Relatório aula prática Microbiologia - Aerobiose, Anaerobiose e coloração de Gram

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UNIVERSIDADE SANTO AMARO – UNISA 
Curso: Ciências Biológicas 
 
 
 
BRUNO FRÕES BERMUDES 
 
 
 
SEMEADURA BACTERIANA - AEROBIOSE E ANAEROBIOSE 
COLORAÇÃO DE GRAM 
RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS – BIOLOGIA DOS 
MICROORGANISMOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
São Paulo 
2018 
 
 
UNIVERSIDADE SANTO AMARO – UNISA 
Curso: Ciências Biológicas 
 
 
BRUNO FRÕES BERMUDES 
 
 
 
SEMEADURA BACTERIANA - AEROBIOSE E ANAEROBIOSE 
COLORAÇÃO DE GRAM 
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA – BIOLOGIA DOS 
MICROORGANISMOS 
 
Relatório de aula prática – Semeadura de 
Bactérias - Aerobiose e Anaerobiose e 
Coloração de Gram - Ciências Biológicas da 
Universidade Santo Amaro, da disciplina 
Biologia dos Microorganismos, sob a 
orientação do Prof. Felipe Scassi Salvador. 
 
 
 
 
São Paulo 
2018 
 
 
SUMÁRIO 
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 4 
2. SEMEADURA – AERÓBIOSE E ANAEROBIOSE .......................................... 6 
2.1. OBJETIVOS ................................................................................................... 6 
2.2. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................. 6 
2.3. RESULTADOS E DISCUSÃO ........................................................................ 8 
2.4. CONCLUSÃO ............................................................................................... 10 
 
3. COLORAÇÃO DE GRAM ................................................................................ 10 
3.1. OBJETIVOS ................................................................................................. 10 
3.2. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 10 
3.3. RESULTADOS E DISCUSÃO ...................................................................... 12 
3.4. CONCLUSÃO ............................................................................................... 14 
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS................................................................ 15 
 
 
 
 
4 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
As bactérias são classificadas como organismos unicelulares procariontes, 
das palavras gregas pro (antes) e karyon (núcleo), ou seja, são organismos simples 
que não possuem núcleo e outras estruturas contidas em membrana. A maioria das 
bactérias possuem além da membrana plasmática, uma parede celular externa 
constituída, principalmente, por peptideoglicano (mureina), que tem como função 
garantir sua proteção e manter a forma das células bacterianas.1 
As bactérias recebem sua classificação conforme sua forma. Cocos são 
esféricos, os Bacilos possuem forma de bastão, os Espirilos formato de espiral e os 
Vibriões em forma de virgula. Os Cocos podem viver isolados ou viver em conjunto, 
sendo chamados de estreptococos ou formando uma massa, chamado de 
estafilococos. A composição da parede celular podem ser classificadas como gram-
positivas e gram-negativas.2 
Figura 01 - Fonte: https://goo.gl/jWnziG 
 
Aerobiose é nome dado quando à presença de oxigênio obrigatório no 
processo de respiração celular. Para ocorrer a liberação e energia, é necessário que 
 
5 
 
a glicose se transforme em dióxido de carbono e água. Todos os seres vivos que 
necessitam de oxigênio para a sua sobrevivência são chamados de organismos 
aeróbicos.3 
Anaerobiose é o nome dado ao processo feito por alguns organismos, no qual, 
não necessitam de oxigênio para realizar a respiração celular, como as bactérias por 
exemplo. Essas bactérias não possuem as enzimas necessárias para realização das 
reações químicas do ciclo de Krebs e cadeia respiratória tornando o oxigênio toxico 
para elas, devido a isso só ocorre a reprodução e crescimento sem a presença desse 
gás. Nesse caso a respiração ocorre através do processo de fermentação, onde a 
glicose é quebrada sem ser consumido o oxigênio do ambiente.4 
A coloração de Gram é utilizada na microbiologia para identificar alguns 
grupos de bactérias. Está técnica foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista 
Holandês Hans Christian Gram, que observou que as bactérias ficavam com cores 
diferentes, ao serem tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificar as 
bactérias em dois grupos distintos: As Gram-positivas que ficavam roxas, e as Gram-
negativas que ficavam vermelhas.5, 6 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
2. SEMEADURA BACTERIANA - AEROBIOSE E ANAEROBIOSE 
 
2.1. OBJETIVOS 
Executar a semeadura em meio sólido e observar o desenvolvimento 
bacteriano em ambiente aeróbico e anaeróbico. 
 
