uma contagem de colônia.
PROCEDIMENTOS:
Procedimentos gerais aula 1:
Após a entrada na sala de aula, foi mostrado pelo professor o procedimento correto de lavagem das mãos seguindo as seguintes etapas:
Molhar a mão e aplicar detergente.
Lavar a mão e pulso não importando a ordem: Entre os dedos, palma 
 Da mão, unhas, lateral da mão e pulso. O procedimento deve ser feito
Com calma e corretamente.
Enxaguar com água corrente.
Enxugar com papel absorvente.
Aplicar álcool 70 repetindo o método de lavagem das mãos.
Deixar o álcool secar naturalmente.
Depois do procedimento de lavagem das mãos, foram apresentados os equipamentos do laboratório.
Ante-sala, onde se deixa tudo que possa contaminar ou ser contaminado tais como mochilas, casacos, celulares, alimentos e etc.
Sala de bactérias, sala com estufa bacteriológica, câmara de fluxo laminado e espectrofotômetro.
Sala de fungos, local com câmara de fluxo laminado para manipulação de microrganismos filamentosos.
Laboratório central para realizar práticas de ensino e pesquisa, com os determinados equipamentos: 
Pipetador: utilizado para realizar medidas precisas de volumes.
Tubos de ensaio: utilizado para realizar diluiçoes, e cultivar microrganismos.
Placas de Petri: utilizada para cultivar microrganismos em e meio solido.
Lâminas e lamínulas: utilizado para realizar o exame de microrganismos em microscópio.
Alça e agulha de platina: utilizada para semear microrganismos em meio liquido e solido.
Alça de drigalski: utilizada para realizar a distribuição uniforme de uma cultura liquida em meio solido.
Bico de Bunsen: utilizado como fonte de calor para flambagem e outros processos.
Autoclave: utilizado para esterilizar matérias.
Câmara de fluxo laminar: utilizado para que não haja contaminação.
Estufas: utilizadas para que culturas cresçam em temperaturas ideias.
pHmetro: utilizado para medir ou ajustar o pH do meio de cultura.
Microscópio: utilizado para analise de células microbianas.
Contador de colônias: utilizado para fazer contagem de microrganismosem placa de Petri.
Balança analítica: utilizada para pesar todo tipo de meios de cultura e reagentes.
Geladeiras: utilizadas para guardar os microrganismos e meios de cultura.
Procedimentos gerais aula 2:
Foi proposto pelo professor que fosse cada grupo utilizasse 5 placas de Petri com Agar nutriente para realizar os seguintes experimentos:
Expor a primeira placa em local com corrente de ar de deixar aberta por 15 minutos;
Falar sobre a segunda placa e fechar em seguida
Mexer o cabelo sobre a terceira, deixar um fio e fechar em seguida 
Dividir a quarta placa em três partes, com um swab mergulhar em condições assépticas em solução salina, e passar sobre uma das mãos, após isso inocular em uma das partes da placa, lavar a mão e fazer o mesmo processo, depois passar álcool 70% e fazer o mesmo processo.
A quinta placa foi usada como controle fechado 
Após isso as placas foram guardadas em temperatura ambiente.
Procedimentos gerais 3:
Utilizando as placas da aula anterior foi solicitado realizar um isolamento por estrias de três colônias diferentes.
Primeiramente com os materiais já prontos, nos dirigimos a câmara de fluxo laminado para realizar o isolamento.
Seguindo os seguintes passos:
Ligar o bico de Bunsen 
Flambar a alça de platina e esfria-la 
Abrir a placa de Petri e encostar a placa em uma colônia 
Abrir uma placa estéril e fazer as estrias 
Fechar a placa e flambar a alça novamente 
Fazer as estrias novamente 
Fechar a placa e flambar a alça novamente 
Fazer as últimas estrias 
Fechar a placa e passar plástico filme 
Foi realizado esses passos em três colônias diferentes, e colocado em estufa a temperatura ambiente para crescer.
Procedimentos gerais 4:
Utilizando os microrganismos isolados da aula passada, foi solicitado corar os microrganismos para dividi-los em dois grupos diferentes os Gram-negativos e os Gram-positivos. 
O esfregaço deste experimento foi feito em uma lâmina comum para utilização em Microscópio óptico.
