Técnicas de engenharia genétina

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Objetivo:
Descrever os métodos usados para a produção de transgênicos, ressaltando
sua importância e eficácia
Introdução
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 Em engenharia Genética: Refere-se à utilização de técnicas in vitro
para alterar o material genético em laboratório (MADIGAN et al.,
2016);
 Surgimento em 1973;
 Avanços na biotecnologia.
Por que é possível criar um organismo transgênico?
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Fonte: Uol
 O maquinário celular responsável por sua
transcrição e tradução em proteínas é
semelhante em todos os organismos vivos
1. Métodos de obtenção de transgênicos
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Técnicas de 
manipulação 
genética
Adição de DNA 
Gene endógeno
Gene exógeno
Modificação 
genética dirigida
Adição gênica e 
cultura de células-
tronco embrionárias.
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Adição de DNA
Transferência direta de DNA para 
protoplastos
Uso de vetores virais e não virais
Bombardeamento de partículas ou 
microinjeção pronuclear
Modificação genética dirigida
produção de células-tronco
1.1. Adição de DNA
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 Adição uma ou mais cópias de transgene ao genoma do organismo
(Endógeno ou exógeno).
Transporte do 
Transgene
Transportado por um vetor 
e está contido em uma 
molécula de DNA ou RNA
Transferência direta de 
DNA para protoplastos
Microinjeção pronuclear 
1.2. Vetores
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 São pequenos elementos genéticos de replicação independente, utilizados
para replicar os genes. A maioria dos vetores é derivada de plasmídeos ou
vírus (MADIGAN et al., 2016).
Eficiência 
dos 
plasmídeos
Facilmente isolados e 
purificados 
Multiplicam-se em um 
número elevado de 
cópias nas células 
bacterianas
Baixa 
imunogenicidade
1.3. Vetores não Virais de Transferência Gênica
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 A transferência de material genético exógeno engloba as seguintes etapas:
- Integração;
- Incorporação;
- Transcrição;
- Tradução; 
- Manutenção; 
- Transferência Através de mitoses e meioses.
9 (Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2012) 
Etapas principais da clonagem
gênica:
• O vetor pode ser um plasmídeo
ou um genoma viral;
• Clivando-se o DNA exógeno e o
vetor com a mesma enzima de
restrição, são geradas
extremidades coesivas
complementares, que permitem
a inserção do DNA no vetor.
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(Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2012) 
Produção de plantas transgênicas, utilizando-se um sistema de vetor binário em 
Agrobacterium tumefaciens
11 Fonte: (MADIGAN et al., 2016) 
Plantas transgênicas: resistência a insetos.
Resultados de dois ensaios distintos de 
determinação do efeito das larvas da lagarta 
Fonte: (MADIGAN et al., 2016) 
Salmão transgênico de crescimento rápido
Forma 
Plasmidial
Gene de 
interesse: 
plasmideo
Moléculas de 
DNA que existem 
separadamente 
do cromossomo
Expressão 
eucariótica
Promove a 
síntese da 
proteína desejada 
na célula alvo 
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a. Forma Plasmidial
Oligonucleotídeo
antisense
Bloqueiam a tradução 
do RNA mensageiro, ou 
no núcleo
Capacidade de 
associação com a dupla 
hélice da fita de DNA
Fixam em sítios 
específicos do RNA
Pequenas sequências de DNA 
ou RNA, que podem ser 
utilizadas para inibição de 
algum gene
Vantagem 
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Especificidade e 
eficiência e tem sido 
utilizado para 
inibição de 
receptores de 
angiotensina
b. Oligonucleotídeo antisense
c. Lipossomo
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Lipossomo
Vantagens: transferência de genes 
de vários tamanhos e a possibilidade 
de introdução gênica em diversos 
tecidos 
Desvantagens: pouco 
empregado devido à baixa taxa 
de implantação dos genes 
desejados e baixa expressão 
dos mesmos
Vetores de lipossomos 
consistem na mistura do DNA 
desejado com fosfolipídios
2. vetores virais
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 Os mais utilizados na engenharia genética;
 São capazes de transferir seu material genético para células-alvo, mas 
não conseguem replicar-se e continuar seu ciclo infeccioso;
Vetores 
Virais 
Integrantes
Não 
integrantes
Retrovírus, 
lentivírus e vírus 
adenoassociados
Adenovírus
a. Retrovírus
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Retrovírus
Retrovírus utiliza 
uma transcriptase
reversa
Por ação da integrase
viral o provírus se 
integra aleatoriamente a 
um cromossomo da 
célula desejada
Por ação da integrase
viral o provírus se 
integra aleatoriamente a 
um cromossomo da 
célula desejada
Vírus RNA encapsulados 
(transformam RNA em 
DNA ) 
Estrutura e função dos retrovírus
17 Fonte: (MADIGAN et al., 2016) 
b. Adenoassociados
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Adenoassociados
Vírus DNA não encapsulado que 
causa certas doenças nos seres 
humanos
Necessita da presença de 
adenovírus para se replicar 
Vírus permanece latente na 
célula hospedeira
• Especificidade e ausência de
patogenicidade
Vantagens 
• Necessidade de vírus 
auxiliares para a produção 
desses vetores tem limitado 
sua utilização
Desvantagens
c. Adenovírus
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Adenovírus
Família dos vírus 
tumorais
Genoma compostos por 
mais de 12 genes
• Pouca patogenicidade;
• Infectem células em divisão
ou não com muita eficiência;
• Produção e manipulação
segura.