2.2. MATERIAIS E MÉTODOS 
- Placas de Petri com BHI (Brain Heart Infusion); 
- Alça de Níquel-Cromo; 
- Jarra de Anaerobiose; 
- Solução Salina; 
- Bico de Bunsen; 
- Cultura de Bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas 
aeruginosa; 
- Aspergillus niger para controle. 
O experimento foi conduzido no laboratório de microbiologia da Universidade 
Santo Amaro – Unisa. Antes de iniciar a semeadura das bactérias foi necessário a 
preparação da zona de segurança do Bico de Bunsen, essa zona corresponde a uma 
região de aproximadamente 10 cm de raio em torno do bico de Bunsen, pois o ar 
aquecido tende a formar uma corrente no sentido de baixo para cima, evitando que os 
microrganismos que estejam em suspensão no ar contaminem a área. As 
manipulações foram feitas por trás da chama do bico de Bunsen. Logo em seguida a 
alça de Níquel-cromo foi esterilizada na chama do bico de Bunsen em posição vertical 
até o ponto de incandescência (até ficarem rubras), movendo-se rapidamente o 
suporte da alça para dentro da chama (Figura 02), dessa forma alguns centímetros do 
suporte também foram flambados ligeiramente, e depois resfriado da solução salina. 
 
7 
 
Figura 02 - Fonte: https://goo.gl/1PweLq 
As placas de Petri com o BHI foram divididas em três partes iguais, utilizando 
um pincel marcador para fazer as linhas na parte inferior das placas, e nomeando 
cada divisão com o respectivo nome das bactérias utilizadas. Depois, a alça de Níquel-
cromo esterilizada foi passada nas culturas bacterianas, e feito estrias em cada 
divisão respeitando as linhas e utilizando toda a superfície da placa, da melhor 
maneira possível evitando a perfuração do ágar, pois acumula as bactérias e altera as 
condições de crescimento bacteriano. 
Uma das placas de Petri semeada com as bactérias foi colocada dentro da 
Jarra de anaerobiose, junto com outra placa de Petri contendo o fungo Aspergillus 
niger que serviu como indicador do nível de O2 dentro da jarra, o oxigênio foi retirado 
com o auxílio de uma vela acesa dentro da jarra, mantendo apenas o gás carbônico. 
Logo após, o material foi levado para estufa onde foi mantido em período de incubação 
em temperatura de 37ºC por 24 horas (Figura 03). 
Figura 03 - Fonte: https://goo.gl/chtREz 
 
8 
 
2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
 
Após o período de 24 horas de incubação, foi verificado a taxa de crescimento 
das bactérias semeadas nas placas de Petri com BHI nos ambientes anaeróbicos e 
aeróbicos e foi observado os seguintes resultados: 
Em ambiente aeróbico todas as bactérias obtiveram um crescimento 
significativo (Figura 04), isso aconteceu devido o tipo de metabolismo apresentado 
por cada cultura de bactéria. As bactérias Escherichia coli são classificadas como 
Anaeróbicas Facultativas,7 assim como, as bactérias Staphylococcus aureus que 
também são anaeróbicas facultativas.8 Os anaeróbicos facultativos são 
microrganismos que crescem na presençado ar atmosférico, porém, podem também 
crescer na sua ausência. Eles não requerem o O2 para o crescimento, embora possam 
utilizá-los para a produção de energia em suas reações químicas. A cultura das 
bactérias Pseudomonas aeruginosa também apresentou crescimento esperado, já 
que seu metabolismo respiratório é classificado como aeróbico obrigatório.9 
Figura 04 – Crescimento das culturas em ambiente aeróbico. 
 
