Identificação de Bactérias

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Identificação de Bactérias
Microbiologia Clínica
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Associação de métodos
Diferentes espécies podem apresentar morfologia e metabolismo idênticos. Assim, a identificação requer a observação de um conjunto complexo de características:
Morfologia celular: dimensões, forma, arranjos, comportamento tintorial, estruturas e mobilidade.
Características culturais: formas de crescimento das colônias em diferentes meios (meio em placas, meio inclinado, meio líquido, gelatina), odor.
Ecologia: hábitat, proveniência, condições ambientais, patogenicidade, hospedeiros, resistência.
Genética: sequência de genes específicos.
Fisiologia: exigências nutritivas, fontes de carbono e nitrogênio, fatores de crescimento 
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Primeiros procedimentos
Observar características morfológicas:
Meio de cultura líquido
Preparar lâmina a fresco – Motilidade
Preparar lâmina corada (Gram) – forma, arranjos, esporos
Estriar as bactérias em placas com ágar-nutriente 
observar morfologia das colônias (cor, formato, tamanho, bordas, textura, elevação)
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Cultura em placa
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Coloração de Gram
É a mais utilizada
Permite visualizar a forma, os arranjos, presença de esporos e saber qual é o tipo de parede da bactéria
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Escherichia coli
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Klebsiella pneumoniae
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Chromobacterium violaceum
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Bacillus cereus
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Lactobacillus plantarum
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Micrococcus luteus
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Staphylococcus epidermidis
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Serratia marcescens
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Pseudomonas fluorescens
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Coloração BAAR
Visualização de bacilos álcool-ácido-resistentes.
Coram fracamente pelo gram
Circundados por uma parede celular hidrofóbica contendo ácido micólico 
Resistem a descoloração
Misturas de álcool-ácido usadas na identificação
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Coloração de esporos
Verde malaquita  corante primário;
Lavagem;
Fucsina (safranina) cora o restante da bactéria;
Bactéria  verde e rosa;
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Provas Bioquímicas
As bactérias podem ser identificadas por características do seu metabolismo, como a capacidade de degradar determinados substratos e produzir gases.
As provas bioquímicas utilizam meios de cultura e reagentes específicos para detectar metabólitos resultantes da atividade bacteriana, auxiliando na sua identificação.
As provas mais conhecidas são:
Utilização de fontes de carbono 
Utilização de fontes de nitrogênio
Produção de enzimas
Motilidade
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Motilidade
A motilidade é observada através do aspecto do meio.
Utiliza-se um meio semi-sólido o que permite o crescimento bacteriano no interior do meio, por todo o tubo. 
Se a bactéria for móvel (motilidade positiva), o aspecto do meio será turvo
Se a bactéria for imóvel (motilidade negativa), o crescimento só será observado no local de inoculação. 
Dica: observar os tubos contra uma folha de papel pautado, se conseguir observar as linhas através do tubo é motilidade negativa.
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Meios que podem ser usados:
SIM 
(Sulfato, Indol, Motilidade)
MILI 
(Motilidade, Indol, Lisina)
MIO
(Motilidade, Indol, Ornitina)
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Catalase
Algumas bactérias são capazes de produzir a enzima catalase.
Decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) liberando água e oxigênio molecular (O2) – produção de bolhas.
				2 H2O2 → 2 H2O + O2
Coloca-se uma gota da cultura líquida em uma lâmina e deposita-se sobre ela uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%.
O peróxido de hidrogênio pode ser gotejado diretamente sobre uma cultura em placa.
Distinção entre Staphylococcus e Streptococcus
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Oxidase
As bactérias que produzem a enzima oxidase apresentam um sistema de transporte de elétrons denominado sistema citocromo oxidase. 
Neste sistema, os aceptores eletrônicos naturais podem ser substituídos por substratos artificiais.
Na presença de oxigênio atmosférico, são oxidados pela citocromo oxidase, formando um composto colorido.
