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Roteiros Microbiologia e Micologia Clínica Orientações gerais sobre as aulas práticas/relatório e atividades obrigatórias � Leia atentamente todos os roteiros. � As normas para entrada nos laboratórios devem ser respeitadas; caso contrário, o aluno não poderá participar das aulas (leia a seguir as normas de biossegurança). � Para elaboração do relatório, leia com atenção o manual de orientações de aulas práticas disponível no AVA. � O relatório deve ser elaborado segundo as normas da ABNT. � O prazo para postagem do relatório é de 7 dias a contar da última aula prática da disciplina, sendo realizada uma única postagem. � Observar se o arquivo do relatório foi corretamente anexado, se não está corrompido, em branco, se está disponível e se corresponde à disciplina correta. Relatórios com tais erros/falhas não serão considerados para a correção e será atribuída nota zero. � Do relatório fazem parte as atividades obrigatórias que só poderão ser anexadas e vistadas pelo professor responsável pela(s) aula(s) prática(s). � O aluno deve imprimir as folhas com as questões, responder no campo destinado e entregar ao docente para vistar durante a aula prática. � O professor responsável pela prática deve vistar preferencialmente as atividades sempre após o final do período de aula correspondente. � O professor não assinará folhas em branco sob nenhuma circunstância. � Folhas com assinaturas do docente rasuradas não serão aceitas. � Relatórios que não contarem com as atividades obrigatórias não serão validados. � O aluno deve anexar somente as atividades referentes às aulas práticas que participou, da mesma forma que deve descrever no relatório somente os procedimentos que participou. � O número de atividades obrigatórias varia de acordo com a carga horária de cada disciplina prática. � Serão confrontados o relatório e as questões entregues com a frequência registrada em sistema; por esse motivo, não deixar de registrar frequência no polo. A nota é proporcional à frequência registrada em sistema. � O relatório deve ser confeccionado na seguinte ordem: 1. capa; 2. atividades obrigatórias; 3. resultados e discussão; 4. referências. � Estão descritas na tabela a seguir as orientações para confecção de cada uma das etapas necessárias ao relatório. � Para maiores informações/orientações, consulte (AVA>disciplina>manual de orientações para a prática). Itens Critérios Pontuação Atividades obrigatórias � Respostas devem estar à caneta. � Não apresentar rasuras. � Vistadas pelo docente. � Anexar somente as atividades obrigatórias referen- tes aos roteiros de prática que realizou. 4,0 Resultados e discussão � Descrever os resultados por roteiro realizado, relacionando os achados à teoria e referenciando-os. � Anexar desenhos, fotos, diagramas, esquemas, tabelas, dentre outros recursos que melhor ilustrem e descrevam os resultados. 5,0 Elementos pré-textuais (capa) e pós-textuais (referências) � Apresentar capa conforme modelo disponibilizado, contendo nome, RA, polo de matrícula, polo de prática, data das aulas e nome do docente e disciplina. � Apresentar em ordem alfabética as referências uti- lizadas seguindo normas da ABNT. 1,0 Regras básicas de segurança no laboratório 1. Durante a aula prática, mantenha sempre atenção ao roteiro, tendo-o sempre próximo a você. Pode ser efetuada marcação com caneta sob cada item realizado do experimento de forma a não se perder durante a execução. 2. Leia sempre o roteiro antes de iniciar a prática e mesmo antes das explicações do professor. 3. Observe a localização do material e dos equipamentos de emergência (chuveiro, lava-olhos etc.). 4. Não abra qualquer recipiente antes de reconhecer seu conteúdo pelo rótulo. 5. Não pipete líquidos diretamente com a boca, use pipetas adequadas. 6. Não tente identificar um produto químico pelo odor ou pelo sabor. 7. Não deixe de utilizar os equipamentos de proteção. 8. Não adicione água aos ácidos, mas os ácidos à água. 9. Não trabalhe com sandálias, chinelos ou sapatos abertos e com salto no laboratório. 