Prática - Preparação de lâminas e coloração de Gram

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CENTRO UNIVERSITÁRIO DE PATOS DE MINAS
DISCIPLINA: PRÁTICA FUNCIONAIS – MÓDULO 1
PROFa.:NATÁLIA TAFURI E ROSIANE GOMES 
COLORAÇÃO DE GRAM
Colorações simples tornam possível a visualização das bactérias ao microscópio, mas isso não faz distinção entre organismos de morfologia similar. Para tanto, é necessário realizar uma coloração diferencial.
Existem diversos métodos de coloração utilizados para a análise de bactérias. Entre estes, o mais utilizado é a coloração desenvolvida por Christian Gram em 1884. Usando duas sequências de coloração, com diferentes corantes, este método permite a divisão das bactérias em 2 grandes grupos.
O primeiro grupo, que retém a cor do primeiro corante (o cristal violeta), é denominado Gram positivo. O segundo grupo perde a cor do primeiro corante e retém a cor do segundo corante utilizado (fucsina) e é denominado Gram negativo. Uma solução de iodo (lugol) é utilizada como mordente (um composto químico que fixa um corante ou outra substância ao se combinar com o mesmo e formar um composto insolúvel) para a primeira etapa da coloração. Há também um agente descorante entre a utilização de um e outro corantes. Pode-se utilizar diferentes descorantes, de acordo com a velocidade de descoloração desejada. O álcool etílico a 95% é um agente descorante mais devagar, enquanto a acetona agiliza essa etapa. Geralmente utiliza-se uma mistura de álcool etílico e acetona (95:5), obtendo uma velocidade de descoloração intermediária. A maioria dos cocos é Gram positiva com exceção dos gêneros Neisseria e Veillonella que são os únicos Gram negativos.
Assim também acontece com os bacilos, sendo a maioria Gram negativos. Entre os bacilos Gram positivos incluem-se aqueles pertencentes aos gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium. Os víbrios são Gram- negativos.
A investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) das bactérias é etapa inicial de grande importância no isolamento e identificação de bactérias de material clínico bem como de alimentos. No entanto, a identificação completa de uma bactéria sempre necessitará de dados fisiológicos ou genéticos da mesma.
Fundamentação teórica
A coloração de Gram baseia-se na diferença das paredes celulares das diversas bactérias e como estas serão coradas de forma distinta.
As bactérias denominadas Gram negativas possuem uma fina camada de glicoproteína recoberta por uma espessa camada formada principalmente por lipoproteínas e substâncias lipídicas. Já as consideradas Gram positivas possuem uma única e espessa camada de glicoproteína.
Antes de iniciar a coloração, é necessário fazer um esfregaço, ou seja, pegar uma colônia previamente isolada ou uma alçada de uma cultura pura e transferir para uma lâmina limpa. Se for utilizada uma colônia, deve-se adicionar uma gota/alçada de solução salina a 0,9%, homogeneizando-a. É importante que o esfregaço seja bem preparado, para que, ao final da coloração, seja possível a visualização das bactérias. Também é importante não esquecer de fixar o esfregaço na chama do Bico de Bunsen, evitando que a massa de células a ser analisada se perca durante as etapas da coloração.
 Na primeira etapa da coloração, o corante violeta é adicionado sobre o esfregaço. O corante, então, penetra na parede da bactéria, independente se esta é Gram positiva ou Gram negativa.
Ao adicionar o lugol, este se combina com o corante Cristal Violeta, formando um grande complexo, o Cristal Violeta-Iodo (CV-I), fixando o corante na parede a bactéria. O álcool tem papel fundamental neste método. Ao ser adicionado sobre o esfregaço corado com o Cristal violeta vai diferenciar as bactérias:
Gram positivas: com sua parede rica em complexas cadeias de peptidoglicano serão desidratadas, e os poros na parede serão reduzidos, impedindo a saída do complexo CV-I e tornando a parede permanentemente corada de roxo (a cor do complexo CV-I). 
Gram negativas: possuem uma fina camada de peptidoglicano, mas acima desta camada encontra-se uma outra, de caráter lipídico (rica em LPS, lipoproteínas e outros componentes). Essa camada lipídica, em contato com o álcool, dissolve-se, deixando a camada de peptidoglicano desprotegida e permitindo a saída do complexo CV-I, tornando a célula descorada neste momento.
É importante lembrar de lavar a lâmina após a etapa de descoloração, pois se restar algum resíduo de álcool, a próxima etapa não será realizada adequadamente, e os resultados poderão ser alterados.
O esfregaço então é tratado com fucsina, que não terá efeito algum sobre as células Gram positivas, que estão com os poros de sua parede reduzidos; mas penetrará na parede das células Gram negativas, corando-as de vermelho. Esta coloração é utilizada para a maioria das bactérias, mas há algumas que não coram.
Metodologia
	Preparo e fixação do esfregaço
	Etapas
	Observações
	Transferir uma alçada da cultura ou uma colônia da placa para uma lâmina de microscópio limpa.
	Ao fazer o esfregaço a partir de diferentes culturas deve-se observar alguns detalhes:
· - de placa: deve-se coletar apenas 1 colônia, espalhando-a pela lâmina, isso evitará a observação de colônias diferentes na lâmina e que seja coletado um inóculo muito carregado, o que dificultará a visualização das células coradas.
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· - de caldo: deve-se coletar apenas uma alçada e espalhá-la na lâmina, isso evita que seja coletado um inóculo muito carregado.
	Com o auxílio da alça, espalhar a cultura. Se tiver sido colhida colônia da placa, adicionar salina estéril para facilitar o espalhamento.
	