A determinação da oxidase é um teste diferencial importante na identificação de bactérias Gram negativas. 
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Hidrólise da gelatina
Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolíticas (gelatinases) que liquefazem/hidrolisam gelatina;
Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e bacilos Gram positivos esporulados.
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Vermelho de Metila (VM)
Avalia se as bactérias produzem ácidos a partir da fermentação da glicose pela via ácida mista.
Podem ser produzidos: ácido fórmico, lático, acético, provocando redução do pH abaixo de 4,4 ( viragem do indicador). 
Todas as enterobactérias fermentam glicose.
Porém, algumas, durante a fase final de incubação, convertem esses ácidos a produtos não ácidos como o etanol e a acetoína, resultando num pH mais elevado (pH 6). 
O indicador de pH é o vermelho de metila 
pH abaixo de 4,4 é vermelho 
acima de 6 é amarelo
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Voges Proskauer (VP)
Há bactérias que utilizam a fermentação butilenoglicólica.
Fermentam a glicose produzindo acetil-metil-carbinol (acetoína), butilenoglicol e pequenas quantidades de ácidos. 
Quando KOH é adicionado, e na presença de O2 atmosférico, a acetoína é oxidada a diacetil. 
A adição de alfa-naftol nesta reação catalisa a produção de um anel vermelho tijolo, após 10-15 minutos.
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Hidrólise do Amido
Amido - polissacarídeo - alto peso molecular. 
Para ser transportado para o interior da célula e ser utilizado - quebra em unidades menores. 
A habilidade para hidrolisar esse polímero depende da produção e secreção de várias amilases. 
A quebra do amido é detectada utilizando-se culturas em ágar amido que são cobertas com uma solução de iodo.
O iodo reage com o amido para formar um complexo azul escuro.
 As colônias que podem hidrolisar o amido apresentarão uma zona clara a seu redor.
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Citrato
Determina se a bactéria é capaz de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono para crescer.
Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons, contendo citrato de sódio, fosfato de amônia e azul de bromotimol.
Com a facilidade do transporte de citrato pela citrato-permease há a sua utilização pela citrase, com produção de hidróxido de amônia que eleva o pH, fazendo com que a reação se torne azul. 
Nesse teste, utilizam-se tubos com meio inclinado para a cultura ter mais acesso ao oxigênio, que é necessário para utilização do citrato. 
O CO2 produzido reage com o sódio do citrato formando carbonatos de reação alcalina.
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Malonato (FM)
Determina a capacidade de uma bactéria de utilizar malonato como única fonte de carbono, alcalinizando o meio. 
O malonato liga-se competitivamente à desidrogenase succínica, impedindo sua ação catalítica sobre o ácido succínico.
Interrompe o Ciclo de Krebs, tirando da bactéria sua principal fonte de energia e impedindo a formação de outros intermediários necessários ao metabolismo. 
Indicador azul de bromotimol.
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Fermentação de açúcares
Um determinado carboidrato pode ser fermentado originando diferentes produtos finais, o que depende do microrganismo envolvido. 
Geração de gases 
Em meio líquido - presença de bolhas no tubo de Durham
Em meio sólido – quebra ou deslocamento do meio de cultura
Geração de ácidos orgânicos 
Podem ser detectados pela mudança de cor do indicador
Diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentação de carboidratos, produção de sulfato de hidrogênio e gás.
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TSI
 Three Sugar Iron
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Produção de H2S
Algumas bactérias são capazes de degradar compostos contendo enxofre através da tiossulfato redutase.Ocorre a produção de H2S que é incolor. 
O H2S reage com o ferro (indicador) formando um precipitado preto (sulfeto ferroso). 
Para que esta reação ocorra é necessário que o meio esteja ácido.