10. Sempre identifique o conteúdo presente nos frascos ou nos tubos utilizados no experimento com caneta para vidros. Isso facilita seu descarte adequado por parte dos responsáveis pelo laboratório. 11. Mantenha os solventes em recipientes adequados e devidamente tampados, bem como materiais inflamáveis longe de fontes de calor (bico de Bunsen). 12. Utilize a capela sempre que manipular reagentes ou solventes que liberem vapores. 13. Conheça as propriedades tóxicas das substâncias químicas antes de empregá-las pela primeira vez no laboratório. Caso tenha dúvidas, consulte o professor ou o técnico a respeito. 14. Se tiver cabelo longo, prenda-o ao realizar qualquer experiência no laboratório. Não se alimente e nem ingira líquidos nos laboratórios. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e micologia clínica Título da Aula: Quantificação bacteriana – contagem em placa AULA 1 ROTEIRO 1 Objetivo Nesta aula prática será utilizado o método de contagem em placa, que se baseia em três princípios: cada colônia é originada do crescimento e da multiplicação de uma única bactéria; o inóculo original é sempre homogêneo e não existem agregações de células. Como normalmente as populações bacterianas são muito grandes, devemos fazer diluições decimais seriadas. Procedimento (Parte 1 – esta aula será continuada em aula posterior) Diluição decimal seriada � Marcar tubos contendo 9 mL de salina estéril (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9). � Homogeneizar o tubo de cultura de Escherichia coli e, com pipeta estéril, transferir 1 mL para o tubo da salina marcado 10-1. � Homogeneizar o conteúdo do tubo 10-1, transferindo 1 mL para o tubo de salina marcado 10-2. � Repetir esse procedimento (diluições sucessivas) até o último tubo. Transferir 0,1 mL de cada diluição em uma placa de ágar MacConckey (cada) (como sugestão, usar 3 placas promovendo a semeadura de cada tubo em uma meia placa como no esquema a seguir): Levar as placas para estufa a 37 ºC (solicitar ao técnico que retire após período de incubação, embale em papel-filme e papel-kraft e mantenha em geladeira para visualização posterior). Materiais Quantidades Tubos contendo a cultura de Eschericha coli em caldo nutriente 1 por grupo Séries de tubos com 9 mL de salina estéril em cada um 6 por grupo Pipetas de 1 mL (automática) 1 por grupo *** Placas de Petri com ágar nutriente 6 por grupo Ponteiras de 1 mL 6 por grupo *** Se necessário podem ser feitas 3 por grupo e os alunos devem ser orientados a proceder conforme esquema anterior. Equipamentos Quantidades Alças bacteriológicas 1 por grupo Estufa 1 Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e micologia clínica Título da Aula: Antibiograma AULA 1 ROTEIRO 2 Objetivo O antibiograma se constitui da principal prova microbiológica. Essa prova direciona o tratamento antimicrobiano das infecções. Procedimento (Parte 1 – esta aula será continuada em aula posterior) 1. Preparar o inóculo em tubos de solução fisiológica estéril utilizando as colônias de Staphylococcus aureus segundo a escala de MacFarland. 2. Semear bactérias (por espalhamento) em ágar Müller Hünton (usando swab). 3. Colocar com pinça os discos de antibiograma sobre o meio. 4. Incubar por 24-48 horas. 5. Verificar o crescimento ou não de bactérias. 6. Medir o diâmetro dos halos de inibição em cada disco. Se igual ou superior a 2 centímetros (considerar sensível). Materiais Quantidades Ágar Müller Hünton 2 por grupo Discos de antibiograma (diversos) 1 por grupo Swab 2-3 por grupo Escala de MacFarland Bancada Alça de platina 1 por grupo Placa de ágar sangue contendo colônias crescidas de Staphylococcus aureus 1 porgrupo Tubos contendo 2 mL de solução fisiológica estéril 1 por grupo Equipamento Quantidade Estufa 37 °C 1 Atenção! Todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e ao descarte de microrganismos. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e micologia clínica Título da Aula: Provas bioquímicas AULA 2 ROTEIRO 1 Procedimento As provas bioquímicas são essenciais para o diagnóstico e a identificação das bactérias patológicas. A interpretação dos resultados dessas provas bioquímicas permite ao profissional identificar os microrganismos. Prova TSI Essa prova avalia em um só tubo a utilização de glicose e lactose pelas bactérias, também verifica a formação de h2S pelas bactérias. 