Vantagens 
• Vírus epissomal;
• Muitos adenovírus podem
perder-se, isso pode levar a
resposta imune e destruir
células hospedeiras
Desvantagens
d. Vírus herpes simples
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Vírus com DNA 
dupla fita
genoma 
se replica em células hospedeiras 
que se dividem ou não (epissomal)
Genoma compostos por mais de 12 
genes
• Alta capacidade de
transferência gênica em células
nervosas
Vantagens 
• Potencial de toxidade na
célula
Desvantagens
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3. Transferência de genes para protoplastos
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• Não necessita de um vetor
biológico;
• Não há barreira física para
a introdução de DNA;
• Técnica rápida, simples e
realizada sem agentes
tóxicos às células.
Vantagens 
• dificuldade de regeneração
de plantas a partir de
protoplastos
transformados.
Desvantagens
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Protoplastos
células desprovidas de paredes 
celulares
Sistema experimental ideal para 
transferência de genes
Integração de DNA: agentes 
químicos (polietilenoglicol) e 
eletroporadores
4. Transferência de genes por bombardeamento 
de partículas (biobalística)
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22
Sistema gene gun arma genética
• Facilidade de manusear o
grande número de genes
implantados;
• Pode ser aplicado a uma
grande variedade de células e
tecidos.
Vantagens 
• Causa uma morte celular
elevada
Desvantagens
As células alvo dependem apenas da otimização de 
parâmetros físicos:
• Micrósporos;
• Células em cultura;
• células de tecidos diferenciados ou meristemas;
• Podem estar à periferia ou no interior de tecidos.
4. Transferência de genes por bombardeamento 
de partículas
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23
(Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2012) 
• Uma pistola de genes, que pode ser usada para inserir
“projéteis” revestidos de DNA em uma célula;
• As partículas microscópicas de tungstênio ou ouro são
cobertas com DNA e arremessadas pelas paredes de
células vegetais por uma explosão de hélio;
• Algumas das células expressam o DNA introduzido como
se fosse delas próprias.
5. Microinjecção pronuclear
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Método mais antigo
É possível introduzir sequências longas de DNA de
diferentes espécies no genoma de mamíferos
Primeira produção com microinjecção foi em 1980
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A microinjeção de DNA exógeno em um óvulo 
fecundado de camundongo
(Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2012) 
Técnica requer o uso de 
uma micropipeta de 
vidro com o diâmetro 
muito menor que a célula
micropipeta perfura a 
membrana plasmática
DNA pode ser 
introduzido através dela
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6. Modificação genética dirigida
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Adição gênica
cultura de 
células-
tronco 
embrionáriasModificação 
genética 
dirigida
 Princípio: é a substituição de um gene - alvo por uma sequência mutada que,
uma vez introduzida, irá inativá-lo ou modificá-lo;
 Células-tronco embrionárias: São totipotentes;
Modelo knockout.
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Embrião humano na fase de blastocisto, do qual se 
extraem as células-tronco embrionárias
Fonte: Scientific American Brasil
Remoção de células 
embrionárias da cultura
Coloca as células novamente 
dentro blastócito
Ocorrem divisões nas células 
Transfusão
As células dos clones são 
multiplicados in vitro e injetados 
em blastócitos 
Células mplantadas em úteros 
de fêmeas pseudográvidas
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7. Prós e contras do uso de transgênicos 
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 A transgenia ainda movimenta várias linhas de pensamento.
a) Pontos positivos
 Possibilidade da incorporação de genes;
 rapidez e eficiência com que o gene é implantado, sem a necessidade de
cruzamentos;
 Implantação de características em plantas: resistência a doenças e a
pesticidas, maior valor nutricional, além disso, plantas mais resistentes a
pragas necessitam menos agrotóxico.
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b) Pontos Negativos
 Possibilidade da incorporação de genes;
 complexidade dos genes;
 Efeito competidor;
 Algumas espécies de plantas testadas se comportaram como “ervas
daninhas”;
 Possibilidade de cruzamento de OGM com organismos comuns.
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Conclusão
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 Pessoas possuem pensamento pessimista e se considerarem “cobaias” para testes
de engenharia genética;
 Produção de OGM nos Estados Unidos;
 Produção de insulina;
 Necessidade de estudos, pesquisas e testes antes de sua produção e
comercialização;
 Realizar estudos a fim de compreender os impactos recorrentes de sua utilização.
Referências
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TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L.. Microbiologia. 10.
ed. São Paulo: Artmed, 2012.
MADIGAN, Michael T. et al. Microbiologia de Brock. 14. ed. São Paulo: Artmed,
2016.