CONTEUDO 3

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25/10/2017 UNIP - Universidade Paulista : DisciplinaOnline - Sistemas de conteúdo online para Alunos.
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Tecnologia do DNA Recombinante:
Desde o momento que a estrutura do DNA foi descoberta, os cientistas começaram a desvendar um novo horizonte.
Começou então a sugir as técnicas de isolamento do DNA, multiplicação de fragmentos do DNA, descobertas da
enzima de restrição. A técnologia da molécula do DNA recombinante foi uma da pioneiras para a manipulação
genética.
O DNA recombinante é um fragmento de DNA (podendo este ser um gene ou não) ligado a um vetor de clonagem
ou de expressão e depois introduzido em um célula hospedeira (figura 1). 
Figura 1 - Formação da molécula de DNA recombinante e introdução na célula hospedeira.
 O Inserto (DNA ou gene de interesse) é material o qual se deseja clonar, expressar ou transportar para o interior de uma célula e o vetor é o veículo de clonagem,
expressão que servirá de trasnporte para o inserto.
Para entender melhor a molécula recombinante, estudaremos todas as partes que irão compor a realização da molécula do DNA recombinante.
 
Endonucleases de restrição ou Enzimas de restrição:
São proteínas monoméricas e diméricas e identificados em bactérias como defesa à infecção viral, ou seja, as bactérias possuem naturalmente as enzimas de
restrição que clivam sequêncas específicas do DNA dupla fita do vírus invasor (DNA exógeno). Portanto, a enzima de restrição reconhece e cliva (corta) uma
sequência específica (sítio de restrição) de DNA exógeno.
A clivagem pela enzima ou endonuclease de restrição é uma hidrólise na ligação fosfodiéster entre 3'OH e 5' fosfato do nucleotídeo adjacente (atenção, a enzima de
restrição NÃO hidrolisa pontes de hidrogênio que mantem a dupla fita de DN
Sítios de restrição:?
 - Muitos apresentam simetria rotacional (sequências palindrômicas),
- as clivagens (cortes) são de dois tipos: cegas (abruptas) ou coesivas. 
Figura 2 ´Cortes cegos e coesivos. Fonte: http://users.med.up.pt/med05009/bcm/digestao_frame_files/image004.gif
As enzimas de restrição também possue, especificidade (caso ocorra uma mutação no DNA na região do sítio de restrição, a enzima não clivará o DNA), quanto
menor o sítio maior a probabilidade de gerar fragmentos menores e em maior quantidade.
 
Exemplos de enzimas de restrição:
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DNA Ligase
A DNA ligase catalisa a reação fosfodiéster entre 3'OH e 5' fosfato do nucleotídeo adjacente. Desta forma, incorpora o inserto (DNA de interesse) ao vetor de
clonagem, de expressão ou de transferência, levando à formação da molécula de DNA recombinante.
Vetores de Clonagem Molecular:
 
Os vetores de clonagem servem paratransportar o inserto do DNA para dentro da célula hospedeira.
 
Características dos vetores de clonagem: Plasmídeos possuem replicação autônoma, sítios de clonagem, genes de seleção (muto comum o
uso de seleção por antibiótico). Como nâo tem promotor não podem ser induzidos para a síntese da proteína do gene que está no DNA , ou
seja, o vetor de clonagem serve par realização de multicópias,
 