1) Semear bactérias (bacilos gram negativos previamente semeados) por picada e por estrias na superfície do meio TSI. 2) Encubar por 24 horas. 3) Verificar os resultados no cilindro do tubo e na superfície do tubo. Cilindro ácido (amarelo) e rampa alcalina (vermelha), fermentação apenas da glicose. Cilindro ácido (amarelo) e rampa ácida (amarela), fermentação de lactose e glicose. Produção de gás: observa-se se houve fratura no meio. Verificação do uso da lactose 1) Semear bacilos gram negativos em ágar MacConkey. 2) Verificar a formação de colônias Pink (lactose positiva). 3) Encubar a 37 °C por 48 horas. Materiais Quantidades Ágar TSI 1 por grupo Ágar MacConkey 1 por grupo Alças bacteriológicas 1 por grupo Bacilos gram negativos pré-cultivados 1 por grupo Equipamento Quantidade Estufa 37 °C 1 Atenção! Todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e ao descarte de microrganismos. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e micologia clínica Título da Aula: Urocultura quantitativa e qualitativa AULA 2 ROTEIRO 2 Objetivo Aplicação da técnica de urocultura quantitativa e qualitativa. Materiais Quantidades Frasco contendo urina 1 por grupo Solução fisiológica estéril – tubos com 10 mL 2 por grupo Alças bacteriológicas 1 por grupo Bacilos gram negativos pré-cultivados 1 por grupo Pipeta calibrada de 0,1 mL 1 por grupo Ponteiras estéreis para pipetas de 0,1 mL 5 por grupo Corantes de gram 1 conjunto por bancada Lâminas de vidro 3-5 por grupo Placa de ágar MacConckey 2 por grupo Procedimento 1: Bacterioscopia de amostra centrifugada 1) Centrifugar cerca de 5 mL de urina a 2.500 rpm, durante 10 minutos. Desprezar o sobrenadante. 2) Com o sedimento, preparar esfregaço em lâmina de vidro usando pipeta e ponteira de 0,1 mL e corar pela técnica de gram. 3) Anotar os achados (presença de piócitos, células epiteliais de descamação, hemácias, diferentes tipos morfológicos de bactérias). Procedimento 2: Bacterioscopia de amostra não centrifugada 1) Homogeneizar o frasco de urina. 2) Retirar com pipeta e ponteira estéril 0,1 mL de amostra e dispensar sobre lâmina de vidro. 3) Corar pela técnica de gram. 4) Presença de 2 ou mais bactérias por campo em amostra não centrifugada indica contagem superior a 100.000 bactérias/mL de amostra e, portanto, sugestivo de infecção urinária. Procedimento 3: Cultura quantitativa e qualitativa 1) Diluir a urina 1/100 em solução fisiológica estéril, para isso use um tubo de ensaio estéril contendo 10 mL de solução fisiológica estéril, retire dele 0,1 mL da solução fisiológica e adicione 0,1 mL da amostra de urina homogeneizada. 2) Com pipeta estéril, retire 0,1 mL dessa diluição e dispense sobre a superfície de uma placa de Petri contendo ágar MacConckey. 3) Espalhar o inóculo com alça de Drigalski flambada e esfriada, de forma homogênea por toda a superfície (podendo fazer movimentos de “8”). 4) Identificar e incubar a 37 ºC por 18 a 24 horas. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e micologia clínica Título da Aula: Visualização de fungos filamentosos AULA 2 ROTEIRO 3 Objetivo Aprender a identificar a estrutura de fungos filamentosos. Materiais Quantidades Meio de cultura de ágar Sabouraud ou nutriente semeado anteriormente e contendo BOLOR **** 1 placa por grupo Lâminas e lamínulas de vidro 5-7 por grupo Microscópio 1 por grupo Corante azul de algodão (se não tiver, substituir por violeta genciana) Bancada Alça de platina 1 por grupo *** Como sugestão, semear placa com amostra de alimento ou deixar aberta em TA por 2 horas e manter em TA até a data da aula. Fazer de 1 semana a 10 dias antes da aula. Procedimento 1) Com alça de platina, remover parte da colônia de fungo filamentoso e espalhar sobre lâmina de vidro contendo 1 gota do corante. 2) Cobrir com lamínula. 3) Observar estruturas de conídeos, hifas septadas e cenocíticas em microscopia com aumento de 10 e 40 X. