Tecnologia do DNA Recombinante

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Tecnologia do DNA Recombinante 
 
Introdução 
★ Biotecnologia: é a utilização de microorganismos, plantas e animais para a produção 
de substâncias úteis aos seres humanos 
★ Engenharia Genética: é uma nova biotecnologia baseada nas técnicas mais 
modernas de manipulação de DNA, que permite transplantar genes de uma espécie 
para outra e criar uma nova molécula de DNA 
 
Separação de fragmentos de DNA- Eletroforese em gel 
★ A eletroforese em gel é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA de 
acordo com seu tamanho 
★ Aplicação importante: usar PCR + eletroforese para determinar se duas amostras de 
DNA são iguais → identificação de culpados de crime, identificação de amostra de 
transgênico 
★ Princípio de funcionamento: A eletroforese envolve a passagem de uma corrente 
através de um gel contendo as moléculas de interesse. Em função de seu tamanho 
e carga, as moléculas vão se mover através do gel em diferentes direções ou em 
diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras 
○ As amostras de DNA são carregadas nos poços (cavidades) localizados 
numa das extremidades de um gel, e uma corrente elétrica é aplicada para 
fazê-las avançar pelo gel. 
○ Os fragmentos DNA estão carregados negativamente, então movem-se na 
direção do eletrodo positivo. Já que todos os fragmentos de DNA têm a 
mesma quantidade de carga por massa, os fragmentos menores atravessam 
o gel mais rapidamente do que os maiores. 
○ Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga ao DNA, os 
fragmentos de DNA podem ser vistos como bandas, cada uma 
representando um grupo de fragmentos de DNA de mesmo tamanho 
 
Clonagem de DNA 
★ clone: cópia idêntica 
★ clonagem: envolve a separação de um gene específico ou segmento de DNA 
ligando-o a uma molécula de DNA que atua como portadora → O resultado é a 
amplificação seletiva de um gene ou segmento de DNA particular 
 
Etapas da Clonagem 
★ Primeira etapa: corte do DNA em locais precisos utilizando endonucleases que 
reconhecem sequências específicas de ácidos nucleicos endonucleases de restrição 
★ Segunda etapa: seleção de uma molécula pequena de DNA capaz de 
autorreplicação → vetores de clonagem (plasmídeos os DNA’s virais) 
★ Terceira etapa: ligação covalente de dois fragmentos do DNA feita pela enzima DNA 
ligase → liga o vetor de clonagem e o DNA a ser clonado (produz DNA 
recombinante) 
○ responsável por unir os fragmentos isolados do DNA alvo a um vetor de 
clonagem, digerido pela mesma endonuclease de restrição 
○ catalisa a formação de novas ligações fosfodiéster em uma reação que usa 
ATP ou algum cofator semelhante 
 
★ Quarta etapa: passagem do DNA recombinante do tubo de ensaio para a 
célula hospedeira → irá fornecer a maquinaria enzimática para a replicação 
 
 
★ Quinta etapa: seleção ou identificação das células hospedeiras que contém o DNA 
recombinante 
○ Um plasmídeo geralmente tem um gene de resistência aos antibióticos, que 
permite que as bactérias sobrevivam na presença de um antibiótico 
específico. Assim, as bactérias portadoras de plasmídeo podem ser 
selecionadas em placas com nutrientes contendo o antibiótico. As bactérias 
sem plasmídeo morrerão, enquanto bactérias portadoras de plasmídeo 
podem viver e reproduzir-se. Cada bactéria sobrevivente dará origem a um 
grupo pequeno, como um ponto, ou colônia, de bactérias idênticas em que 
todas carregam o mesmo plasmídeo 
○ Nem todas as colônias irão necessariamente conter o plasmídeo certo. Isso 
acontece porque, durante uma ligação, fragmentos de DNA nem sempre 
ficam "colados" exatamente da maneira que queremos. Em vez disso, 
devemos coletar o DNA de várias colônias e ver se cada uma contém o 
plasmídeo certo. Métodos como digestão por enzima de restrição e 
PCR/RCP são comumente usados para checar os plasmídeos 
 
 
○ As bactérias servem como mini "fábricas," produzindo grandes quantidades 
de proteína. Por exemplo, se nosso plasmídeo continha o gene da insulina 
humana, as bactérias começariam a transcrição do gene e a tradução do 
RNAm para produzir muitas moléculas da proteína insulina humana 
 
https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/bacterial-transformation-selection
https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase
https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr
Enzimas da Clonagem 
 
 
Vetores de Clonagem 
★ são necessários para transferir o DNA recombinante em uma forma clonável para 
uma célula hospedeira e sua subsequente amplificação nela 
★ Plasmídeos: 
○ são moléculas circulares de DNA que se replicam separadamente do 
cromossomo do hospedeiro; 
○ podem ser introduzidos nas células bacterianas por um processo chamado 
transformação 
○ geralmente adiciona-se gene que confiram resistência à antibióticos, para 
que apenas células transformadas pelo plasmídeo recombinante crescerão 
na presença do antibiótico (seleção das bactérias que contém o plasmídeo) 
 
★ Bacteriófagos: 
○ possui um mecanismo muito eficiente para transferir seus fragmentos de 
DNA para uma bactéria 
○ usado como vetor para clonar segmentos de DNA maiores 
 
★ Cromossomos artificiais de bactérias: 
○ são plasmídeos destinados à clonagem de segmentos muito longos de DNA 
 