 
 Segurança Custos Eficiência Fita deDNA Tamanho
Não
Virais > < < Simples
 < Até
9pb
Virais < > > Dupla
> Até
48.500
pb
Plasmídeos
São ótimos vetores não virais, e são naturais de Bactérias e algumas leveduras. São formados por um DNA circular
dupla fita. Os plasmídeos são elementos extracromossômicos que conferem resistência aos atibióticos na bactérias
e sua replicação autônoma, ou seja, se replica independente do cromossomo da bactéria. Possui Oric (ponto de
origem da replicação).
 DNA linear dupla fita.
Sítios cos: nucleotideos terminais complementares, circularização. 
Vetores de substituição (EMBL), que são sua maioria e de insersão (λgt10/11), bibliotecas de DNA. 
Codifica cerca de 48.500 pb. 
 Sistemas de seleção: São sistemas utilizados para observar se o inserto desejado incorporou na célula hospedeira.
Genes de resistência a antibióticos: Se utiliza um plasmídeo com resistência a um determinado antibiótico, após a
possível incorporação do inserto as células são submetidas ao antibiótico, as que não incosporaram o inserto
morrerão, restanto assim apenas as incorporadas. 
Lac (β galactosidase): Quando esse sistema reage com X Gal no substrado se torna de coloração azul, o
que possibilita essa ação é o sistema Lac Z. Quando o vetor é incorporado na célula hospedeira, ele cliva esse
sistema, inativando-o desse modo as colônias azuis não possuem o inserto. 
 Bacteriófago 
Codifica cerda de 48.500 pb 
Sítios cos: nucleotídeos terminais complementares, circularização. 
Vetores de substituição (EMBL), em sua maioria, e de insersão (λgt10/11), biblioteca de cDNA.
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 Vetores de expressão
Obtenção de um produto gênico
Vetores para hospedeiros: Procarióticos e Eucarióticos.
Vetores procarióticos de expressão:
Plasmídeos possuem Promotores eficientes e induzíveis, sítios de ligação ao ribossomo, promotores e sítios de clonagem, portanto, podem ser
induzidos para a síntese da proteína do gene que está no DNA recombinante. 
Hospedeiros:
Escherichia coli
 Bacillus subtilis
Proteínas recombinantes para terapia humana: exemplos
 Escherichia coli
 Bacillus subtilis
 Insulina
 Hormônio do crescimento (rhGH)
 Hormônio folículo estimulante (rhFSH)
 Fator VIII (rhFactorVIII)
 Eritropoetina (EPO)
 Fator estimulante de colônias de granulócitos (rhG-CSF)
 Glicocerebrosidase (rhGBA)
 Interferon α, β, γ (rhIFN- α, - β, - γ)
 Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1)
 Introdução de DNA em células hospedeiras
 propagação
 expressão
 análise fenotípica
 regulação
Introduzir o inserto na célula hospedeira
 
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 transformação bacteriana
 transfecção com bacteriófagos
 transfecção em células eucarióticas
transformação em plantas
Transformação bacteriana
Choque térmico: principio físico-químico, utiliza-se uma temperatura muito baixa e logo após uma temperatura muito alta, assim possibilitando a
transformação bacteriana.
Eletroporação: Utiliza-se uma solução levemente salina e um campo elétrico de alta voltagem, ocasionando na abertura dos poros da membrana
celular.
Bacteriófago: Ocorre uma indução por maltose e uma repressão por glicose, ocasionando em uma ligação a receptores preteícos da mebrana
bacteriana.
Transfecção em células eucarióticas:
As técnicas podem ser por eletroporação , lipossomos catiônicos ou por uma construções lipossomo + plasmídeo
 
Transformação em plantas:
A maior dificuldades é a parede celular que em algumas células são rígidas, portanto, o método na eletroporação nesses casos não é eficiente,
então há um outro método a de bombardeamento de DNA ou a utilização da bactéria Agrobacterium tumefasciens que ínfecta naturalmente a
Bombardeamento de DNA: acelerador de partículas + micropartículas de ouro/tungstênio revestidas de DNA.
 
 
 
 
 
 
 
 
Exercício 1:
 
Antes de 1970, o DNA era a molécula mais difícil para um bioquímico analisar. Hoje a situação mudou, A tecnologia
do DNA recombinante revolucionou a pesquisa permitindo inserir um pedaço de DNA em um plasmídeo . Para isto é
necessário que ocorra:
 
I – a digestão do DNA por uma endonuclease (enzima de restrição) e recolocado no genoma nativo do organismo
 
II - a digestão do DNA e do vetor por uma endonuclease (enzima de restrição) e depois ligados entre si através
da enzima DNA ligase
 
 III – a inserção do DNA genômico no vetor e a sua ligação com a DNA ligase
 
Podemos afirmar que:
 
 
A)
 
As alternativas I e II estãoincorretas
 
B)
 