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e micologia clínica Título da Aula: Diagnóstico dos cocos Gram + AULA 3 ROTEIRO 1 Objetivo Os cocos gram positivos são um importante grupo de bactérias causadoras de patologias nos seres humanos. A identificação das principais bactérias desse grupo é de vital importância em laboratórios clínicos. Procedimento Verificação da morfologia das bactérias (lâminas pré-preparadas). Prova da catalase 1) Em uma lâmina, pingar uma gota de água oxigenada. 2) Remover uma colônia pré-semeada e adicionar à lâmina. 3) Homogeneizar e verificar a formação de bolhas (Staphylococcus sp) ou não (Streptococcus sp). Verificação de hemólise em ágar sangue 1) Em placas pré-semeadas com Estreptococos, solicitar ao aluno que verifique o tipo de hemólise (halo esverdeado, incolor e sem hemólise). Prova da coagulase 1) Em tubos contendo 0,5 mL de plasmacoagulase ou soro humano, inocular uma alçada da colônia de Staphylococcus aureus e levar para estufa a 37 °C, aguardar formação do coágulo após aproximadamente 2 horas. Materiais Quantidades Água oxigenada 100 mL Alças bacteriológicas 1 por grupo Lâminas 5 por grupo Placas de ágar sangue 1 por grupo Placas pré-semeadas com Staphylococcus e Streptococcus 1 por grupo Tubos com 0,5 mL de plasmacoagulase ou soro humano 1 por grupo Equipamento Quantidade Microscópio 1 por grupo Atenção! Todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e ao descarte de microrganismos. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e micologia clínica Título da Aula: Coloração de gram e revisão de morfologia bacteriana e de leveduras AULA 3 ROTEIRO 2 Objetivo A avaliação da morfologia microbiana é muito importante para a execução da maior parte dos exames microbiológicos. A coloração de gram também deve ser revisada dada sua grande importância no diagnóstico clínico das amostras microbiológicas. Materiais Quantidades Solução salina 10 mL (por grupo) Corantes para a coloração de gram 1 por grupo Cristal de violeta, lugol, álcool – acetona e safranina 1 por grupo Placas pré-cultivadas com S. aureus 1 por grupo Placas pré-cultivadas com E. coli 1 por grupo Placas pré-cultivadas com leveduras 1 por grupo Óleo de imersão 1 por grupo Equipamentos Quantidades Lâminas 5 por grupo Microscópios 1 por grupo Alças bacteriológicas 1 por grupo Estufa 37 °C 1 Técnica coloração de gram 1) Em uma lâmina, pingar uma gota de solução salina estéril. 2) Recolher uma colônia pré-cultivada com alça bacteriológica. 3) Colocar a colônia selecionada junto à lâmina e homogeneizar. 4) Fixar o esfregaço no calor. 5) Cobrir o esfregaço com cristal de violeta por 1 minuto. 6) Lavar o esfregaço com água corrente, removendo o excesso de corante. 7) Cobrir o esfregaço com lugol por 1 minuto. 8) Repetir o passo 6. 9) Descorar com álcool acetona até remover o excesso de corante. 10) Repetir o passo 6. 11) Cobrir o esfregaço com safranina por 30 segundos. 12)Lavar e secar. 13) Examinar ao microscópio (1000x). Atenção! Todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e ao descarte de microrganismos. Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e micologia clínica Título da Aula: Semeadura bacteriana AULA 4 ROTEIRO 1 Objetivo O procedimento de semeadura bacteriana é importante para a execução da maior parte dos exames microbiológicos. A aula também deve abordar a questão da seletividade dos meios de cultura. 1. Semeadura em meios sólidos 1.1 Semeadura em tubos de ensaio: esgotamento de alça: técnica utilizada para obtenção de crescimento bacteriano e/ou para a observação de propriedades bioquímicas da bactéria. A semeadura é, geralmente, feita da base do meio para a extremidade dele (pode também ser chamada de estriamento). A semeadura também pode ser realizada da base para a extremidade do meio, de forma uniforme. Essa técnica é realizada para que haja crescimento bacteriano, bem como podemos utilizá-la para observar funções metabólicas de algumas bactérias. Em picada: essa técnica de semeadura é utilizada para que se possa observar funções metabólicas de alguns microrganismos (bactérias) que são submetidas à análise microbiológica. 