FUNDAMENTOS EM MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA MFS

Prévia do material em texto

FUNDAMENTOS EM MICROSCOPIA DE 
FLUORESCÊNCIA
Marcelo F. Santiago
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Universidade Federal do Rio de Janeiro
(marcelo.santiago@biof.ufrj.br)
Poder de resolução
Super resolução
Fluorescência
Jablonski Diagram
Desvio de Stokes
Tipos de lâmpada
Metal Halide
Tugsten-Halogen
HBO
Filtro de Emissão 
(Barreira)
(BP 510-525)
Filtro de Excitação
(BP 450-490)
Divisor Cromático 
(Espelho Dicróico) 
(FT 510)
200 - 900 nm
450 - 490 nm
510 - 525 nm
l > 510 nm l > 450 nm
PMT
Microscopia de Fluorescência
Espécime
Objetiva
Filtros para Fluorescência - Exemplos
FITC, PE, Cy2, Alexa 488 TRITC, TxRed, Alexa 555
FITC / 
Rhod
bovine endothelial cellsFITC Rhod merged
The crosstalk problem
The photobleaching problem
Fluoróforos
Objetivas
Especificações e Propriedades
Escolha da Objetiva
Para encontrar a melhor objetiva para a sua 
aplicação, vários parâmetros devem ser 
levados em consideração:
• Espectro de transmissão
• Distância de trabalho (WD)
• “Flatness“ / Profundidade de campo
• Correção / Resolução
Spectra
0
20
40
60
80
100
23
0
32
5
36
0
40
0
75
0
10
55
12
00
15
50
19
00
Wavelength (nm)
Tr
an
sm
is
si
on
 (%
)
Achroplan 40x 0,8W
Achroplan 40x 0,8W IR
PNF 40x 1,3
PlanApo 40x 1,0
C-Apo 40x 1,2W
Características Espectrais
(Lentes de 40X)
Características Espectrais
(Lentes de 63X)
Spectra
0
20
40
60
80
100
23
0
33
5
38
0
60
0
10
50
13
00
17
50
Wavelength (nm)
Tr
an
sm
is
si
on
 (%
)
Achroplan 63x 095 W
Achroplan 63x 095 W IR
PNF 63x/1,25
PlanApo 63x 1,4
C-Apo 63x 1,2
Escolha da Objetiva
Para encontrar a melhor objetiva para a sua 
aplicação, vários parâmetros devem ser 
levados em consideração:
• Espectro de transmissão
• Distância de trabalho (WD)
• “Flatness“ / Profundidade de campo
• Correção / Resolução
Distância de Trabalho
Escolha da Objetiva
Para encontrar a melhor objetiva para a sua 
aplicação, vários parâmetros devem ser 
levados em consideração:
• Espectro de transmissão
• Distância de trabalho (WD)
• “Flatness“ / Profundidade de campo
• Correção / Resolução
Correções Ópticas
Disco de Airy - PSF
Abertura Numérica - Resolução
40 X / 1,3 Oil
63 X / 1,4 Oil
100 X / 1,45 Oil
Derivação da fórmula 
de Ernst Abbe
d = 0.61λ / NA 
Resolução, Magnificação e Brilho
Image Brightness
B = λ NA4/M2
Resolução
d = 0.61λ / NA 
Relação 
SINAL/RUIDO
Resolução x NA x Lambda
Meio de imersão
O desafio das 3 dimensões
Espécimes finos
conventional fluorescence 3D reconstruction 
Amber fossil (Chironomide) thickness app. 300 µm
Espécimes espessos
Espécimes espessos
Fluorescência convencional x luz 
estruturada
Detection
ZEISS
Plan-NEOFLUAR
40x /1,3 Oil
ZEISS
Plan-NEOFLUAR
40x /1,3 Oil
Excitation
Rat Brain, Double labelling:
Green: Neurons, Blue: Nuclei
Problem:
Detecting in-focus information together with out-of-focus signals in wide-field microscopy
ZEISS
Plan-NEOFLUAR
40x /1,3 Oil
ZEISS
Plan-NEOFLUAR
40x /1,3 Oil
Excitation
Goal:
To detect only the fluorescence information from the plane of focus
Detection
Rat Brain, Double labelling:
Green: Neurons, Blue: Nuclei
Fluorescência convencional x luz 
estruturada
Fluorescência convencional x iluminação 
estruturada
The ApoTome-Slider 
- Two Positions inside the Beampath
ApoTome mode