 As alternativas I e III estão incorretas
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C)
 
 todas as alternativas estão incorretas
 
D)
 
 Somente a Alternativa I está incorreta
 
E)
 
 Somente a Alternativa II está incorreta
O aluno respondeu e acertou. Alternativa(B)
Comentários:
A) Para abrir os plasmídeos (lembrando que é um DNA circular) e depois grudar os pedacinhos de DNA que
extraímos pela Miniprep e multiplicamos pela PCR, usamos as chamadas enzimas de restrição e de ligação. 
E) Para abrir os plasmídeos (lembrando que é um DNA circular) e depois grudar os pedacinhos de DNA que
extraímos pela Miniprep e multiplicamos pela PCR, usamos as chamadas enzimas de restrição e de ligação. 
B) Para abrir os plasmídeos (lembrando que é um DNA circular) e depois grudar os pedacinhos de DNA que
extraímos pela Miniprep e multiplicamos pela PCR, usamos as chamadas enzimas de restrição e de ligação. 
Exercício 2:
 
O DNA é constantemente manipulado pela natureza. Ele pode ser copiado, cortado, religado diversas vezes nas
células vivas. Os agentes naturais que respondem por esta manipulação são as enzimas. A tecnologia baseada no
DNA utilizam essas enzimas. Uma das enzimas muito utilizada é a endonuclease de restrição (enzima de restrição)
 a respeito dessa enzimas é correto afirmar que ela:
 
A)
 
 Digere o DNA em sítios específicos, denominados sítios de restrição
B)
 
 Cliva o RNA mensageiro em transcritos primários
 
C)
 
Catalisa a reação fosfodiéster existente entre dois nucleotídeos
 
D)
 
Cliva as pontes de hidrogênio da dupla fita de DNA
 
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E)
 
Catalisar as pontes de hidrogênio da dupla fita de DNA
O aluno respondeu e acertou. Alternativa(A)
Comentários:
B) As enzimas de restrição reconhecem e cortam os plasmídeos em regiões específicas que queremos, isto é,
cortam em determinadas sequências de pares de base. Inclusive existem dois tipos de corte, podendo formar
extremidades coesivas (cortes em comprimentos diferentes entre as duas fitas) ou cegas (corte reto na dupla fita). 
C) As enzimas de restrição reconhecem e cortam os plasmídeos em regiões específicas que queremos, isto é,
cortam em determinadas sequências de pares de base. Inclusive existem dois tipos de corte, podendo formar
extremidades coesivas (cortes em comprimentos diferentes entre as duas fitas) ou cegas (corte reto na dupla fita). 
D) As enzimas de restrição reconhecem e cortam os plasmídeos em regiões específicas que queremos, isto é,
cortam em determinadas sequências de pares de base. Inclusive existem dois tipos de corte, podendo formar
extremidades coesivas (cortes em comprimentos diferentes entre as duas fitas) ou cegas (corte reto na dupla fita). 
E) As enzimas de restrição reconhecem e cortam os plasmídeos em regiões específicas que queremos, isto é,
cortam em determinadas sequências de pares de base. Inclusive existem dois tipos de corte, podendo formar
extremidades coesivas (cortes em comprimentos diferentes entre as duas fitas) ou cegas (corte reto na dupla fita). 
A) As enzimas de restrição reconhecem e cortam os plasmídeos em regiões específicas que queremos, isto é,
cortam em determinadas sequências de pares de base. Inclusive existem dois tipos de corte, podendo formar
extremidades coesivas (cortes em comprimentos diferentes entre as duas fitas) ou cegas (corte reto na dupla fita). 
Exercício 3:
 
A manipulação dos ácidos nuleicos in vitro depende, inicialmente, da disponibilidade de enzimas que possam
cortar, ligar e replicar o DNA. Analise as questões a seguir.
 