1.2 Semeadura em placas de Petri: o material a ser semeado deverá conter poucos microrganismos, porque o inóculo para o isolamento deve ser leve. Lembrar que cada colônia formada na superfície de um meio sólido é originada de um ou alguns microrganismos. Quanto maior o número, menor a possibilidade de isolamento e maior probabilidade de crescimento confluente. Quando o inóculo for obtido a partir de meio sólido (inóculo pesado), este poderá ser diluído em salina estéril ou ser utilizada a técnica de esgotamento adequada. Estrias múltiplas para isolamento: consistem em espalhar o material com o auxílio de uma alça bacteriológica, fazendo estrias sucessivas até o esgotamento do material, de modo a se obter um perfeito isolamento das bactérias existentes na amostra. Quando o material é muito denso, a alça deverá ser flambada. A semeadura poderá ser realizada em um sentido ou em vários, de acordo com a pessoa que realizará a técnica, lembrando- se sempre de que o objetivo principal dessa técnica de semeadura é a obtenção do isolamento bacteriano. Alternativamente, para se obter um tapete uniforme de crescimento microbiano ou colônias isoladas (após diluição), utiliza-se o método de “espalhamento” em placa. Consiste em espalhar o material (suspensão bacteriana na maioria das vezes) com o auxílio de um swab (para obtenção de tapete uniforme) ou alça de Drigalski (para obtenção de colônias isoladas após diluição), fazendo a semeadura por toda a superfície da placa de Petri a ser utilizada nessa técnica. Deve-se ter o cuidado para que toda a superfície da placa seja semeada, evitando regiões sem semeadura. Recomenda-se que faça o procedimento de semeadura com o swab em três direções distintas, com a alça em toda a superfície rodando a placa. Em profundidade ou incorporação: Pour-Plate – técnica que consiste em se adicionar 1 mL de uma suspensão bacteriana que esteja sendo estudada (analisada) a 20 mL de um meio de cultura fundido e resfriado, com posterior homogeneização com movimentos circulares. É utilizada por alguns microbiologistas para quantificar microrganismos. Técnica para semeadura em superfície (meios sólidos) � Retira-se uma alíquota microbiana (o inóculo) do tubo com a alça já flambada e fria. � Abre-se a placa, de modo que a tampa forme um chapéu com a placa. � Coloca-se o inóculo junto à parte superior da placa, procede-se então a técnica de semeadura escolhida. � A seguir, a alça deve ser flambada ao rubro esfriada e acondicionada no suporte apropriado, ou a alça de Drigalski ou o swab devem ser desprezados em recipiente apropriado a ser posteriormente esterilizado. � Depois de terminada a semeadura, fechar a placa e identificar, levando-a a seguir para incubação na estufa, com a tampa voltada para baixo. 1.3 Semeadura em meios líquidos Difusão: técnica que consiste em acrescentar microrganismos pela alça ou agulha de platina em meios líquidos. Tem como principal finalidade a observação de propriedades bioquímicas por testes microbiológicos, bem como poderá ser utilizada para o favorecimento do crescimento bacteriano, quando é realizada em meios que possibilitem o enriquecimento. Técnica para semeadura em meios líquidos � Segurar a alça com a mão direita, flambar primeiro na chama azul, depois na amarela. Esperar esfriar (a alça é flambada na posição vertical e deverá ficar atrás da chama para proteção do operador). � Retirar a rolha de algodão do tubo que contém o microrganismo a ser semeado ou repicado (que deverá estar na mão esquerda), utilizando-se o dedo mínimo da mão direita. A rolha deverá permanecer sendo segurada com o dedo mínimo até o final da operação. � Flambar a boca do tubo e retirar o inóculo com a alça fria; flambar novamente a boca do tubo e fechar. � Pegar o tubo onde se irá realizar a semeadura, retirar a rolha e flambar. � Semear o material, flambar a boca do tubo e fechar. � Esterilizar a alça, identificar o tubo semeado e levar para incubação em estufa. 