(with grid in FL-beampath)
Conventional epi-fluorescence mode
(no grid in FL-beampath)
Easy switching between true conventional mode and ApoTome mode
Structured Illumination Fluorescence
Microscopy - ApoTome
Convencional Apotome
Structured Illumination
- The Principle
Grid pattern is projected into the 
focal plane of the objective 
 Visible in the eyepiece and the 
camera
Grid movement by swinging a planparalel plate
- The grid itself is fixed on the carrier
Position 1 Position 2 Position 3
Structured Illumination
- The Principle
1 phase 2 phase 3 phaseConventional Sectioned
• If the local change 
in contrast is high, 
the structure is 
inside the focal 
plane
• If the local change 
in contrast is zero, 
the structure is not 
inside the focal 
plane 
Position 1 Position 2 Position 3 Optical section
If the local change in contrast is high, the structure is inside the focal plane 
If the local change in contrast is zero, the structure is not inside the focal plane 
Structured Illumination –
The Principle
S
tr
u
c
tu
re
d
 I
llu
m
in
a
ti
o
n
Applications of the ApoTome
The ApoTome is „just“ an 
upgrade of a research 
microscope
Large range of imaging 
applications
Nearly every conventional 
fluorescence application can 
use the benefits of the 
ApoTome
It can be used in 2D and 3D 
applications
Sample thickness up to 50 
µm
Conventional mode ApoTome mode
Drosophila Embryo
2-Channel-Fluorescence
Acquired with AxioVision MultiChannel-Modul, AxioCam MRm and ApoTome
Courtesy of George Scaria, University of Illinois at Chicago Medical School, USA
Application Example 
- 2-Dimensional Multi-Channel Imaging
Zebra Fish Embryo
GFP-staining, 3D-Image Stack
Acquired with AxioVision MultiChannel-Modul, AxioCam MRm and ApoTome
Conventional mode ApoTome mode
Application Example
- 3-Dimensional Imaging
Drosophila Embryo 
2-Channel-Fluorescence (green: HRP, red: Glia-marker), Transparency Projection with Inside 4D
Acquired with AxioVision MultiChannel-Modul, AxioCam MRm and ApoTome, Objective Plan-ApoChromat
20/0,75
Courtesy of Thomas Hummel and Christian Klämbt, Institute of Neurobiology, University of Münster, 
Germany
Conventional mode ApoTome mode
Application Example
- 3-Dimensional Multi-Channel Imaging
Structured Illumination
Advantages
S
tr
u
c
tu
re
d
 I
llu
m
in
a
ti
o
n
▪ 2D optical sectioning 
(even on manual stands)
▪ Easy and seamless integration (& upgrades) 
into widefield systems
▪ Fast online calculation of optical sections 
(keeping the widefield information)
▪ Low phototoxicity & bleaching
Mouse kidney
Conventional versus ApoTome mode
Mouse intestine section
Conventional versus ApoTome mode
Imagem Confocal
Marvin Minsky
1955
Minsky, M. Memoir on Inventing Confocal Scanning Microscope. Scanning, 10: 128-138, 1988. 
LSM 510 META (Zeiss)
IBCCF-UFRJ
O Princípio da Microscopia Confocal
• Fonte de iluminação puntiforme
• Planos focais conjugados
• Óptica com “Pinhole”
Vantagens
• Seccionamento óptico não-invasivo
• Imagens Multidimensionais
• Eliminação dos planos fora de foco
• “Bleaching” apenas na região analisada 
(cone de iluminação)
dichroic
mirror
Lightsource
Objective lens
Sample
confocal
aperture
Detector
CLSM x Microscopia de Fluorescência
Ref: Virtual Microscopy Web Site. 
CLSM x Microscopia de Fluorescência
Ref: Virtual Microscopy Web Site. 