Expressão do gene clonado 
★ o produto do gene clonado é, em geral, o desperta o interesse principal na clonagem 
de DNA: possui valor comercial, terapêutico ou de pesquisa 
★ a maioria dos genes eucarióticos não possui elementos de sequência de DNA 
necessários para sua expressão em células de bactérias; 
★ sequências regulatórias precisam ser inseridas nas posições adequadas no DNA do 
vetor que carrega o gene de interesse → utilizar vetores de expressão 
○ são vetores de clonagem com sinais de transcrição e tradução necessários 
para a expressão regulada de um gene clonado 
 
Alterações nos genes clonados para produção de proteínas modificadas 
★ usada para fazer produtos proteicos sutilmente alterados em relação às suas formas 
naturais 
★ Mutagênese sítio-dirigida: aminoácidos específicos substituídos individualmente 
 
★ Mutagênese direcionada a oligonucleotídeos: mudança específica na sequência do 
DNA→ uma fita curta de DNA sintético é fixada a uma cópia de fita simples do gene 
clonado dentro de um vetor apropriado 
 
 
 
 
Biblioteca de DNA 
★ é uma coleção de clones de DNA: é uma fonte de DNA usada para a descoberta de 
genes e estudos do sequenciamento e função gênica. 
★ Biblioteca genômica: produzida quando o genoma completo de um organismo é 
clivado em milhares de fragmentos e todos eles são clonados por inserção em um 
vetor de clonagem. 
★ Sequenciamento do genoma humano: 
○ 99% do genoma humano foi sequenciado com uma precisão de 99,99%. 
○ 1% do genoma não pode ser sequenciado por possuir muitas repetições de 
bases nitrogenadas 
○ 50% dos genes que tiveram sua sequência determinada codificam proteínas 
de funções conhecidas 
○ Facilitou o desenvolvimento de fármacos muito potentes e a compreensão de 
diversas doenças genéticas 
 
Aplicações 
★ Farmacologia: 
○ produção de insulina humana: produção em escala comercial a partir de 
bactérias transformadas por plasmídeos portadores do gene humano 
codificador da insulina 
○ hormônio de crescimento humano para crianças com problemas de 
crescimento. 
○ fatores de coagulação para hemofílicos. 
○ ativador de plasminogênio usado para dissolver coágulos sanguíneos em 
pacientes com ataques cardíacos 
○ medicamentos oligonucleotídicos para o tratamento de AIDS e câncer 
★ Bactérias especializadas: 
○ Bactérias metabolizadoras de petróleo: plasmídeo com vários genes para 
metabolizar petróleo são introduzidos em bactérias marinhas → tornam-se 
capazes de limpar manchas de óleo nos oceanos 
○ Bactérias usadas paraprodução de etanol a partir de material vegetal, lixívia 
de minérios, tratamento de esgotos e detritos, etc. 
★ Agricultura: 
○ Plantas resistentes à infecções virulentas: transferência de genes de 
proteínas virais para células vegetais →ex: abóboras geneticamente 
modificadas 
○ Plantas resistentes a pestes: gene codificador da toxina capaz de matar 
larvas de certas pragas de insetos foi isolado da bactéria Bacillus turingiensis 
e transferido para o milho, tomate, batata e algodão. 
○ Plantas resistentes a herbicidas: ervas daninhas competem com a planta por 
água, luz solar e nutrientes → uso de herbicidas. 
■ Criação de plantas resistentes a herbicidas: quando os campos são 
pulverizados com herbicidas ervas daninhas morrem e plantas 
geneticamente modificadas não. 
○ Arroz transgênico: desenvolvido para melhorar a nutrição → presenta genes 
exógenos que codificam enzimas necessárias para a síntese do β-caroteno, 
precursor da vitamina A, e um gene para a proteína que armazena ferro, a 
ferritina → reduz deficiência de vitamina A e de ferro. 
★ Pecuária: 
○ Melhoramento genético de animais: 
■ aumento da produção de leite 
■ maior massa corporal para a produção de carne 
■ produção de carne com menos colesterol ou menos gordura 
(eliminação de genes que implicam em alto teor de gordura) 
○ Animais transgênicos como biorreatores: produzem proteínas de interesse 
farmacêutico no leite, no sangue ou até mesmo na urina 
■ bovino produtor de lactoferrina humana 
■ caprino produtor de medicamentos anti-câncer 
■ suíno produtor de hemoglobina humana 
★ Terapia gênica: 
○ transferência direta de genes em humanos para o tratamento de doenças: 
câncer, doenças cardíacas, AIDS 
★ Medicina forense: 
○ Investigações criminais: 
■ identificação de criminosos 
■ identificação de peças ósseas e órgão humanos 
■ identificação de manchas de sangue 
■ identificação de corpos mutilados/carbonizados 
○ Testes de paternidade: análise do DNA das amostras de DNA dos supostos 
pai e filho → baseia-se na comparação entre os genes que compõe o DNA 
(eletroforese em gel) 
 
Implicações Éticas 
★ uso da biotecnologia em testes genéticos para triagem de doenças: doenças que 
ainda não apresentam cura → Doença de Huntington 
★ uso da biotecnologia em produtos agrícolas e a produção de transgênicos: 
○ pode haver escape gênico de plantas geneticamente modificadas e 
consequente contaminação de plantas nativas→ desequilíbrio ecológico 
○ impactos na saúde humana/animal 
 
 
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	Separação de fragmentos de DNA- Eletroforese em gel
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