I - As endonucleases de restrição reconhecem, geralmente, sequências idêntica a fita molde do DNA.
II - Dependendo da endonuclease de restrição utilizada, o DNA é clivado em extremidades cegas ou coesivas
III - Enzimas de restrição é uma ferramenta essencial na construção de moléculas de DNA recombinante.
V - Uma endonuclease de restrição sempre reconhece vários sítios de restrição diferentes, permanecendo assim a
variedade de sítios que uma mesma enzima poderá clivar
 
Considerando V (verdadeira) e F (falsa), pode-se afirmar que as afimrações são respecitvamente:
 
A)
 
 V, V, V, F
 
B)
 
 F, V, V, F
 
C)
 
 F, F, V, V
 
D)
 
 V, V, F, F
 
E)
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 F, V, V, V
O aluno respondeu e acertou. Alternativa(B)
Comentários:
D) conferem com as alternativas verdadeiras e falsas. 
A) conferem com as alternativas verdadeiras e falsas. 
B) conferem com as alternativas verdadeiras e falsas. 
Exercício 4:
Para a clonagem de um deterninado segmento de DNANa construção de uma molécula de DNA recombinante. Para esta reação é
preciso:
A)
 
A - liberar o inserto do vetor, clivando as pontes de hidrogênio existentes entre entre 2 nucleotídeos
 
B)
 
B - incorporar o inserto ao vetor, hidrolisando a reação fosfodiester entre 2 nucleotídeos adjacentes
 
C)
 
C - liberar o inserto do vetor, hidrolisando a reação fosfodiester entre nucleotídeos adjacentes
 
D)
 
D - incorporar o inserto ao vetor, catalisando as pontes de hidrogênio existentes entre os 2 nucleotídeos
 
E)
 
E - incorporar o inserto ao vetor, catalisando a reação fosfodiéster entre 2 nucleotídeos adjacentes
O aluno respondeu e acertou. Alternativa(E)
Comentários:
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A) Clonagem gênica (técnica do DNA recombinante ou engenharia genética) consiste na inserção de um segmento
selecionado de DNA (DNA doador ou inserto) em um plasmídio ou no cromossomo de um bacteriófago, que atuam
como vetores de clonagem, e posterior replicação desse DNA recombinante em um hospedeiro apropriado, como
uma bactéria ou uma célula de levedura. Essa replicação ocorre quando o sistema de síntese do DNA do hospedeiro
replica o DNA inserido na célula hospedeira. Dessa forma, a partir de uma dessas células transformadas são
obtidas, graças à divisão celular, um grande número de células idênticas (clones), cada uma dotada de várias
cópias do DNA recombinante. 
B) Clonagem gênica (técnica do DNA recombinante ou engenharia genética) consiste na inserção de um segmento
selecionado de DNA (DNA doador ou inserto) em um plasmídio ou no cromossomo de um bacteriófago, que atuam
como vetores de clonagem, e posterior replicação desse DNA recombinante em um hospedeiro apropriado, como
uma bactéria ou uma célula de levedura. Essa replicação ocorre quando o sistema de síntese do DNA do hospedeiro
replica o DNA inserido na célula hospedeira. Dessa forma, a partir de uma dessas células transformadas são
obtidas, graças à divisão celular, um grande número de células idênticas (clones), cada uma dotada de várias
cópias do DNA recombinante. 
C) Clonagem gênica (técnica do DNA recombinante ou engenharia genética) consiste na inserção de um segmento
selecionado de DNA (DNA doador ou inserto) em um plasmídio ou no cromossomo de um bacteriófago, que atuam
como vetores de clonagem, e posterior replicação desse DNA recombinante em um hospedeiro apropriado, como
uma bactéria ou uma célula de levedura. Essa replicação ocorre quando o sistema de síntese do DNA do hospedeiro
replica o DNA inserido na célula hospedeira. Dessa forma, a partir de uma dessas células transformadas são
obtidas, graças à divisão celular, um grande número de células idênticas (clones), cada uma dotada de várias
cópias do DNA recombinante. 
D) Clonagem gênica (técnica do DNA recombinante ou engenharia genética) consiste na inserção de um segmento
selecionado de DNA (DNA doador ou inserto) em um plasmídio ou no cromossomode um bacteriófago, que atuam
como vetores de clonagem, e posterior replicação desse DNA recombinante em um hospedeiro apropriado, como
uma bactéria ou uma célula de levedura. Essa replicação ocorre quando o sistema de síntese do DNA do hospedeiro
replica o DNA inserido na célula hospedeira. Dessa forma, a partir de uma dessas células transformadas são
obtidas, graças à divisão celular, um grande número de células idênticas (clones), cada uma dotada de várias
cópias do DNA recombinante. 
E) Clonagem gênica (técnica do DNA recombinante ou engenharia genética) consiste na inserção de um segmento
selecionado de DNA (DNA doador ou inserto) em um plasmídio ou no cromossomo de um bacteriófago, que atuam
como vetores de clonagem, e posterior replicação desse DNA recombinante em um hospedeiro apropriado, como
uma bactéria ou uma célula de levedura. Essa replicação ocorre quando o sistema de síntese do DNA do hospedeiro
replica o DNA inserido na célula hospedeira. Dessa forma, a partir de uma dessas células transformadas são
obtidas, graças à divisão celular, um grande número de células idênticas (clones), cada uma dotada de várias
cópias do DNA recombinante. 
Exercício 5:
 