1.4 Semeadura em meios semissólidos – em picada: essa técnica de semeadura é utilizada para que se possam observar funções metabólicas ou características físicas, como motilidade de alguns microrganismos que são submetidos à análise microbiológica. Técnica para semeadura em meios semissólidos � Retirar o microrganismo do meio sólido ou líquido com o auxílio de uma alça em agulha já flambada e fria. � Abrir o tubo que contém o meio semissólido e semear o microrganismo através de picada até mais ou menos 1/3 ou 1/2 do tubo. � Fechar o tubo, identificar e levar para incubação. � Flambar a agulha, deixar esfriar e colocar no suporte adequado. Materiais Quantidades Placas de Petri contendo meio de cultura ágar simples (ágar nutriente) 3 por grupo Tubos de ensaio contendo caldo simples esterilizado 3 por grupo Tubo de ensaio com 2 mL de cultura (BHI inoculado com S. aureus ou E. coli) 1 por grupo Placa de Petri de ágar Manitol ou MacConckey (com respectivamente S. aureus e/ou E. coli) 1 por grupo Tubo com ágar nutriente inclinado 1 por grupo Tubo com ágar MIO 1 por grupo Alça bacteriológica 1 por grupo Alça de Drigalski 1 por grupo Alça bacteriológica ponta agulha 1 por grupo Pipeta de vidro esterilizada (1 mL) 1 por grupo Swab de algodão 3 por grupo Procedimento Cada grupo deverá reproduzir as seguintes técnicas de semeadura: � Semeadura por estrias múltiplas. � Semeadura por espalhamento com swab de algodão e alça de Drigalski. � Semeadura em meio líquido com alça bacteriológica. � Semeadura por estrias em meio sólido em tubo. � Semeadura em picada em tubo com meio semissólido. Os materiais devem ser identificados e incubados a 37 °C, por 48h, em estufa bacteriológica. Interpretação dos resultados e discussão. Avaliar o crescimento microbiano nos diferentes meios de cultura e relacionar o tipo de crescimento à técnica de semeadura realizada. Descarte do material utilizado conforme normas internacionais de segurança. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e micologia clínica Título da Aula: Preparo de meio de cultura: meio sólido AULA 4 ROTEIRO 2 Objetivo Aprender sobre os cuidados no preparo e na esterilização de meios de cultura. Materiais Quantidades Meio de ágar nutriente, MacConckey, Sabouraud, Manitol (qualquer um que esteja disponível) Frasco sobre a bancada Placas de Petri estéreis (médias – com capacidade para 25 mL cada) 5 por grupo Balão volumétrico 1 por grupo Tripé e tela de amianto 1 conjunto por grupo Papel-kraft,fita de autoclave, algodão hidrofóbico, barbante qsp Balança de precisão Bancada Procedimento para o preparo de meios de cultura solidificados 1. Pesar a quantidade do meio de cultura desidratado indicado no rótulo do frasco, o suficiente para o preparo de 130 mL de meio. 2. Medir a quantidade de água destilada indicada no rótulo em uma proveta. 3. Em um balão volumétrico, dissolver o pó nos 100 mL de água destilada. 4. Deixar descansar por 10 minutos para que ocorra a hidratação do pó, facilitando a dissolução. 5. Aquecer o meio em uma chapa aquecedora até que ocorra a total dissolução do ágar, ou seja, quando o ágar “chorar” (as partículas de ágar escorrem pela parede do balão), o aquecimento deverá ser associado com agitação constante. 6. Esterilizar em autoclave o meio de cultura. 7. Fazer o plaqueamento do meio de cultura: Verter – uma pequena quantidade do meio de cultura em placas de Petri esterilizadas, ao redor do bico de Bunsen; deixar que ocorra a solidificação do meio. 8. Efetuar o controle de qualidade dos meios de cultura: colocar as placas de Petri com o meio de cultura em uma estufa a 37 °C. Após 24h, observar se houve o crescimento de alguma colônia. Se houve, é porque ocorreu contaminação desse meio e ele não está esterilizado, não podendo ser utilizado – deve-se descartá-lo. Se não houve o crescimento de nenhuma colônia é porque o meio está realmente esterilizado, podendo ser utilizado. 9. Os meios que passaram no teste de esterilização devem ser armazenados na geladeira para posterior uso. Instituto de Ciências da Saúde Disciplina: Microbiologia e micologia clínica Título da Aula: Discussão de casos clínicos AULA 4 ROTEIRO 3 Caso clínico 1 Paciente H.P.C., 42 anos, deu entrada no Hospital das Clínicas Serafim de Carvalho. A criança foi levada pela mãe ao consultório do pediatra em visita de rotina, conforme orientação anterior para acompanhamento de recorrência da infecção urinária. A única queixa apresentada foi de anorexia. O exame físico não revelou febre, irritabilidade ou dor à compressão vesical, mas um moderado atraso pôndero-estatural. A criança não era circuncidada e apresentava um discreto refluxo vesicouretral, como constatado em cistouretrografia miccional realizada anteriormente. Solicitou-se realização de hemograma, urinálise de 3 amostras e urocultura de 3 amostras. 