Em ambiente anaeróbico todas as culturas também obtiveram um crescimento 
significativo (Figura 05). Nas culturas das bactérias Escherichia coli e Staphylococcus 
aureus esse crescimento era o esperado, já que as duas são classificadas como 
anaeróbicas facultativas. Porém, se obteve resultados inesperados no 
 
9 
 
desenvolvimento das bactérias Pseudomonas aeruginosa, já que elas são 
classificadas como aeróbicas obrigatórias, o seu crescimento deveria ser nulo.9 
Também houve crescimento do fungo Aspergillus niger (Figura 06), que foi usado 
como indicador de O2 dentro da jarra de anaerobiose, este tipo de fungo se desenvolve 
apenas em ambientes aeróbicos, já que ele depende do oxigênio no seu metabolismo. 
 
Figura 05 – Crescimento das culturas bacterianas em ambiente anaeróbico. 
 
Figura 06 – crescimento de Aspergillus niger em ambiente anaeróbico. 
 
 
 
 
10 
 
2.4. CONCLUSÃO 
Em ambiente aeróbico todas as culturas de bactérias obtiveram seu 
crescimento esperados na placa de Petri contendo BHI, já que o ambiente possuía as 
características como temperatura e moléculas orgânicas (carboidratos, lipídios e 
proteínas) adequadas para seu desenvolvimento. Porém, em ambiente anaeróbico 
não se obteve os resultados esperados devido ó crescimento das bactérias 
Pseudomonas aeruginosa e dos fungos Aspergillus niger, que só deveriam crescer 
em ambientes aeróbicos. Isso pode ter ocorrido por algum problema com a jarra de 
anaerobiose ou a vela que, talvez não tenha queimado totalmente o oxigênio que 
estava dentro da jarra. 
 
3. COLORAÇÃO DE GRAM 
 
3.1. OBJETIVOS 
Diferenciação de tipos de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas através 
da técnica de coloração de Gram. 
 
3.2. MATERIAIS E MÉTODOS 
- Lâminas contendo cultura de Bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, 
Pseudomonas aeruginosa; 
- Violeta de genciana; 
- Lugol; 
- Álcool-acetona; 
- Fucsina; 
- Água destilada (remoção dos reagentes); 
- Microscópio; 
 
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- Bico de Bunsen; 
- Alça de Níquel-cromo; 
- Óleo de imersão. 
O experimento foi conduzido no laboratório de microbiologia da Universidade 
Santo Amaro – Unisa. Antes de iniciar a semeadura das bactérias foi necessário a 
preparação da zona de segurança do Bico de Bunsen, essa zona corresponde a uma 
região de aproximadamente 10 cm de raio em torno do bico de Bunsen, pois o ar 
aquecido tende a formar uma corrente no sentido de baixo para cima, evitando que os 
microrganismos que estejam em suspensão no ar contaminem a área. As 
manipulações foram feitas por trás da chama do bico de Bunsen. Logo em seguida a 
alça de Níquel-cromo foi esterilizada na chama do bico de Bunsen em posição vertical 
até o ponto de incandescência (até ficarem rubras), movendo-se rapidamente o 
suporte da alça para dentro da chama, dessa forma alguns centímetros do suporte 
também foram flambados ligeiramente, e depois resfriado da solução salina. 
Após a esterilização uma pequena quantidade de cada cultura de bactérias, 
foram colocadas em lâminas e feito um esfregaço ligeiramente para não ficarem muito 
aglomeradas e secados próximo ao bico de Bunsen para uma melhor fixação. Em 
seguida foram seguidos os seguintes procedimento para a coloração de Gram: 
1. O esfregaço foi coberto com o Violeta de genciana por aproximadamente 1 minuto; 
2. O corante foi escorrido e lavado com um filete de água destilada; 
3. A lâmina foi coberta por Lugol e deixado agir por aproximadamente 30 segundos; 
4. O lugol foi escorrido e lavado com um filete de água destilada; 
5. Foi adicionado Álcool-acetona sobre a lâmina para a remoção do corante; 
6. A lâmina foi lavada novamente com água destilada; 
7. A lâmina foi coberta por Fucsina e deixada agir por aproximadamente 30 segundos; 
8. A lâmina foi lavada com água destilada e deixada secar ao ar livre. 
 