Seguindo os seguintes passos foi realizado o esfregaço:
Acender o bico de Bunsen 
Flambar a alça de platina
Deixar a lamina que sera utilizada perto do bico de bunsen 
Com uma mão segurando a alça, utilizar a outra para pegar o tubo de
Ensaio contendo o microrganismo.
Flambar a borda do tubo aberto e inserir a pinça.
Espalhar bem a colônia pela lâmina e deixar perto da chama para
secar.
Flambar novamente a borda do tubo e fechar.
Pegar a lamina e passar no bico para fixar bem.
Após feito o esfregaço foi iniciado a coloração de Gram seguindo os seguintes passos:
Preencher a parte do esfregaço com corante Cristal violeta. Após 1 minuto lavar com água destilada.
Cobrir com a solução de Lugol para fixar a cor, e lavar com agua destilada.
Lavar com álcool até que saia o corante da lamina. Após isso lavar novamente com agua destilada.
Cobrir com o corante fucsina e esperar 30 segundos. Enxaguar com
água destilada até que não reste corante na lâmina.
Foi secado as laminas com papel absorvente (papel toalha), e levado para o microscópio, no início foi necessário zerar o microscópio, e abrir a pinça para inserir a lamina.
Começamos com a lente 4x, e ajustamos no botão macroscópico, após ajustar o foco, após fazer o mesmo procedimento com as lentes 10x e 40x, foi adicionado óleo de imersão para utilizar a lente 100x, para observar a morfologia e coloração.
Os microrganismos apresentados eram de morfologia bastonetes, cocos e espirilium, todos Gram positivos.
Procedimentos gerais 5:
Para que haja crescimento de microrganismos devem ser preparados meio de culturas que forneceram os nutrientes necessários para seu crescimento.
Foi solicitado o preparo de meio quimicamente conhecido.
Primeiro pesou-se os compostos nutriente e Agar, após isso foi adicionado um pouco de água destilada, e medido o pH e observado se estava correto, completou se com água destilada e levou-se parar embalar com papel Kraft e fita adesiva como mostrado na fotografia 1. 
Fotografia 1: material embalado com papel Kraft.
Fonte: autoria própria.
Após embalado, foi aberto a autoclave, verificado o nível e a cor da água, retirou-se os compartimentos, colocou-se os materiais a ser esterilizados, fechou-se as manivelas uma ao contrário da outra e girou-se o botão para o máximo, após isso foi esperado sair vapor pela válvula de ar, após fechou-se a mesma e após o ponteiro do medidor de temperatura chegar a 121°c e 1.0 atm. foi mudado o botão para médio e contado 15 minutos. 
Após os 15 minutos foi virado o botão para desligar, e aberto a válvula de ar para liberar o vapor, com a autoclave sem vapor foi aberto as manivelas e retirado o material, como mostrado na fotografia 2.
Fotografia 2: materiais saindo da autoclave.
Fonte: autoria própria.
Após retirado da bandeja da autoclave o material foi deixado na estufa em temperatura de 60°c. 
Procedimento geral 6:
Foi solicitado pelo professor que cada grupo levasse para a aula, uma amostra de alimento para preparar uma diluição seriada para fazer contagem.
Primeiramente foi pesado 1g da amostra de biscoito recheado, e inserido em um tubo contendo 9ml de solução salina diluindo assim para 1:10, após isso retirou-se 1ml do tubo 1:10 e inseriu-se no tubo dois contendo 9ml diluindo assim 1:100, foi realizado o mesmo procedimento nos próximos quatro tubos obtendo assim as diluições 1:1000, 1:10000, 1:100000, 1:1000000.
Posteriormente foi realizado o plaqueamento das diluições, da seguinte forma, com a pipetadora automática pipetou-se 1ml da diluição 1:10, e inoculou na placa de Petri com meio Agar nutriente, e foi repetido o processo com as outras 5 diluições.
Ao terminar o procedimento as placas foram deixadas na estufa em temperatura ambiente para crescimento de colônias.
RESULTADOS: 
Resultado 2: 
Após 7 dias pode-se observar o crescimento de colônias variadas de fungos e bactérias nas placas inoculadas.