1) Hemograma Eritrócitos 3.450.000/uL Hemoglobina 9,5 g/dL Volume globular 29,0% VCM 84,0 fl HCM 27,5% CHCM 32,5% Leucócitos 11.000/uL Bastonetes 11% Segmentados 35% Eosinófilos 03% Linfócitos 45% Monócitos 06% Plaquetas 340.000/uL 2) Urinálise 1ª amostra 2ª amostra 3ª amostra Aspecto Turva Turva Turva Cor Amarelo-claro Amarelo-claro Amarelo-claro pH 7,5 7,0 6,0 Proteínas + + + Glicose 0 0 0 Corpos cetônicos 0 0 0 Pigmentos biliares 0 0 0 Leuc. esterase 0 0 0 Hematúria 0 0 0 Nitritos Positivo Positivo Positivo Leucócitos 30/mm3 40/mm3 20/mm3 Cilindros Ausentes Ausentes Ausentes Hemácias Ausentes Ausentes Ausentes Cristais Fosf. Am. + Ausentes Ausentes Bactérias (Gram UNC) BGN 8/CGA CGP 10/CGA BGN 2/CGA BNV UNC = urina não centrifugada BGN = bacilos gram negativos CGP = cocos gram positivos CGA = campo de grande aumento ou 1000x BNV = bactérias não visualizadas 3) Urocultura Semeadura de 3 amostras de urina de saco coletor colhidas em dias consecutivos. A primeira amostra foi coletada em casa pela mãe e transportada rapidamente ao laboratório, em temperatura ambiente. As outras 2 amostras foram coletadas no laboratório, seguindo orientação de pediatra. Ver imagens 1, 2 e 3. Com base nos dados clínicos e laboratoriais, propomos as seguintes questões para discussão do caso: 1) Que interpretação e segmento você daria para cada urocultura? 2) Seria realmente necessário coletar 3 amostras de urina nesse caso? 3) Quais os cuidados necessários na coleta de amostras de urina de crianças usando o saco coletor para evitar contaminação? 4) Quais bactérias poderiam ser suspeitas na análise da morfologia colonial das 3 amostras (imagens 1 a 3)? 5) No caso de ser necessário realizar antibiograma, quais antibióticos deveriam ser testados? 6) Tendo em vista as colônias das imagens das placas 1, 2 e 3, em que é possível identificar colônias lactose negativas, qual a identificação da bactéria correspondente à colônia lactose negativa? 7) Qual prova bioquímica, dentre as analisadas anteriormente, poderia revelar resultado falso e em qual sistema de identificação? 8) Como você interpreta os resultados da coloração de gram das 3 amostras de urina não centrifugadas? 9) Por que é necessário um acompanhamento frequente, com repetição da urocultura a cada visita, em crianças assintomáticas, como é o caso desse paciente? 10) Existe alguma alteração significativa no eritrograma? 11) Como pode ser explicado o resultado da contagem diferencial? Nome:____________________________________ RA:_____________ Data:______/_____/_____ Atividade obrigatória 1 1-Descreva os cuidados na realização de um antibiograma, da seleção dos antibióticos à espessura do meio. 2- Qual a relevância clínica da contagem de colônias e como é feita a conversão para UFC/mL? Visto do docente: ___________________________ Nome:____________________________________ RA:_____________ Data:______/_____/_____ Atividade obrigatória 2 1-Descreva os cuidados na realização de uma urocultura. 2- Descreva sucintamente o princípio da técnica de TSI. Visto do docente: ___________________________ Nome:____________________________________ RA:_____________ Data:______/_____/_____ Atividade obrigatória 3 1-Descreva o princípio das provas de catalase e coagulase. 2- O que são leveduras em brotamento e a que se refere o termo pseudo-hifas? Visto do docente: ___________________________ Nome:____________________________________ RA:_____________ Data:______/_____/_____ Atividade obrigatória 4 1-Com relação ao caso clínico apresentado, o fato de o paciente ser circuncidado tem alguma relevância? Justifique. 2- Quando um microbiologista utiliza um meio de enriquecimento para o cultivo de microrganismos? Visto do docente: ___________________________
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