12 
 
 Figura 07 – Procedimento de coloração de Gram. 
 
Após os procedimentos de coloração, foi adicionado uma gota de óleo de 
imersão e foram efetuadas as leituras das lâminas no microscópio em objetiva de 
imersão (100x). 
 
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
Após leitura das lâminas no microscópio, os seguintes resultados foram 
observados: 
As bactérias Staphylococcus aureus apresentaram forma esférica com colônias 
em forma de cachos de uva, e coloração roxa indicando que é uma bactéria Gram-
positiva (Figura 08). Isso se dá devido a parede celular possuir muita Mureina, fazendo 
com que o corante inicial (Violeta de genciana) se incorpore na estrutura da parede 
bacteriana.6 
 
13 
 
 
Figura 08 – Staphylococcus aureus Gram-positiva. Fonte: https://goo.gl/bxQpQK 
 
As bactérias Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa apresentaram forma 
de batonete, e coloração vermelhas (Figuras 08 e 09), indicando que são bactérias 
Gram-negativas. Isso ocorre devido suas paredes celulares serem mais finas e 
possuir pouca mureina, dessa forma os corantes iniciais não se fixam na parede, e 
um contra corante utilizado (Fucsina) fixa na parede, e assim mostrando que ela é 
delgada.6 
Figura 08 – Escherichia coli Gram-negativa. Fonte: https://goo.gl/VY6EkD 
 
 
14 
 
 
 
Figura 09 – Pseudomonas aeruginosa Gram-negativa. Fonte: https://goo.gl/B2QesB 
 
3.4. CONCLUSÃO 
 
Com a técnica de coloração de Gram foi possível identificar grupos específicos 
bacterianos através de sua estrutura, e assim sabendo diferencia-las em Gram-
positivas e gram-negativas, além de capacitação necessária para execução correta 
dos procedimentos em laboratório. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
1. SANTOS VS. Bactérias - Mundo Educação [Internet]. [citado 9 de março de 
2018]. Available at: 
http://mundoeducacao.bol.uol.com.br/biologia/bacterias.htm 
2. Gabaldo KA. Reino Monera - Eubactérias e Arqueobactérias - Biologia - 
InfoEscola [Internet]. [citado 9 de março de 2018]. Available at: 
https://www.infoescola.com/biologia/reino-monera/ 
3. ARAGUAIA M. Aerobiose - O que é Aerobiose? - Brasil Escola [Internet]. 
[citado 8 de março de 2018]. Available at: 
http://brasilescola.uol.com.br/biologia/aerobiose.htm 
4. MORAES PL. Anaerobismo. O que é anaerobismo - Brasil Escola [Internet]. 
[citado 8 de março de 2018]. Available at: 
http://brasilescola.uol.com.br/biologia/anaerobismo.htm 
5. NICÉSIO RG. Coloração de Gram - Biomedicina Brasil [Internet]. [citado 18 de 
março de 2018]. Available at: 
http://www.biomedicinabrasil.com/2011/06/coloracao-de-gram.html 
6. CAXIAS M. Coloração de Gram - IBAP Cursos [Internet]. [citado 18 de março 
de 2018]. Available at: https://ibapcursos.com.br/coloracao-de-gram/ 
7. ARAGUAIA M. Escherichia coli. Características da bactéria E. coli - Brasil 
Escola [Internet]. [citado 18 de março de 2018]. Available at: 
https://brasilescola.uol.com.br/biologia/escherichia-coli.htm 
8. MORAES PL. Características da bactéria Staphylococcus aureus. 
Staphylococcus aureus - Brasil Escola [Internet]. [citado 18 de março de 2018]. 
Available at: https://brasilescola.uol.com.br/biologia/staphylococcus-aureus.htm 
9. FIGUEIREDO J. Pseudomonas aeruginosa - Knoow [Internet]. [citado 18 de 
março de 2018]. Available at: 
http://knoow.net/ciencterravida/biologia/pseudomonas-aeruginosa/