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TSI 
Three 
Sugar 
Iron
SIM
Sulfito de hidrogênio (H2S) 
Indol
Mobilidade
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TSI
 Three Sugar Iron
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Fenilalanina
Há bactérias que produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina presente no meio
Origina o ácido fenilpirúvico.
O ácido fenilpirúvico reage com o cloreto férrico (10%) adicionado ao meio, formando uma cor verde. 
Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias.
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Lisina
Algumas bactérias possuem a lisina descarboxilase (LDC) que atua sobre a porção carboxila dos aminoácidos.
Formam-se aminas, de reação alcalina (por ex. cadaverina), e CO2. 
A reação ocorre preferencialmente em condições anaeróbias e ligeiramente ácidas
Inicialmente ocorre a utilização da glicose do meio para enriquecimento da cultura e acidificação do meio.
O meio contém o indicador bromocresol púrpura.
Nas etapas iniciais de incubação, o tubo torna-se amarelo devido à fermentação da glicose. 
Se o aminoácido é descarboxilado o meio retorna à cor púrpura. A reação se processa em anaerobiose, podendo-se cobrir o meio com óleo mineral para agilizar o processo 
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Indol
O indol é produzido pela ação da enzima triptofanase sobre o triptofano existente no meio de cultura
Ocorre a produção de ácido pirúvico e amônia. 
O indol pode ser detectado pela formação de um anel rosa (pink) na parte superior do tubo, após a adição do reativo de Erlich.
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Uréia
Há bactérias que possuem a enzima urease - capacidade de degradar a uréia presente no meio liberando amônia, CO2 e H2O. 
A amônia reage formando carbonato de amônia que alcaliniza o meio. 
O indicador de pH é o vermelho de fenol, que em meio alcalino toma a coloração pink. 
Uma coloração meio rosa é suficiente para considerar a reação positiva.
BGN fermentadores e não fermentadores / Staphylococcus e Haemophilus.
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Redução de nitratos
Muitas bactérias são capazes de reduzir nitratos a nitritos.
Ocorre mais rapidamente em condições anaeróbias (condição em que o nitrato substitui o oxigênio como aceptor final de elétrons). 
Adicionando-se algumas gotas dos reativos de Griess-Ilosva, o nitrito é evidenciado através da formação de um composto avermelhado.
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Coagulase
A bactéria produz a enzima coagulase, que na presença do plasma provoca sua coagulação. 
Prova aceita universalmente para a diferenciação do S. aureus 
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Meio IAL
Utilizado para a identificação de enterobactérias.
Em apenas 1 tubo é possível fazer 9 provas bioquímicas diferentes
Fácil manuseio, porém, interpretação difícil.
E. coli, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Providencia spp., Morganella morganii, Proteus, Salmonella, Citrobacter, Serratia, Vibrio e Não fermentadoras
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Testes comerciais
Existem testes que são comercializados para uso laboratorial
Feitos em pequena escala – poupam espaço
Os meios vêm prontos ou desidratados – economizam tempo e material
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API 20E system  
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Bactray
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Laminocultivo
Laminocultivos são estruturas, geralmente plásticas de tampa e rosca, estéreis.
 Contêm meios de cultura que são acondicionados em lâminas com três divisões inseridas em um tubo transparente.
Os meios de cultivo que compõem os Laminocultivos destinam-se a propiciar o crescimento e o estudo das bactérias de interesse médico. 
Ex.: laminocultivo para urocultura - Contém: ágar Cled, Citrato de Simmons e Meio I (ágar MacConkey modificado).
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Antibiograma
Teste de sensibilidade a diversos antibióticos.
Deve-se espalhar o inóculo de maneira uniforme sobre a placa (grande), garantindo que nenhum espaço fique vazio.
Fazer o cultivo em meio líquido, padronizar e mergulhar um swab.
Passar o swab em todas as direções em uma placa contendo ágar Mueller Hinton.
Colocar os antibióticos a serem testados com o auxílio de uma pinça.
Esperar crescer e medir o halo de inibição.
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