Como observa-se na fotografia 3, houve crescimento de diferentes fungos e bactérias vivendo no mesmo ambiente.
Fotografia: diversidade de microrganismos no ambiente 
Fonte: autoria própria.
Notou-se que mesmo a placa de Petri em controle fechado e bico de Bunsen, houve crescimento de fungo, confirmando assim que a presença de microrganismos em todo lugar.
Resultados 3:
Após 7 dias observou-se que houve isolamento de microrganismos, porem ocorreu contaminações em algumas placas mostrando assim que a manipulação ocorreu de forma errada.
Resultados 4:
Após a coloração de Gram, é possível definir a bactéria em dois grupos: Gram positiva ou Gram negativa.
No experimento observou uma bactéria Gram positiva e de morfologia bacilos, como observa-se na fotografia 4.
Fotografia 4: bactéria gram positiva.
Fonte: autoria própria
Utilizando o microscópio ótico em lente 100x com óleo de imersão para que o índice de refração esteja correto conseguiu-se observar a morfologia das bactérias.
Resultados 5:
O calor úmido da autoclave de 121°C e pressão de 1atm, é suficiente para matar os microrganismos, assim todo material que é colocado lá, sai sem nenhuma forma de vida.
Resultados 6:
Após 24h pode-se observar o crescimento de bactérias, as placas com diluição: 1:10, 1:100, 1:1000 e 1:10000. Não permitiram contagem pois houve muito crescimento de colônias. 
Porem a placa com diluição 1:100000 houve crescimento de aproximadamente 60 colônias, como percebe-se na fotografia 5.
Fotografia 5: placa com contagem.
Fonte: autoria própria.
CONCLUSÃO:
Conclusão 1:
Dos diferentes tipos de materiais, vidrarias e equipamentos é muito importante o cuidado para não estragar, mas também por ser um local de contato com muitos microrganismos. Esses, que não são vistos a olho nu, mas que no laboratório são manuseados e podem se proliferar facilmente. Por isso é necessário, a esterilização e acondicionamento correto de tudo que foi utilizado.
Conclusão 2:
Os microrganismos estão presentes em todos os ambientes e são de grande importânciarealizando o ciclo do carbono e nitrogênio, e também trabalhando em conjunto com nossa flora intestinal auxiliando no seu funcionamento mantendo seu equilíbrio.
Além dessas importâncias, o estudo de microrganismos em laboratorio tem objetivos de engajamentos diferentes como social, na prevenção de doenças e melhoramento na produção rendendo assim grande efeito econômico.
Conclusão 3: 
Para se isolar um microrganismo a técnica de estrias é a mais utilizada, porem o cuidado para que não haja contaminação deve ser grande. O isolamento é o começo para se realizar outros experimentos.
Conclusão 4:
A Coloração de Gram é um método importante, pois é possível diferenciar grupos de bactérias, porém, se não for feito corretamente pode resultar em uma análise do material equivocada ou não resultar em uma análise considerável. Qualquer passo, desde o esfregaço até a coloração, pode mudar a visualização no microscópio óptico. Por esse método é possível analisar ainda, a estrutura da bactéria, cocus ou bacilo, por exemplo, se vista de um microscópio.
Conclusão 5: 
Existem vários tipos de controle microbiano em superfície como a esterilização em autoclave, esterilização comercial, desinfecção, sanitização e outros. Porem a esterilização em autoclave é a mais eficiente pois destrói até os endósporos, assim o material saí completamente estéril.
Conclusão 6:
Ficou evidente que quanto mais uma amostra é diluída, menor a densidade celular e menor as chances de formação de colônias, sejam elas fúngicas ou bacterianas. O número de colônias por diluição tem influência direta do tempo para observação, uma vez que agentes fúngicos e bacterianos têm crescimento rápido, ou seja, quanto maior o tempo desde a inoculação, maior será o crescimento e sobreposição de colônias. 
REFERENCIAS
CASE, Christine L. FUNKE, Berdell R. TORTORA, Gerard J. Microbiologia. 10 ed.
Porto Alegre: Artmed, 2012.
MANDIGAN, M. T., MARTINHO, J.M. & PARKER, J. Microbiologia de Brock..14e-Porto Alegre: Arthmed, 2016.