Para o inóculo coletado de caldo não é necessário adicionar solução salina. Mas para colônia coletada de placa é necessário fazer a diluição na lâmina, evitando que o esfregaço fique muito concentrado o que dificulta a visualização das células coradas ao microscópio.
	Passar a lâmina com o esfregaço sobre a chama do Bico de Bunsen, até que este esteja completamente seco.
	É importante fixar o esfregaço para que este não se perca durante as etapas de lavagem entre a utilização de um e outro corante.
	
	Coloração do esfregaço
	Etapas da Coloração
	O que está acontecendo na parede da bactéria?
	Cobrir o esfregaço com solução de Cristal Violeta por cerca de 1 minuto.
	O Cristal Violeta penetra a parede de ambos os tipos de células (Gram + e Gram -)
	A seguir, lavar em água corrente com a pisseta.
	A lavagem com água é importante após cada etapa para que uma substância utilizada não interfira na ação da próxima.
Nesse caso, a lavagem serve para retirar o excesso de corante.
	Cobrir o esfregaço com solução de Lugol fraco por cerca de 1 minuto.
	O Lugol é uma solução de Iodo e funciona como mordente neta etapa da coloração, ou seja, ele fixa o corante Cristal Violeta na parede da célula, pois forma um complexo grande: o CV-I
	Novamente lavar com água, e então lavar com álcool absoluto até que não saia mais corante da lâmina (10 – 15 segundos). Adicionar o corante fuccina.
	A fucsina age de diferentes formas nas diferentes células: e nas Gram +, os poros estão reduzidos, impedindo que a fucsina penetre na parede celular, não alterando a cor roxa:
e nas Gram -, os poros da camada de peptidoglicano estão abertos, permitindo que a fucsina penetre na célula, corando-as de vermelho:
	Lavar com água e secar suavemente com papel.
	Após secar suavemente a lâmina, observar ao microscópio na objetiva de imersão (100x), com óleo de cedro/mineral e identificar a célula corada.
	Para decorar!!!
Vi Lulu Ali A Fumar
(Cristal Violeta) (Lugol) (Álcool) (Água) (Fucsina)
Responda:
1. Em que se baseia o método da coloração de Gram?
2. Por que o álcool é considerado como agente diferenciador da coloração de Gram?
3. Qual é o papel do mordente (lugol)?
4. Descreva passo a passo da coloração de Gram
5. Diferencie as bactérias Gram + de Gram-