Os fagos estão entre os seres mais diversos e amplamente distribuídos da biosfera e pertencem à categoria dos
elementos genéticos móveis e, são vírus de bactérias. Os fagos não possuem uma maquinaria metabólica própria
e, por isso, são incapazes de se multiplicarem sem parasitar célula de um hospedeiro.
 
I - Os fagos são usados pois são capazes de replicação autônoma, e podem ser utilizados como vetor de
clonagem.
II – Um dos fagos mais usados como vetor em experimentos de biologia molecular é o bacteriófagos l.
III – O DNA do bacteriófago l não é indicado para ser usado como vetor, pois o seu material genético não pode ser
modificado.
 
Podemos afirmar que:
 
A)
 
A - Somente a Alternativa I está correta
 
B)
 
B - Somente a Alternativa II está correta
 
C)
 
C - Somente a Alternativa III está correta
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D)
 
D - As alternativas I e II estão corretas
 
E)
 
E - As alternativas II e III estão corretas
O aluno respondeu e acertou. Alternativa(D)
Comentários:
C) A recombinação entre moléculas de DNA de diferentes organismos é um fenômeno comum na natureza. Alguns
fagos, por exemplo, têm a capacidade de inserir seu genoma no cromossomo da Escherichia coli, mudando o
conteúdo genético da célula. Vez por outra, ao receber nova informação genética do vírus, uma bactéria pode se
tornar patogênica. Essa modificação genética provocada por vírus, denominada conversão lisogênica, é um exemplo
de engenharia genética presente na natureza. 
E) A recombinação entre moléculas de DNA de diferentes organismos é um fenômeno comum na natureza. Alguns
fagos, por exemplo, têm a capacidade de inserir seu genoma no cromossomo da Escherichia coli, mudando o
conteúdo genético da célula. Vez por outra, ao receber nova informação genética do vírus, uma bactéria pode se
tornar patogênica. Essa modificação genética provocada por vírus, denominada conversão lisogênica, é um exemplo
de engenharia genética presente na natureza. 
A) A recombinação entre moléculas de DNA de diferentes organismos é um fenômeno comum na natureza. Alguns
fagos, por exemplo, têm a capacidade de inserir seu genoma no cromossomo da Escherichia coli, mudando o
conteúdo genético da célula. Vez por outra, ao receber nova informação genética do vírus, uma bactéria pode se
tornar patogênica. Essa modificação genética provocada por vírus, denominada conversão lisogênica, é um exemplo
de engenharia genética presente na natureza. 
D) A recombinação entre moléculas de DNA de diferentes organismos é um fenômeno comum na natureza. Alguns
fagos, por exemplo, têm a capacidade de inserir seu genoma no cromossomo da Escherichia coli, mudando o
conteúdo genético da célula. Vez por outra, ao receber nova informação genética do vírus, uma bactéria pode se
tornar patogênica. Essa modificação genética provocada por vírus, denominada conversão lisogênica, é um exemplo
de engenharia genética presente na natureza.