Non-ConfocalConfocal Non-Confocal Non-ConfocalConfocal Confocal
Microscopia de Fluorescência X Confocal
• Individual pinholes in front of 
every detector
• High sensitivity single detectors
• META detector
– Reflective grating for even 
dispersion
– 32 detector elements
– Simultaneous illumination
– Capture full emission spectra
• Two indepedent scan mirrors
LSM 510 META
Pinhole X Resolução de ImagemO “Pinhole” enquanto um “filtro” espacial 
O diâmetro do “Pinhole” determina:
– Intensidade da fluorescência
– Relação Sinal / Ruído
– Resolução no eixo “z” (espessura da secção óptica)
• resolução máxima em “z” (profundidade) = 380-400 nm
• resolução máxima no plano xy (lateral) = 180-200 nm
one pinhole / one size
three pinholes / different sizes
The multiple pinhole concept - optimal resolution
Dyes Pinhole Optical slice
DAPI, Hoechst 1 Airy unit 0.7 µm
eGFP, FITC, Alexa488 1 Airy unit 0.9 µm
DsRed (RFP), Cy3, Rhod 1 Airy unit 1.0 µm
Cy5 1 Airy unit 1.1 µm
C-Apochromat 63x/ 1.2 W
Pinhole settings for optimal resolution
DAPI GFP Cy-3Cy-5
I
X
pinhole size=1 Airy unit
d = 0.61λ / NA 
The multiple pinhole concept - optimal 3D imaging

Lachrymal gland (actin filaments of myoepithelial cells, acinar cells),
Satoh, Iwate, Japan
DAPI GFP Cy-3Cy-5
Dyes Pinhole Optical slice
DAPI, Hoechst 137 µm 1 µm
eGFP, FITC, Alexa488 135 µm 1 µm
DsRed (RFP), Cy3, Rhod 132 µm 1 µm
Cy5 128 µm 1 µm
The multiple pinhole concept:
Automatically adjustable pinhole 
in front of each detectors
Optimal 3D colocalization analysis 
(adaptable confocal volumes)
Cortes ópticos em eixo “z”
x y 
“z” 
Tomografia Óptica Seriada
Tomografia Óptica Seriada - Galeria 
Tomografia Óptica Seriada – Projeção
Automatic Z Correction for Z stacks
without
top
bottom
7
0
 µ
m
xz xz
xy (at level of blue line) xy (at level of blue line)
For Z-Stack accquisition
• automatic PMT (gain, 
offset) setting 
adaptation to the z-
position 
• automatic excitation 
(AOTF) setting 
adaptation to the z-
position
Result with Auto Z Corr.:
• homogeneous 
brightness troughout 
the z-stack
• high quality z-stacks 
Detecção de Múltiplas Sondas Fluorescentes 
(Problemas)
Detecção Individualizada
 “Fading”
 Inadequada para espécimes 
vivos
 Inadequada para aquisições 
de imagens cinéticas (“time-
lapse recordering”)
Detecção Simultânea
 “Cross-talking”
FITC / 
Rhod
bovine endothelial cellsFITC Rhod merged
The crosstalk problem
Detecção Simultânea de Múltiplas Sondas 
Fluorescentes: Soluções
 “Multi-tracking”: a partir de motorização completa 
dos elementos presentes no trajeto óptico. 
 “Meta-tracking” (META / Rainbow/ TCS-SP):
Impressão digital da fluorescência
(“fluorescence emission fingerprinting”)
Fast line-wise switching of laser lines and 
intensities 
Fast switching between tracks in line or frame 
mode 
Scanning quasi-simultaneously (in dual 
directional scan)
Better signal with longpass filters (compared to 
bandpass)FITC Rhod merged
Multitracking
Sequential
FITC / 
Rhod
“Multitracking”
META (Zeiss)
Der META-Detektor
Emission Fingerprinting
Emission Fingerprinting
 Separation even of fluorochomes with widely overlapping emission spectra
 Separation of fluorochromes that are excited by the same laser line (in single-photon and 
multiphoton microscopy) 
 Elimination of background- and autofluorescence
 Quantitative imaging of fluorescent spectra shifts (FRET, ion indicators, Kaede)
META detector
Reflective grating for even dispersion
32 detector elements
Simultaneous illumination
Capture full emission spectra
Emission Fingerprinting
Emission Fingerprinting
“Emission Fingerprinting”
Ref: Carl Zeiss Web Site. 
Multiplexing: 3 green dyes unmixed
BODIPY® FL, Alexa Fluor® 514, SYTOX® Green
Vis Range 680nm-380nm = 300nm / 10.5 = 28 colors!
Spectral or Linear Unmixing
UnmixedMixed
Emission Fingerprinting
(Autofluorescence detection)
O Princípio da Microscopia Multifotônica